Summary
Detta manuskript beskriver en ny direkt växtinfusionsanordning för screening av molekylernas effektivitet mot bakterierna (Candidatus Liberibacter asiaticus) eller dess insektsvektor (Diaphorina citri, Kuwayama) som i kombination är associerade med Huanglongbing citrussjukdom.
Abstract
Att testa funktionen av terapeutiska föreningar i växter är en viktig del av jordbruksforskningen. Blad- och jorddränkningsmetoder är rutinmässiga men har nackdelar, inklusive varierande upptag och miljönedbrytning av testade molekyler. Staminjektion av träd är väletablerad, men de flesta metoder för detta kräver dyr, proprietär utrustning. För att screena olika behandlingar för Huanglongbing behövs en enkel, billig metod för att leverera dessa föreningar till kärlvävnaden hos små växthusodlade citrusträd infekterade med den floembegränsade bakterien Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) eller infekterad med den floemmatande CLas-insektsvektorn Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
För att uppfylla dessa screeningkrav utformades en direkt växtinfusionsanordning (DPI) som ansluts till anläggningens stam. Enheten är tillverkad med ett nylonbaserat 3D-utskriftssystem och lätt åtkomliga hjälpkomponenter. Föreningens upptagseffekt av denna anordning testades i citrusväxter med användning av fluorescerande markören 5,6-karboxifluoresceindiacetat. Enhetlig sammansatt fördelning av markören genom växterna observerades rutinmässigt.
Vidare användes denna anordning för att leverera antimikrobiella och insekticida molekyler för att bestämma deras effekter på CLas respektive D. citri. Aminoglykosidantibiotikumet streptomycin levererades till CLas-infekterade citrusväxter med hjälp av enheten, vilket resulterade i en minskning av CLas-titern från 2 veckor till 4 veckor efter behandlingen. Att leverera neonicotinoidinsekticiden imidakloprid till D. citri-infekterade citrusväxter resulterade i en signifikant ökning av psylliddödligheten efter 7 dagar. Dessa resultat tyder på att denna DPI-enhet representerar ett användbart system för att leverera molekyler till växter för testning och underlätta forskning och screening.
Introduction
Förvaltningen av växter i kommersiella och landskapsinställningar kräver ofta användning av kemiska föreningar för att optimera växttillväxt och hälsa. Hur dessa molekyler levereras beror på typen av molekyl, molekylens funktion, typen av växt och hanteringssystemet på plats. Blad- och jordapplikationer är de enklaste leveransstrategierna, men begränsningar i upptaget av vissa molekyler kräver direkt leverans. Ett exempel på dessa molekyler är terapeutiska molekyler som fungerar bäst när de rör sig systemiskt inom växten men inte kan levereras effektivt genom enkla topiska applikationer1. Detta är fallet med Huanglongbing (HLB), även kallad citrusgrönande sjukdom. HLB är en sjukdom associerad med en floembegränsad bakterie, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), som inte kan odlas utanför växten, eller dess insektsvektor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Om de förmodade terapeutiska molekylerna är genprodukter kan de testas genom att skapa transgena växter som uttrycker dessa föreningar. Transgen växtproduktion kan dock vara tids- och resurskrävande, är mycket genotypberoende och kan hämmas av gendämpning3. Dessutom, även om dessa transgener visar lovande resultat, minskar regleringsmässiga och offentliga uppfattningsbegränsningar sannolikheten för deras kommersiella acceptans 4,5. Den exogena appliceringen av föreningar förenklar emellertid testningen av biologiska och syntetiska molekyler eftersom det inte kräver produktion av stabila eller tillfälligt uttryckande transgena växter, vilket minskar tiden och resurserna för att testa en molekyls effekter. En metod för effektiv och ändamålsenlig systemisk växttillförsel av exogena föreningar skulle kunna användas för en mängd olika forsknings- och screeningändamål.
En av dessa tillämpningar är analys av systemisk molekylrörelse inom en växts kärlsystem, vilket kan göras med hjälp av spårbara markörer, oavsett om de är fluorescerande, synliga eller unika kemiska isotoper 6,7,8,9. En vanlig fluorescerande markör är 5,6-karboxifluorescein-diacetat (CFDA), som är ett membrangenomsläppligt färgämne som bryts ned av intracellulära esteraser till 5,6-karboxifluorescein (CF) och därefter blir fluorescerande och membranogenomträngligt10. CFDA har använts i stor utsträckning för att övervaka floemtransport, sänk- och källrelationer och vaskulaturmönster i växtvävnad11,12.
Förutom dessa markörer kan vissa föreningar direkt förändra växtens fysiologi för att öka produktiviteten eller döda växten när det gäller herbicider. Både insekticider och antimikrobiella föreningar är ett sätt att öka växtproduktiviteten, särskilt i närvaro av HLB. Ett exempel på en antimikrobiell molekyl som används för att kontrollera CLas är streptomycin. Streptomycin är ett aminoglykosidantibiotikum som ursprungligen isolerades från Streptomyces griseus och har visat sig hämma bakterietillväxt genom hämning av proteinbiosyntes13. När det gäller insekticider är huvudmålet för HLB-forskning D. citri, som överför CLas från trädtill träd 14. För detta ändamål används neonicotinoider, såsom imidakloprid, vanligtvis, eftersom de är guldstandarden för bekämpning av skadedjur15. Alla dessa olika användningsområden är viktiga aspekter av nuvarande strategier för växtförvaltning, och utvecklingen av nya produkter är beroende av effektiva screeninganalyser.
En metod som används för införande av föreningar i träiga växter är direkt injektion i stammen. En mängd olika system har utformats som varierar i deras behov av förborrade injektionsställen, och dessa system använder antingen tryckbaserad injektion eller passivt flöde16. Även om tryckbaserade system möjliggör snabb introduktion av en given förening, måste den potentiella fysiska skada som orsakas av att tvinga vätska genom blockerad eller emboliserad vaskulatur beaktas17. Även om applicering av föreningar på blad eller dränk är mindre tidskrävande att genomföra, minskar direkt växtinjektion avfall av föreningen av intresse på grund av förluster i luften eller jorden och kan också förlänga den tid som föreningarna är i ett aktivt tillstånd genom att minska exponeringen för den yttre miljön18. Båda dessa aspekter är viktiga för att bevara dyra reagens och säkerställa konsistens mellan replikat i forskningsinställningar.
Denna studie beskriver design, konstruktion och användning av en innovativ direkt växtinfusionsanordning (DPI), som kan användas för att bedöma hur föreningar av intresse påverkar en värdväxt. En standard 3D-skrivare användes för att tillverka både själva enheten och flera komponenter i samband med dess konstruktion. Denna interna konstruktionsmetod gör det möjligt för forskare att modifiera enheten och enhetskomponenterna baserat på deras specifika experimentella behov och minskar beroendet av kommersiellt tillgängliga växtinjektionsanordningar. Enhetsinstallationen är enkel och effektiv, och alla hjälpkomponenter är lättillgängliga och billiga. Även om systemet utformades för användning med en mängd olika växtarter, avser exemplen som presenteras här krukväxter citrusväxter. Dessutom visar denna studie att denna enhet effektivt kan leverera flera typer av föreningar systemiskt till unga citrusväxter utan att orsaka dödlighet. De testade föreningarna inkluderade CFDA, som användes för att bedöma föreningsfördelningen i växten, och streptomycin och imidakloprid, som användes för att verifiera att de antimikrobiella och insekticida effekterna av dessa föreningar observerades när de levererades via DPI.
Protocol
1. Produktion av citrusväxter för experimentell inblandning
- Föröka små krukväxter citrusträd från antingen rotade vegetativa sticklingar eller frön. Odla citruslinjerna i kruka under en 16 h/8 h ljus/mörk dagslängd och vid 28 °C.
- Välj citrusväxter av lämplig storlek för experimentet. De beskrivna applikationerna krävde att plantorna var mellan 12 cm och 100 cm höga med stamdiametrar på 4-14 mm. Om ny spoltillväxt krävs, skära ner växterna före experimentet.
2. Tredimensionell utskrift av DPI-enheten och formkomponenter
- Applicera ett tunt lager polyvinylacetatbaserat lim på tryckbädden.
- Fyll på nylonfilament i 3D-skrivaren och förbered skrivaren enligt tillverkarens anvisningar. Importera önskad . STL-fil (Kompletterande fil 1, Kompletterande fil 2, Kompletterande fil 3, Kompletterande fil 4, Kompletterande fil 5, Kompletterande fil 6, Kompletterande fil 7, Kompletterande fil 8, Kompletterande fil 9, Kompletterande fil 10, Kompletterande fil 11, Kompletterande fil 12, Kompletterande fil 13 och Kompletterande fil 14), ställa in och börja skriva ut.
- Ta bort biten från tryckbädden. Skölj det polyvinylacetatbaserade limet från basen av den tryckta komponenten med vatten och ta bort eventuella stödstrukturer.
- Spraya DPI-komponenten med två lager klarglans sprayfärg.
3. Tillverkning av plastisolringformen
- Montera en formform som är tillräckligt stor för att hålla mönsterbitarna genom att bygga ett rektangulärt hölje med hjälp av snäppbara plastblock på en bas (kompletterande figur S1A).
- Blanda RTV-silikonmonomeren och katalysatorn i förhållandet 10: 1 och rör om utan att införa bubblor i 1 minut. Färg genom tillsats av karamellfärg (3 droppar/25 ml silikonblandning) och handtvål (1 ml tvål/25 ml silikonblandning) (kompletterande figur S1B).
- Häll ett tunt lager silikon i formformen som är tillräckligt för att helt täcka botten. Tampa för att platta till ytan och vänta 24 timmar tills silikonet stelnar (kompletterande figur S1C).
- Häll ett andra lager silikon, som beskrivits ovan, som är tillräckligt djupt för att täcka mitthålets kärntryck på mönstret (synligt högst upp i mönstret i kompletterande figur S1D). Sätt in mönstret i det flytande silikonet med mitthålets kärntryck nedåt. Se till att inga bubblor fångas och att mönstren är väl åtskilda och inte vidrör (kompletterande figur S1E).
- Säkra mönstren med antingen ett tungt föremål och/eller tejp för att förhindra att de flyter ut ur silikonet medan det stelnar. Vänta 24 timmar tills det nyhällda skiktet stelnar (kompletterande figur S1F).
- Häll ytterligare lager silikon tills nivån är i linje med toppen av mönstret. Vänta 24 timmar för att härda (kompletterande figur S1G).
- Demontera de snäppbara plastblocken för att frigöra formen. Ta bort mönstren (kompletterande figur S1H). Kontrollera formen för tårar eller missbildningar (kompletterande figur S1I).
4. Gjutning av plastisolringarna
- Belägg formens inre, alla kärnkomponenter och O-ringarna med matolja (kompletterande figur S2A, B). Placera en O-ring runt skåran i mitten av mittstolpkärnan och placera kärnan i plastisolringformens mitthål (kompletterande figur S2C).
- Sätt in leveranskanalkärnan i hålet på sidan av plastisolringformen. Rikta in den V-formade spetsen i slutet av leveranskanalkärnan för att anpassa den till O-ringen på mittstolpens kärna (kompletterande figur S2D,E).
- Värm plastisol i mikrovågsugnen för korta 10 s skurar (kompletterande figur S2F, G). Rör plastisol försiktigt för att undvika bubblor (kompletterande figur S2H). Upprepa uppvärmningen och omrörningen tills lösningen uppnår en temperatur mellan 160 °C och 170 °C (kompletterande figur S2I).
VARNING: Överhettning av plastisol kan leda till utsläpp av giftiga ångor. Utför proceduren i ett välventilerat område eller dragskåp. Värm inte plastisolen över 170 °C. - Häll den smälta plastisolen i plastisolringformen nära formens ytterkant utan att införa bubblor (kompletterande figur S2J). Vänta 1 timme tills plastisolringarna har svalnat (kompletterande figur S2K). Ta bort ringarna från formen. Se till att den passar korrekt med DPI-enheten före användning i experimentella analyser (kompletterande figur S2L).
5. Anslutning av DPI-enheten till anläggningen
- Hitta en smidig, hälsosam plats på bagageutrymmet för enhetens tillbehör. Undvik stötar eller knutar, eftersom dessa kan bidra till enhetsläckage.
- Använd en borrkrona med en diameter på 2 mm för att borra ett hål horisontellt genom skaftets mitt i 90° vinkel mot stamytan (kompletterande figur S3A). Kör borrkronan genom hålet flera gånger för att rengöra och släta ut den för att skapa ett fritt hål (kompletterande figur S3B).
- Skapa en vertikal skiva i plastisolringen på motsatt sida av den sammansatta leveranskanalen (kompletterande figur S3C). Montera ringen runt anläggningen och rikta leveranskanalen upp med det tidigare borrade hålet (kompletterande figur S3D).
OBS: Ringen måste passa tätt runt bagageutrymmet för att undvika läckage; Kärnaggregat med olika diametrar kan användas för att göra plastisolringar för växtstammar av olika storlek. - Lägg till DPI-enheten i plastisolringen och se till att de sitter tätt ihop. Rikta in DPI-enhetens pip mot plastisolringens tillförselkanal och borrade hål (kompletterande figur S3E).
OBS: Att använda en borr för att ställa in hålet och DPI-enhetens pip kan vara till hjälp. - Linda tätt med silikontejp för att hålla apparaten på plats (kompletterande figur S3F). Kontrollera den helt monterade och anslutna enheten för att säkerställa korrekt inriktning och orientering på anläggningen.
6. Tillämpa föreningen av intresse med hjälp av DPI-enheten
- Använd en spruta eller pipett för att fylla DPI-enheten med lösningen av intresse (kompletterande figur S3G). Använd en spruta för att tränga igenom silikontejpen och plastisolringen på motsatt sida av DPI-enheten för att dra ut luft ur den inre kanalen och undvika införande av luftbubblor i växtens kärl (kompletterande figur S3H). Byt tillbaka alla extraherade föreningar till DPI-enheten.
- Lägg till ytterligare en liten lapp silikontejp över hålet som skapas av sprutan för att förstärka området och förhindra tårar. Kontrollera apparaten för synliga läckage vid fästpunkten och inspektera enhetens behållare för en stabil vätskenivå.
OBS: Vatten kan initialt användas för att testa för läckor för att undvika slöseri med testlösning. - Täck den öppna änden av DPI-enheten med vaxtätningsfilm och dra ner för att bilda en tätning och minska avdunstningen av experimentföreningen. Peta ett enda hål i vaxfilmen med en sprutspets för att förhindra utveckling av vakuum och fyll sedan på enheten igen (kompletterande figur S3I).
- Kontrollera apparaten dagligen för att säkerställa korrekt inriktning av komponenterna (kompletterande figur S3J) och fyll på vätskan med en spruta för att undvika att behållaren sinar. Upprepa denna process tills önskad mängd experimentell lösning har införts.
OBS: Föreningar kan framgångsrikt introduceras från en given enhet i upp till 1 månad. Lösningsupptagningstider som överskrider denna tidsram bör testas empiriskt före experimentuppställningen.
7. Använda CFDA för att observera vaskulär rörelse med citrusväxter
- Fäst DPI-enheten på 25 cm höga citronväxter (Citrus medica L.), applicera en enda 2,0 ml behandling av antingen 20% DMSO iH2O-kontrolleller CFDA på DPI-enheten och låt den ta upp i 24 timmar. För att följa detta protokoll, förbered den fungerande CFDA-lösningen genom att tillsätta 1,6 mlH2Otill 400 μL CFDA-stamlösning (stamlösningen innehåller 10 mM CFDA upplöst i 100% dimetylsulfoxid [DMSO]) för att generera en slutlig CFDA-koncentration på 2 mM och 20% DMSO.
- Gör tvärsnitt av olika vävnader i växten och använd ett stereoskop eller sammansatt mikroskop med ett fluorescerande filter som inkluderar 498 nm våglängd för att visualisera CFDA i växtvävnaderna. Jämför bilderna med 20% DMSO iH2O-kontrollernaför att ta hänsyn till autofluorescens i vävnaden.
8. Mätning av förändringar i CLas-titern i bladprover efter streptomycinbehandling
- Använd 0,75 m höga växthusodlade CLas-infekterade Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") växter, samla petiole och midrib av två HLB-symptomatiska blad från varje växt, hugga dem i små sektioner, samla varje vävnadstyp och förvara dem separat i 2 ml slagfasta provrör som innehåller en stålkula med 6,35 mm i diameter.
- Mal provet med en homogenisator programmerad för två 15 s-cykler vid 3,4 m/s. Extrahera den totala nukleinsyran enligt beskrivningen tidigare19.
- Utför qPCR på CLas-infekterade bladprover med den qPCR-blandning som definieras i tabell 1 och de reaktionsbetingelser som definieras i tabell 2. Använd växter som visar robusta CLas-infektioner (robust infektion definieras vanligtvis som qPCR-baserade Ct-värden < 30 för CLas 16S LasLong (LL) primerset) för vidare analys.
OBS: Bakterietitern uppskattas med hjälp av CLas 16S Las Long (LL) och citrusdehydrin DNA-primrar för att uppskatta de relativa genomekvivalenterna, som beskrivits tidigare20. - Utrusta citrusplantorna som uppfyller den minsta infektionstiter som beskrivs ovan med DPI-enheter och utsätt dem för en engångsbehandling av 2,0 ml av antingenH2O-lösningeller streptomycinlösning vid önskad koncentration. För att följa denna studie, använd en enda 2,0 ml behandling av 9,5 mg / ml (19 mg totalt) streptomycin upplöst iH2O.
- Samla bladprover 7 dagar, 14 dagar och 28 dagar efter behandling. Analysera de provtagna bladen för CLas-titern med samma protokoll som beskrivits ovan.
- Vid 60 dagar efter behandlingen, få fotografier av de växter som behandlats medH2Oeller streptomycin. Använd visuella observationer av CLas-infektionen för att poängsätta infektionens svårighetsgrad. Leta efter <50% av bladen som visar interveinal kloros och venkorkning tillsammans med bladspolningstillväxt som tecken på mild infektion och mer än 50% av bladen med interveinal kloros och venkorkning samt bladabscission och stunting av växttillväxten som tecken på allvarligare infektioner.
9. Mätning av dödligheten av D. citri efter behandling med imidakloprid
- Beskär 0,5 m långa citronväxter (Citrus medica L.) till en höjd av 12 cm för att uppmuntra tillväxten av ny spolning.
OBS: Spoltillväxtens hastighet kan vara beroende av växthälsan och årstiden; Så ta hänsyn till detta under experimentell design. - Efter >6 spolning, 1-2 cm lång, har utvecklats, introducera växterna i burar som innehåller vuxna D. citri. Lämna plantorna i burarna i 24 timmar för att möjliggöra avsättning av ägg.
- Utför representativa äggräkningar på tre spolskott 1-2 dagar efter läggning och applicera därefter DPI-enheterna. Fyll dessa enheter med 2,0 ml av antingen en vattenkontroll eller den önskade koncentrationen av imidakloprid (21,8% aktiv ingrediens). För att följa detta protokoll, använd 528 μL / L, 52,8 μL / L och 5,28 μL / L imidakloprid.
OBS: Äggräkningar är en destruktiv åtgärd, så räkningarna i detta skede används för att uppskatta antalet ägg på den oräknade spolningen av samma växt och hjälper till att ge en baslinje för de efterföljande nymfuppkomsträkningarna som utförs i slutet av experimentet. - Samla D. citri-uppkomsthastigheten på minst tre av de återstående spolskotten . Skaffa representativa växtfotografier 7 dagar efter sammansatt introduktion.
Representative Results
Komponenter för direktinfusionsanordning
Basversionen av direktinfusionsanordningen är 8 cm lång och 3,3 cm bred framtill och på sidan (figur 1A). Den innehåller en enda central behållare som gränsar till pipen, och den totala volymen som kan finnas i dessa komponenter är 2,0 ml (figur 1D). Plastisolringen är 1,8 cm lång och har en diameter på 2,7 cm (figur 1C). Denna ring innehåller också två kanaler: en för att rymma DPI-pipen och en annan med variabel diameter som passar runt stammen på trädet som behandlas. Dessutom finns det ett spår runt den vertikala kanalen för att rikta överbehandling för att omge trädet, vilket möjliggör ytterligare sammansatt upptag genom barken (figur 1F). När plastisolringen är korrekt monterad ska den vara i jämnhöjd med DPI-enheten och pipen ska ligga i linje med hålet som borrats i trädet (figur 1B och figur 1E).
CFDA
För att undersöka effektiviteten hos DPI-enheten för införande av exogena kemikalier i citrusväxter infiltrerades 2,0 ml 2 mM CFDA med hjälp av enheten. En fluorescenssignal detekterades i kärlen hos den behandlade växten (figur 2A) men saknades i kontrollanläggningarna som behandlades med 20% DMSO i H2O (figur 2B). Denna signal observerades i alla dissekerade växtvävnadstyper, inklusive bladmesofyll, petiole vaskulatur, stamvaskulatur och rotvaskulatur (figur 2C). Denna signal observerades i växten inom 24 timmar efter behandling och fördelades relativt jämnt över vävnaderna.
Streptomycin
För att testa om de införda föreningarna hade en terapeutisk effekt på HLB-sjukdomen infördes 2,0 ml av en bakteriedödande förening, streptomycin, i CLas-positiva Valencia (Citrus sinensis) söta apelsinväxter i en koncentration av 9,5 mg / ml (totalt 19 mg). Dessa växter hölls i växthuskrukor, och CLas-titern (mätt med CLas-genomekvivalenter per citrusgenomekvivalenter) övervakades över tid med qPCR (figur 3A). De initiala genomsnittliga DNA CLas-titrarna för streptomycin- ochH2 O-behandlade växter var 0,562 CLas genom/citrusgenom respektive 0,49 CLas genom/citrusgenom. Minskningar av den genomsnittliga bakteriella titern detekterades med qPCR 7-28 dagar efter streptomycinbehandling jämfört medH2O-kontrollernavid samma tidpunkt. Dessutom var skillnaden mellan tiden 0 och dag 28 genomsnittliga bakterietitrar 0,314 och 0,117 för streptomycinbehandlade växter respektiveH2O-behandlade växter.
Detta experiment var utformat för att mäta växtens svar på olika behandlingar under olika tidsperioder. En tvåfaktors kvadratisk responsytdesign användes, med tid behandlad som en kvantitativ diskret faktor med fyra nivåer (0 dagar, 7 dagar, 14 dagar och 28 dagar) och behandling som en kategorisk faktor med två nivåer (H2Ooch streptomycin). Fem replikat användes för var och en av de åtta behandlingskombinationerna, och CLas-titern mättes som responsvariabeln. Data transformerades med hjälp av logg10 baserat på en Box-Cox-diagramanalys. Modellreduktion utfördes genom framåtval med hjälp av Akaikes informationskriterium (AICc)21, vilket resulterade i att både tids- och interaktionseffekterna togs bort. Den återstående faktorn, behandling, var signifikant (p = 0,0252), med streptomycinbehandlade växter som visade en lägre genomsnittlig CLas-titer (0,349) änH2O-behandlade växter (0,496) över alla tidpunkter tillsammans (figur 3B). Denna minskning av CLas-titer motsvarade tillfälliga ökningar av ny hälsosam spoltillväxt efter 60 dagar i de streptomycinbehandlade växterna, vilket framgår av fotografier av representativa träd behandlade medH2O(figur 3C) jämfört med 19 mg streptomycin (figur 3D).
Imidakloprid
Imidakloprid introducerades i unga asiatiska citruspsyllid (ACP)-infekterade citronväxter med hjälp av DPI-enheten för att testa dess potential som en D. citri insekticid screeninganalys. En enda 2,0 ml behandling av en kommersiell insekticidlösning för imidakloprid testades vid tre olika koncentrationer (5,28 μl / L, 52,8 μL / L och 528 μL / L), tillsammans med en vattenkontroll. Det genomsnittliga totala äggantalet per tre spolskott före behandling varierade från 280,5 till 321, och det fanns inga signifikanta skillnader mellan de växter som skulle användas för varje behandlingsgrupp (figur 4A). De genomsnittliga totala överlevande nymferna på tre spolskott 7 dagar efter behandlingen var 293,75, 268, 97,5 och 2 för vattenkontrollen och 5,28 μL / L, 52,8 μL / L respektive 528 μL / L imidaklopridlösningar (figur 4B). Detta representerade en signifikant minskning av uppkomsten av psyllidnymf vid 52,8 μL/L (p = 0,029) och 528 μL/L (p = 0,002) imidaklopridlösningsnivåer jämfört med vattenkontrollen enligt en enkelriktad ANOVA följt av en Tukeys post-hoc-analys. Dessutom var denna ökning av psyllidnymfdödligheten vid den högsta lösningsnivån för imidakloprid visuellt uppenbar genom minskningen av nymfhonungsdaggproduktionen på de imidaklopridbehandlade linjerna (figur 4D) jämfört med vattenkontrollen (figur 4C).
Figur 1: Den direkta växtinfusionsanordningen och plastisolringen. (A) Den intakta direkta infusionsanordningen för växten och (C) plastisolringen tillsammans med deras dimensioner. (B) Den direkta växtinfusionsanordningen och plastisolringen ansluten och fäst vid ett citrusträd. Vertikala tvärsnitt av (D) direkt växtinfusionsanordning, (F) plastisolring och (E) dessa två komponenter anslutna och fästa vid ett citrusträd. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tvärsnitt av bladmittribben på en 25 cm citrusväxt. Bilder som visar 24 timmar efter behandling med (A) 2 mM CFDA eller (B) 20% DMSO iH2Omed hjälp av den direkta växtinfusionsanordningen. (C) Tvärsnitt av olika växtvävnader 24 timmar efter 2 mM CFDA-behandling, inklusive stammen 5 cm ovanför den direkta växtinfusionsanordningen (överst till vänster), stammen 5 cm under den direkta växtinfusionsanordningen (mitten till vänster), roten (nedre vänstra), bladbladet (övre högra), bladbladet (mitten till höger) och bladmesofyllen (nedre högra). Skalstänger = 1 mm. Förkortningar: CFDA = 5,6-karboxifluoresceindiacetat; DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Övervakning av CLas-titern (mätt med CLas-genomekvivalenter per citrusgenomekvivalenter) över tid med qPCR . (A) Tidsförlopp som visar förändringar i CLas DNA-titer som jämför de fem plantor som behandlats med 19 mg streptomycin med de fem plantor som behandlats med enH2O-kontroll. Poängen representerar genomsnittet för en given behandling vid en given tidpunkt. Felstaplarna representerar medelvärdets standardfel. (B) Stapeldiagram som visar genomsnittlig CLas-titer förH2O- och streptomycinbehandlade växter över alla tidpunkter. Felstaplarna representerar 95% konfidensintervall och asteriskerna anger signifikanta skillnader (* = p < 0,05) mellan de genomsnittliga CLas-titrarna för streptomycin- ochH2O-behandlade växter enligt en enkelriktad ANOVA. C) Representativa bilder av citrusplantor 0 månader och 2 månader efter direkt infusionsbehandling med antingen (C)H2Oeller (D) streptomycin. Växterna behandlade med streptomycin visar ny ljusgrön bladspolningstillväxt efter 2 månader, vilket tyder på en minskning av CLas-titern. Förkortning: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Övervakning av dödligheten i psyllidnymfen hos unga AVS-angripna citronväxter. Stapeldiagram som visar (A) det uppskattade antalet initiala ägg och (B) de överlevande D. citri-nymferna på tre citrusspolningar 7 dagar efter behandling med vattenkontroll och olika utspädningar av imidakloprid. Felstaplarna representerar medelvärdets standardfel och asteriskerna anger signifikanta skillnader (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) mellan en given behandlingsnivå och vattenkontrollen enligt en enkelriktad ANOVA följt av en Tukeys post-hoc-analys. Bilder av D. citri nymfangripen citrusspolning 7 dagar efter behandling med antingen (C) vattenkontrollen eller (D) 528 μl/L imidakloprid med hjälp av den direkta växtinfusionsanordningen. Förkortningar: ACP = asiatisk citruspsyllid; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Volym per prov (μL) | Komponent | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR med BRYT Green Dye Master Mix | |||||
| 5 | DNA-mall (20 ng/μl) | |||||
| 0.5 | 10 μM Primer F och R för CLas | Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (framåt); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (omvänd) |
||||
| 0.5 | 10 μM Primer F och R för Citrus hushållning | Citrusdehydrin: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (framåt). AAAACTTCACCGATCCACCAG (omvänd) |
||||
| 6.5 | H2O | |||||
Tabell 1: Den qPCR-blandning som används för att kvantifiera CLas-titern i streptomycinbehandlade citruslinjer. Sekvensen av 16S Las Long-primrar och citrusdehydrinprimrar för CLas DNA-kvantifiering och citrus-DNA-kvantifiering visas.
| Steg | Temperatur (°C) | Tid | |
| 1 | Inledande denaturering | 95 | 2 minuter |
| 2 | Denaturera | 95 | 15 Sekunder |
| 3 | Glödgning | 60 | 20 sekunder |
| 4 | Förlängning | 72 | 20 sekunder |
| 5 | Gå till steg 2, upprepa 39x | ||
| 6 | Smält kurva | 60 rampning till 95 vid 0,2 °C/s | 3 minuter |
Tabell 2: Reaktionsbetingelser för qPCR som används för att kvantifiera CLas-titern i streptomycinbehandlade citruslinjer.
Kompletterande figur S1: Bilder som visar monteringsprocessen för formen för att generera plastisolringen. (A) Snäppbara plastblock användes för att generera det första lagret av plastisolringformen. (B) Enhetligt blandad lösning innehållande silikon RTV-gummi, katalysator, livsmedelsfärg och tvål. (C) Jämnt hällt första lagret av plastisolringformen. (D) Bild av plastisolringmönstren med mitttrycket högst upp. (E) Plastisolringmönster införda i det ohärdade andra lagret av formen. (F) Maskeringstejp och gummiklubba som används för att säkra mönstren när det andra lagret härdar. (G) Tredje lagret av formen tillsätts tills det är i jämnhöjd med toppen av mönstren. (H) Ta bort mönstren från formen. (I) Fullt konstruerad plastisolringform. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Bilder som visar monteringsprocessen för plastisolringen associerad med den direkta växtinfusionsanordningen. (A) Plastisolringmonteringskomponenter, inklusive formen, mittkärnan med en O-ring och leveranskanalkärnan. (B) Belägga kärnorna i non-stick spray matolja för att underlätta avlägsnandet av plastisolringen efter härdning. (C) Insättning av mittkärnan och O-ringen i formen. (D) Insättning av leveranskanalkärnan vinkelrätt mot mittkärnan. (E) Korrekt montering av plastisolringkärnkomponenterna i formhålan. F) Plastisol som används för generering av plastisolringen. (G) Uppvärmning av plastisolen i mikrovågsugnen. H) Omrörning av plastisolen efter upphettning. (I) Kontrollera plastisoltemperaturen. (J) Hälla den uppvärmda plastisolen i den sammansatta kärnan. (K) Möjliggör kylning av plastisolen runt den monterade kärnan. (L) Helt monterade plastisolringar fästa vid den direkta växtinfusionsanordningen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Bilder som visar monteringsprocessen för den direkta växtinfusionsanordningen. (A) Borrning av ett hål genom mitten av citrusplantan för att skapa en kanal för sammansatt leverans. (B) Frontvy av det borrade hålet. (C) Skär genom plastisolringen med ett rakblad mittemot den sammansatta leveranskanalen. (D) Montera plastisolringen tätt runt skaftet på platsen för det tidigare borrade hålet. (E) Montering av den direkta växtinfusionsanordningen på plastisolringen, med sammansatt tillförseltapp på enheten insatt i plastisolringens kanal. (F) Använd silikontejp för att fästa den direkta infusionsanordningen på plastisolringen och håll hela apparaten på plats. (G) Fyllning av den direkta anläggningen infusionsanordning kammare med föreningen av intresse. (H) Använd en spruta för att dra luft från det borrade hålet i anläggningen och starta flödet av föreningen. (I) Applicera vaxförseglingsfilm på öppningen i den direkta växtinfusionsanordningens kammare och sticka ett hål för att förhindra vakuum. J) Fullständigt monterad direkt växtinfusionsanordning på en citrusväxt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: Plastisolringens mittkärna . STL-fil för ett 4 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Plastisolringens mittkärna . STL-fil för ett 6 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Plastisolringens mittkärna . STL-fil för ett 8 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: Plastisolringens mittkärna . STL-fil för ett 10 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 5: Plastisolringens mittkärna . STL-fil för ett 12 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 6: Plastisolringens mittkärna . STL-fil för ett 14 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 7: Plastisolringens leveranskanalkärna. STL-fil för ett 4 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 8: Plastisolringens leveranskanalkärna . STL-fil för ett 6 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 9: Plastisolringens leveranskanalkärna . STL-fil för ett 8 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 10: Plastisolringens leveranskanalkärna. STL-fil för ett 10 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 11: Plastisolringens leveranskanalkärna . STL-fil för ett 12 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 12: Plastisolringens leveranskanalkärna . STL-fil för ett 14 mm träd. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 13: Den direkta växtinfusionsanordningen . STL-filen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 14: Mönstret som används för att skapa formen för plastisolringen. STL-filen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
För att DPI-produkten ska anses vara en livskraftig metod för tillförsel av exogena föreningar till växter måste den bidra till ett robust och konsekvent upptag av föreningar i en mängd olika vävnadstyper. Experimentet med CFDA visade tydligt både akropetal och basipetal föreningsrörelse, liksom i både kärlsystemet och mesofyllcellerna i bladet. Dessutom, och förmodligen eftersom det borrade hålet som används i denna DPI-enhet ger en stor mängd yta för sammansatt upptag, var CFDA närvarande i relativt lika stora mängder i alla delar av stammen, inte bara i en liten delmängd av vaskulaturen intill enheten, vilket har setts i tidigare färgupptagningsstudier i växter som använder staminjektion6. Dessutom testades leveransen av grönt fluorescerande protein och blommigt färgämne med användning av DPI-enheten, och en fördelning av dessa föreningar som liknar CFDA observerades (data visas inte). Dessa data tyder på att enheten kan användas för att systemiskt leverera en mängd olika föreningar som varierar i storlek och molekylstruktur. Det är dock värt att notera att det fanns skillnader i föreningens upptag baserat på bladutvecklingsstadiet, med yngre utvecklande löv som tog upp mer förening än äldre etablerade löv. Detta kan bero på förändringarna i vaskulaturegenskaperna som finns i diskbänken kontra källvävnad och bör optimeras för ett givet experiment.
DPI-enheten visade tillräckligt sammansatt upptag för visualisering av CFDA, GFP och blommigt färgämne, och det tog också tillräckligt för att visa de antibakteriella och insekticida effekterna av streptomycin respektive imidakloprid. Båda dessa föreningar resulterade i förändringar i målorganismens livskraft 1 vecka efter en enda 2,0 ml behandling. Dessa data tyder på att DPI-enheten skulle kunna användas i helväxtanalyser för att testa livskraften hos en mängd olika föreningar för bekämpning av mikrobiella och skadliga skadedjur. Dessutom, på grund av dess direkta kontakt med kärlsystemet, kan denna anordning till och med ge möjlighet att testa föreningar som inte effektivt tas upp av rötterna eller epidermala celler. Av särskilt intresse skulle vara RNA-interferens (RNAi), eftersom detta kan användas för att modulera genuttrycket inom värdväxten, patogenen eller patogenvektorn. Tidigare forskning som introducerade hårnåls-RNA genom ett borrat hål i stammen på äppel- och druvplantor visade att RNA-molekylerna var begränsade till xylemvävnaden, vilket tyder på att dessa molekyler endast kan vara effektiva mot tugg- och xylemsaftmatande organismer22. Med tanke på att DPI-enheten använder ett liknande borrhålsleveranssystem, är det självklart att hårnåls-RNA som levereras med denna enhet också kan begränsas till xylemvävnaden. Den observerade minskningen av titern av den floembegränsade CLas efter streptomycinbehandling från DPI-enheten tyder emellertid starkt på att detta antibiotikum var närvarande i floemet. Därför är det troligt att den vaskulära fördelningen av de föreningar som levereras med användning av DPI-enheten är beroende av deras storlek och kemi, och varje molekyl bör utvärderas individuellt.
Även om det finns ett antal kommersiellt tillgängliga DPI-enheter tillgängliga på marknaden, kan enheten som beskrivs här tillverkas internt och kan modifieras. På detta sätt kan förbättringar och storleksförändringar göras baserat på växtarter och experimentell design som används, och det är inte beroende av kommersiella produkter. Dessutom är anordningen semi-permanent fäst vid växten, vilket innebär att flera behandlingar av en given förening kan utföras samtidigt utan att behöva skada växten med flera sammansatta injektioner. På en försiktighetsanmärkning kan enheten läcka om den inte är korrekt installerad. Som ett resultat går föreningen förlorad för miljön istället för att levereras till anläggningen. Därför bör man vara noga med att inspektera enheten för tecken på läckage under installationen och de första dagarna efteråt. Även om borrning av ett hål i trädet är potentiellt skadligt, valdes denna metod för att säkerställa robust och konsekvent sammansatt upptag. Dessutom sågs inga negativa effekter på växthälsan från fastsättningen av DPI-enheten i dessa experiment. Extra växter bör dock inkluderas i experimentdesignen för att ersätta de som kan förlora kraft under ett givet experiment. Slutligen, eftersom denna anordning använder passivt flöde för att införa föreningar, kan det vara svårt att förutsäga upptagshastigheten över olika växtarter eller utvecklingsstadier av samma art. Detta kan komplicera experiment om föreningens upptagshastighet är en begränsande faktor. För bästa resultat bör experiment planeras så att tillräcklig tid ges för att växten helt ska absorbera 2,5 ml förening, vilket kan ta upp till 1 vecka. Sammanfattningsvis är denna DPI-anordning ett effektivt verktyg för snabb utvärdering av den in planta-aktiviteten hos antimikrobiella eller insekticida föreningar mot CLas och dess vektor, D. citri, vilket ger mer information om systemisk effektivitet och påverkan på växtprestanda än den tidigare presenterade fristående bladanalysen23. Utan tvekan når mångfalden av applikationer för detta system långt utöver de specifika användningsområden som beskrivs i denna studie.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter. Användningen av handels-, firma- eller företagsnamn i denna publikation är för information och bekvämlighet för läsaren. Sådan användning utgör inte ett officiellt godkännande eller godkännande av United States Department of Agriculture eller Agricultural Research Service av någon produkt eller tjänst med uteslutande av andra som kan vara lämpliga. U.S. Department of Agriculture (USDA) förbjuder diskriminering i alla sina program och aktiviteter på grund av ras, färg, nationellt ursprung, ålder, funktionshinder och i förekommande fall kön, civilstånd, familjestatus, föräldrastatus, religion, sexuell läggning, genetisk information, politisk övertygelse, repressalier eller eftersom hela eller delar av en individs inkomst härrör från något offentligt biståndsprogram. Inte alla förbjudna baser gäller för alla program. Personer med funktionsnedsättning som behöver alternativa medel för kommunikation av programinformation (punktskrift, stor stil, ljudband etc.) bör kontakta USDA: s TARGET Center på (202) 720-2600 (röst och TDD). För att lämna in ett klagomål om diskriminering, skriv till USDA, Director, Office of Civil Rights, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410, eller ring (800) 795-3272 (röst) eller (202) 720-6382 (TDD). USDA är en leverantör och arbetsgivare för lika möjligheter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Mant Acon för de växter som används i denna studie. Finansieringen tillhandahölls av US Department of Agriculture (USDA) CRIS-projekt 8062-22410-007-000-D och USDA NIFA-bidrag 2020-70029-33176.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
- Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
- Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
- Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
- Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
- Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
- Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
- Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
- Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
- Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
- Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
- Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
- Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
- Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
- Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
- Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
- Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
- Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
- Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
- Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
- Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
- Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).
