Summary
Este manuscrito descreve um novo dispositivo de infusão direta de plantas para triagem da eficácia de moléculas contra a bactéria (Candidatus Liberibacter asiaticus) ou seu inseto vetor (Diaphorina citri, Kuwayama) que, em combinação, estão associadas à doença dos citros de Huanglongbing.
Abstract
Testar a função de compostos terapêuticos em plantas é um componente importante da pesquisa agrícola. Os métodos foliar e solo-drench são rotineiros, mas têm desvantagens, incluindo absorção variável e a degradação ambiental das moléculas testadas. A injeção de troncos de árvores está bem estabelecida, mas a maioria dos métodos para isso requer equipamentos caros e proprietários. Para selecionar vários tratamentos para Huanglongbing, um método simples e de baixo custo para entregar esses compostos ao tecido vascular de pequenas árvores cítricas cultivadas em estufa infectadas com a bactéria limitada a floema Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ou infestadas com o inseto vetor CLas Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) é necessário.
Para atender a esses requisitos de triagem, foi projetado um dispositivo de infusão direta da planta (DPI) que se conecta ao tronco da planta. O dispositivo é feito usando um sistema de impressão 3D baseado em nylon e componentes auxiliares de fácil obtenção. A eficácia de absorção de compostos deste dispositivo foi testada em plantas cítricas utilizando o marcador fluorescente 5,6-carboxifluoresceína-diacetato. A distribuição uniforme dos compostos do marcador ao longo das plantas foi rotineiramente observada.
Além disso, este dispositivo foi usado para fornecer moléculas antimicrobianas e inseticidas para determinar seus efeitos sobre CLas e D. citri , respectivamente. O antibiótico aminoglicosídeo estreptomicina foi liberado em plantas cítricas infectadas com CLas usando o dispositivo, o que resultou em uma redução no título de CLas de 2 semanas para 4 semanas após o tratamento. A entrega do inseticida neonicotinóide imidaclopride em plantas cítricas infestadas por D. citri resultou em um aumento significativo na mortalidade de psilídeos após 7 dias. Estes resultados sugerem que este dispositivo de DPI representa um sistema útil para a entrega de moléculas em plantas para testes e facilitar a pesquisa e fins de triagem.
Introduction
O manejo de plantas em ambientes comerciais e paisagísticos muitas vezes requer o uso de compostos químicos para otimizar o crescimento e a saúde das plantas. Como essas moléculas são entregues depende do tipo de molécula, a função da molécula, o tipo de planta e o sistema de manejo em vigor. Aplicações foliares e de solo são as estratégias de entrega mais fáceis, mas limitações na absorção de algumas moléculas exigem entrega direta. Um exemplo dessas moléculas são moléculas terapêuticas que funcionam melhor quando se movem sistemicamente dentro da planta, mas não podem ser efetivamente entregues por simples aplicações tópicas1. É o caso do Huanglongbing (HLB), também chamado de doença do greening dos citros. O HLB é uma doença associada a uma bactéria limitada ao floema, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), que não pode ser cultivada fora da planta, ou de seu inseto vetor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Se as moléculas terapêuticas putativas são produtos gênicos, elas podem ser testadas criando plantas transgênicas expressando esses compostos. No entanto, a produção de plantas transgênicas pode ser intensiva em tempo e recursos, é altamente dependente do genótipo e pode ser inibida pelo silenciamento gênico3. Além disso, mesmo que esses transgênicos apresentem resultados promissores, restrições regulatórias e de percepção pública reduzem a probabilidade de sua aceitação comercial 4,5. A aplicação exógena de compostos, no entanto, simplifica o teste de moléculas biológicas e sintéticas, pois não requer a produção de plantas transgênicas estáveis ou que expressam transitoriamente, o que reduz o tempo e os recursos para testar os efeitos de uma molécula. Um método para a entrega sistêmica eficaz e eficiente de compostos exógenos em plantas poderia ser usado para uma ampla variedade de propósitos de pesquisa e triagem.
Uma dessas aplicações é a análise do movimento sistêmico de moléculas dentro do sistema vascular de uma planta, que pode ser feito por meio de marcadores rastreáveis, sejam eles fluorescentes, visíveis ou isótopos químicos únicos 6,7,8,9. Um marcador fluorescente comumente utilizado é o 5,6-carboxifluoresceína-diacetato (CFDA), que é um corante permeável à membrana que é degradado por esterases intracelulares em 5,6-carboxifluoresceína (FC) e, posteriormente, torna-se fluorescente e impermeável à membrana10. A CFDA tem sido extensivamente utilizada para monitorar o transporte de floema, as relações entre o sumidouro e a fonte e o padrão da vasculatura em tecidos vegetais11,12.
Além desses marcadores, certos compostos podem alterar diretamente a fisiologia da planta para aumentar a produtividade ou matar a planta no caso de herbicidas. Tanto os inseticidas quanto os compostos antimicrobianos são um meio de aumentar a produtividade das plantas, especialmente na presença de HLB. Um exemplo de molécula antimicrobiana que é usada para controlar CLas é a estreptomicina. A estreptomicina é um antibiótico aminoglicosídeo originalmente isolado do Streptomyces griseus e demonstrou inibir o crescimento bacteriano através da inibição da biossíntese proteica13. Em termos de inseticidas, o principal alvo para a pesquisa do HLB é a D. citri, que transmite CLas de árvore para árvore14. Para tanto, neonicotinóides, como o imidaclopride, são comumente utilizados, pois são o padrão-ouro para o controle de insetos-praga15. Todos esses usos variados são aspectos importantes das estratégias atuais de manejo de plantas, e o desenvolvimento de novos produtos depende de ensaios de triagem eficientes.
Um método que é usado para a introdução de compostos em plantas lenhosas é a injeção direta no tronco. Uma variedade de sistemas foi projetada que varia em suas necessidades para locais de injeção pré-perfurados, e esses sistemas utilizam injeção baseada em pressão ou fluxo passivo16. Embora os sistemas baseados em pressão permitam a rápida introdução de um determinado composto, o dano físico potencial causado pela força de líquido através da vasculatura bloqueada ou embolizada precisa ser considerado17. Embora a aplicação foliar ou drenada de compostos seja menos demorada para ser implementada, a injeção direta na planta reduz o desperdício do composto de interesse devido a perdas para o ar ou solo e também pode prolongar o tempo em que os compostos estão em estado ativo, reduzindo a exposição ao ambiente externo18. Ambos os aspectos são importantes para preservar reagentes caros e garantir a consistência entre réplicas em ambientes de pesquisa.
Este estudo descreve o projeto, a construção e o uso de um dispositivo inovador de infusão direta de plantas (IPS), que pode ser usado para avaliar como compostos de interesse afetam uma planta hospedeira. Uma impressora 3D padrão foi usada para fabricar o dispositivo em si e vários componentes associados à sua construção. Este método de construção interno permite que os pesquisadores modifiquem o dispositivo e os componentes do dispositivo com base em suas necessidades experimentais específicas e reduz a dependência de dispositivos de injeção de plantas disponíveis comercialmente. A configuração do dispositivo é simples e eficiente, e todos os componentes auxiliares estão prontamente disponíveis e são baratos. Embora o sistema tenha sido projetado para uso com uma variedade de espécies vegetais, os exemplos aqui apresentados referem-se a plantas cítricas em vasos. Adicionalmente, este estudo demonstra que este dispositivo é capaz de entregar eficientemente múltiplos tipos de compostos sistemicamente para plantas cítricas jovens sem causar letalidade. Os compostos testados incluíram CFDA, que foi usado para avaliar a distribuição do composto na planta, e estreptomicina e imidaclopride, que foram usados para verificar que os efeitos antimicrobianos e inseticidas desses compostos foram observados quando administrados via DPI.
Protocol
1. Produção de plantas cítricas para injeção experimental de compostos
- Propagar pequenos vasos de citros a partir de estacas vegetativas enraizadas ou sementes. Cultivar as linhas cítricas em vaso sob um comprimento de dia claro/escuro de 16 h/8 h e a 28 °C.
- Selecionar plantas cítricas de tamanho adequado para o experimento. As aplicações descritas exigiram que as plantas tivessem entre 12 cm e 100 cm de altura e diâmetros de tronco de 4-14 mm. Se for necessário um novo crescimento, corte as plantas antes do experimento.
2. Impressão tridimensional do dispositivo DPI e componentes do molde
- Aplique uma fina camada de cola à base de acetato de polivinila na cama de impressão.
- Coloque o filamento de nylon na impressora 3D e prepare a impressora de acordo com as instruções do fabricante. Importe o arquivo desejado. Arquivo STL (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4, Arquivo Suplementar 5, Arquivo Suplementar 6, Arquivo Suplementar 7, Arquivo Suplementar 8, Arquivo Suplementar 9, Arquivo Suplementar 10, Arquivo Suplementar 11, Arquivo Suplementar 12, Arquivo Suplementar 13 e Arquivo Suplementar 14), configurado e iniciado a impressão.
- Retire a peça da cama de impressão. Enxágue a cola à base de acetato de polivinila da base do componente impresso com água e remova todas as estruturas de suporte.
- Borrife o componente DPI com duas demãos de tinta spray de brilho transparente.
3. Fabricação do molde do anel de plastisol
- Monte uma forma de molde grande o suficiente para segurar as peças do padrão construindo um gabinete retangular usando blocos plásticos encaixados em uma base (Figura Suplementar S1A).
- Misture o monômero de silicone RTV e o catalisador juntos em uma proporção de 10:1 e mexa sem introduzir bolhas por 1 min. Corar adicionando corante alimentar (3 gotas/25 mL de mistura de silicone) e sabonete para as mãos (1 mL de sabão/25 mL de mistura de silicone) (Figura Suplementar S1B).
- Despeje uma fina camada de silicone na forma do molde que seja suficiente para cobrir completamente o fundo. Tamp para achatar a superfície, e aguardar 24 h para que o silicone se fixe (Figura Suplementar S1C).
- Despeje uma segunda camada de silicone, conforme descrito acima, que seja profunda o suficiente para cobrir a impressão do núcleo do orifício central no padrão (visível na parte superior do padrão na Figura Suplementar S1D). Insira o padrão no silicone líquido com a impressão do núcleo do orifício central voltada para baixo. Certifique-se de que nenhuma bolha esteja presa e que os padrões estejam bem separados e não se toquem (Figura Suplementar S1E).
- Fixe os padrões com um objeto pesado e/ou fita adesiva para evitar que flutuem para fora do silicone enquanto ele se ajusta. Aguarde 24 h para que a camada recém-derramada seja definida (Figura Suplementar S1F).
- Despeje camadas adicionais de silicone até que o nível fique nivelado com a parte superior do padrão. Aguarde 24 h para cura (Figura Suplementar S1G).
- Desmonte os blocos plásticos para soltar o molde. Remova os padrões (Figura Suplementar S1H). Inspecionar o molde em busca de rasgos ou deformidades (Figura Suplementar S1I).
4. Fundição dos anéis de plastisol
- Revestir o interior do molde, todos os componentes do núcleo e os O-rings com óleo de cozinha (Figura Suplementar S2A, B). Coloque um anel O ao redor do entalhe no meio do núcleo do poste central e coloque o núcleo no orifício central do molde do anel de plastisol (Figura Suplementar S2C).
- Insira o núcleo do canal de entrega no orifício na lateral do molde do anel de plastisol. Orientar a ponta em forma de V no final do núcleo do canal de entrega para alinhar com o anel O no núcleo do poste central (Figura Suplementar S2D,E).
- Aqueça o plastisol no micro-ondas para rajadas curtas de 10 s (Figura suplementar S2F, G). Mexer o plastisol suavemente para evitar bolhas (Figura Suplementar S2H). Repetir o aquecimento e a agitação até que a solução atinja uma temperatura compreendida entre 160 °C e 170 °C (figura suplementar S2I).
CUIDADO: O superaquecimento do plastisol pode levar à liberação de vapores tóxicos. Realizar o procedimento em uma área bem ventilada ou exaustor. Não aquecer o plastisol a mais de 170 °C. - Despeje o plastisol fundido no molde do anel de plastisol próximo à borda externa do molde sem introduzir bolhas (Figura Suplementar S2J). Aguarde 1 h para que os anéis de plastisol esfriem (Figura Suplementar S2K). Retire os anéis do molde. Garantir o ajuste adequado com o dispositivo DPI antes de usar em ensaios experimentais (Figura Suplementar S2L).
5. Fixação do dispositivo DPI à planta
- Encontre um local suave e íntegro no porta-malas para o acessório do dispositivo. Evite solavancos ou nós, pois eles podem contribuir para o vazamento do dispositivo.
- Use uma broca de 2 mm de diâmetro para fazer um furo horizontalmente através do centro da haste em um ângulo de 90° com a superfície do tronco (Figura Suplementar S3A). Passe a broca pelo orifício várias vezes para limpá-lo e alisá-lo para criar um furo desobstruído (Figura Suplementar S3B).
- Crie um corte vertical no anel de plastisol no lado oposto do canal de entrega composto (Figura Suplementar S3C). Encaixe o anel ao redor da planta e alinhe o canal de entrega com o furo previamente perfurado (Figura Suplementar S3D).
OBS: O anel deve se encaixar confortavelmente ao redor do tronco para evitar vazamentos; Conjuntos de núcleos com vários diâmetros podem ser usados para fazer anéis de plastisol para hastes de plantas de tamanhos diferentes. - Adicione o dispositivo DPI ao anel de plastisol, garantindo que eles se encaixem perfeitamente. Alinhar o bico do dispositivo de DPI com o canal de entrega do anel de plastisol e o furo perfurado (Figura Suplementar S3E).
NOTA: Usar uma broca para alinhar o furo e o bico do dispositivo DPI pode ser útil. - Enrole bem com fita adesiva de silicone para segurar o aparelho no lugar (Figura Suplementar S3F). Inspecione o dispositivo totalmente montado e acoplado para garantir o alinhamento e a orientação adequados na planta.
6. Aplicação do composto de juros utilizando o dispositivo DPI
- Use uma seringa ou pipeta para preencher o dispositivo de DPI com a solução de interesse (Figura Suplementar S3G). Use uma seringa para penetrar a fita de silicone e o anel de plastisol no lado oposto do dispositivo de IPS para puxar o ar para fora do canal interno e evitar a introdução de bolhas de ar na vasculatura da planta (Figura Suplementar S3H). Substitua qualquer composto extraído de volta para o dispositivo DPI.
- Adicione um pequeno pedaço adicional de fita de silicone sobre o orifício criado pela seringa para reforçar a área e evitar rasgos. Inspecione o aparelho em busca de vazamentos visíveis no ponto de fixação e inspecione o reservatório do dispositivo para obter um nível de líquido estável.
NOTA: A água pode ser usada inicialmente para testar vazamentos para evitar o desperdício da solução de teste. - Cubra a extremidade aberta do dispositivo DPI com filme de vedação de cera e puxe para baixo para formar uma vedação e reduzir a evaporação do composto experimental. Faça um único orifício na película de cera com uma ponta de seringa para evitar o desenvolvimento de vácuo e, posteriormente, encha novamente o dispositivo (Figura Suplementar S3I).
- Verifique o aparelho diariamente para garantir o alinhamento adequado dos componentes (Figura Suplementar S3J), e cubra o líquido usando uma seringa para evitar que o reservatório seque. Repita este processo até que a quantidade desejada de solução experimental tenha sido introduzida.
NOTA: Os compostos podem ser introduzidos com sucesso a partir de um determinado dispositivo por até 1 mês. As durações de absorção da solução que excedam esse período de tempo devem ser testadas empiricamente antes da instalação experimental.
7. Usando CFDA para observar o movimento vascular com plantas cítricas
- Conecte o dispositivo de DPI a plantas de citrons (Citrus medica L.) de 25 cm de altura, aplique um único tratamento de 2,0 mL de DMSO a 20% no controle H2O ou CFDA ao dispositivo de DPI e permita sua absorção por 24 h. Para seguir este protocolo, prepare a solução de CFDA de trabalho adicionando 1,6 mL de H 2 O a 400 μL de solução estoque de CFDA (a solução-estoque contém 10 mM de CFDA dissolvido em 100% de dimetilsulfóxido [DMSO]) para gerar uma concentração final de CFDA de2mM e 20% de DMSO.
- Faça cortes transversais de vários tecidos da planta e use um estereoscópio ou microscópio composto com um filtro fluorescente que inclui o comprimento de onda de 498 nm para visualizar o CFDA nos tecidos vegetais. Comparar as imagens com o DMSO a 20% nos controles de H2O para explicar a autofluorescência no tecido.
8. Medição das alterações nos títulos de CLas em amostras foliares após tratamento com estreptomicina
- Usando plantas de 0,75 m de altura cultivadas em casa de vegetação e cultivadas em casa de vegetação de Valência (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia"), coletar o pecíolo e a nervura central de duas folhas sintomáticas do HLB de cada planta, picá-las em pequenas seções, agrupar cada tipo de tecido e armazená-las separadamente em tubos de amostra resistentes a impactos de 2 mL contendo uma esfera de aço de 6,35 mm de diâmetro.
- Triturar a amostra usando um homogeneizador programado para dois ciclos de 15 s a 3,4 m/s. Extrair o ácido nucleico total conforme descrito anteriormente19.
- Realizar qPCR nas amostras foliares infectadas por CLas usando a mistura de qPCR definida na Tabela 1 e as condições de reação definidas na Tabela 2. Use plantas que apresentem infecções robustas por CLas (infecção robusta é geralmente definida como valores de Ct baseados em qPCR < 30 para o conjunto de primers CLas 16S LasLong (LL)) para análise adicional.
NOTA: O título bacteriano é estimado usando CLas 16S Las Long (LL) e primers de DNA de desidratina cítrica para estimar os equivalentes relativos do genoma, conforme descrito anteriormente20. - Equipar as plantas cítricas que satisfazem o título mínimo de infecção descrito acima com dispositivos de IPS e submetê-las a um tratamento único de 2,0 mL de solução de H2O ou solução de estreptomicina na concentração desejada. Para acompanhar este estudo, use um único tratamento de 2,0 mL de estreptomicina dissolvida em H2O na dose de 2,0 mL (19 mg no total).
- Coletar amostras foliares aos 7 dias, 14 dias e 28 dias pós-tratamento. Testar as folhas amostradas para o título de CLas usando o mesmo protocolo descrito acima.
- Aos 60 dias após o tratamento, obter fotografias das plantas tratadas com H2O ou estreptomicina. Use observações visuais da infecção por CLas para pontuar a gravidade da infecção. Procure <50% das folhas apresentando clorose intervenosa e cortiça nas nervuras, juntamente com o crescimento do rubor foliar como sinais de infecção leve e mais de 50% das folhas com clorose intervenosa e rolha nas nervuras, bem como abscisão foliar e nanismo do crescimento da planta como sinais de infecções mais graves.
9. Mensuração da mortalidade de D. citri após tratamento com imidaclopride
- Puxe plantas de citron (Citrus medica L.) de 0,5 m de altura até uma altura de 12 cm para incentivar o crescimento de novos afluentes.
NOTA: A velocidade de crescimento pode ser dependente da fitossanidade e da época do ano; Então, leve isso em consideração durante o planejamento experimental. - Após >6 flush, 1-2 cm de comprimento, ter desenvolvido, introduzir as plantas em gaiolas contendo adultos de D. citri. Deixe as plantas nas gaiolas por 24 h para permitir a deposição de ovos.
- Realizar contagens representativas de ovos em três brotos de descarga 1-2 dias após a postura e, posteriormente, aplicar os dispositivos de DPI. Encher esses dispositivos com 2,0 mL de um controle de água ou a concentração desejada de imidaclopride (21,8% de ingrediente ativo). Para seguir esse protocolo, utilizar 528 μL/L, 52,8 μL/L e 5,28 μL/L de imidaclopride.
NOTA: As contagens de ovos são uma medida destrutiva, de modo que as contagens nesta fase são usadas para estimar o número de ovos no fluxo não contado da mesma planta e ajudar a fornecer uma linha de base para as contagens subsequentes de emergência de ninfas que são conduzidas no final do experimento. - Coletar a taxa de emergência de D. citri em pelo menos três dos brotos restantes. Adquirir fotografias representativas da planta 7 dias após a introdução do composto.
Representative Results
Componentes do dispositivo de perfusão direta
A versão base do dispositivo de infusão direta tem 8 cm de altura e 3,3 cm de largura na frente e na lateral (Figura 1A). Contém um único reservatório central contíguo à bica, e o volume total que pode ser contido nesses componentes é de 2,0 mL (Figura 1D). O anel plastisolal tem 1,8 cm de altura e 2,7 cm de diâmetro (Figura 1C). Este anel também contém dois canais: um para acomodar o bico do dispositivo DPI e outro de diâmetro variável que se encaixa ao redor do tronco da árvore que está sendo tratada. Além disso, há um sulco ao redor do canal vertical para direcionar o excesso de tratamento para circundar a árvore, o que permite a absorção adicional de compostos através da casca (Figura 1F). Quando montado corretamente, o anel de plastisol deve ser nivelado contra o dispositivo de IPS, e o bico deve alinhar-se com o orifício perfurado na árvore (Figura 1B e Figura 1E).
CFDA
Para investigar a eficácia do dispositivo DPI na introdução de produtos químicos exógenos em plantas cítricas, 2,0 mL de CFDA 2 mM foram infiltrados com o dispositivo. Um sinal de fluorescência foi detectado na vasculatura da planta tratada (Figura 2A), mas esteve ausente nas plantas controle tratadas com DMSO 20% em H2O (Figura 2B). Esse sinal foi observado em todos os tipos de tecido vegetal dissecado, incluindo mesofilo foliar, vasculatura do pecíolo, vasculatura do caule e vasculatura radicular (Figura 2C). Esse sinal foi observado na planta dentro de 24 h do tratamento e distribuiu-se de forma relativamente uniforme pelos tecidos.
Estreptomicina
Para testar se os compostos introduzidos tinham efeito terapêutico na doença HLB, 2,0 mL de um composto bactericida, estreptomicina, foram introduzidos em laranjeiras Valencia (Citrus sinensis) CLas-positivas na concentração de 9,5 mg/mL (19 mg no total). Essas plantas foram mantidas em vasos de vegetação, e o título de CLas (medido por CLas genoma equivalente por equivalente de genoma de citros) foi monitorado ao longo do tempo usando qPCR (Figura 3A). Os títulos médios iniciais de CLas de DNA para as plantas tratadas com estreptomicina e H2O foram 0,562 CLas genoma/genoma de citros e 0,49 CLas genoma/genoma de citros, respectivamente. Reduções no título bacteriano médio foram detectadas por qPCR 7-28 dias após o tratamento com estreptomicina quando comparado aos controles H2O no mesmo ponto de tempo. Além disso, a diferença entre os títulos bacterianos médios do tempo 0 e do dia 28 foi de 0,314 e 0,117 para plantas tratadas com estreptomicina e H2O, respectivamente.
Este experimento foi delineado para medir a resposta da planta a diferentes tratamentos em diferentes períodos de tempo. Utilizou-se delineamento de superfície de resposta quadrática de dois fatores, com o tempo tratado como fator discreto quantitativo com quatro níveis (0 dias, 7 dias, 14 dias e 28 dias) e o tratamento como fator categórico com dois níveis (H2O e estreptomicina). Foram utilizadas cinco repetições para cada uma das oito combinações de tratamentos, e o título de CLas foi medido como variável resposta. Os dados foram transformados usando log10 com base em uma análise de Box-Cox. A redução do modelo foi realizada por seleção direta utilizando o critério de informação de Akaike (AICc)21, o que resultou na remoção dos efeitos de tempo e interação. O fator restante, tratamento, foi significativo (p = 0,0252), com as plantas tratadas com estreptomicina apresentando menor título médio de CLas (0,349) do que as plantas tratadas com H2O (0,496) em todos os momentos combinados (Figura 3B). Essa redução nos títulos de CLas correspondeu a aumentos ocasionais no crescimento de novos brotamentos sadias após 60 dias nas plantas tratadas com estreptomicina, como evidenciado por fotografias de árvores representativas tratadas com H2O (Figura 3C) versus 19 mg de estreptomicina (Figura 3D).
Imidaclopride
O imidaclopride foi introduzido em plantas juvenis de cidros infestadas por psilídeos asiáticos dos citros (ACP) usando o dispositivo DPI para testar seu potencial como ensaio de triagem inseticida de D. citri. Um único tratamento de 2,0 mL de uma solução comercial de inseticida imidaclopride foi testado em três diferentes concentrações (5,28 μL/L, 52,8 μL/L e 528 μL/L), juntamente com uma testemunha água. A contagem total média de ovos por três brotações antes do tratamento variou de 280,5 a 321, não havendo diferenças significativas entre as plantas a serem utilizadas para cada grupo de tratamento (Figura 4A). A média total de ninfas sobreviventes em três brotações 7 dias após o tratamento foi de 293,75, 268, 97,5 e 2 para o controle água e 5,28 μL/L, 52,8 μL/L e 528 μL/L de soluções de imidacloprido, respectivamente (Figura 4B). Isso representou uma redução significativa na emergência de ninfas de psilídeos nos níveis de 52,8 μL/L (p = 0,029) e 528 μL/L (p = 0,002) da solução de imidaclopride quando comparado ao controle de água de acordo com uma ANOVA one-way seguida por uma análise post-hoc de Tukey. Além disso, esse aumento na mortalidade de ninfas de psilídeos no nível mais alto da solução de imidaclopride foi visualmente aparente pela redução na produção de melato de ninfa nas linhas tratadas com imidacloprido (Figura 4D) quando comparadas ao controle de água (Figura 4C).
Figura 1: O dispositivo de infusão direta da planta e o anel plastisol. (A) O dispositivo de infusão direta intacto da planta e (C) anel de plastisol, juntamente com suas dimensões. (B) O dispositivo de infusão direta de plantas e o anel de plastisol conectados e conectados a uma árvore cítrica. Seções transversais verticais do (D) dispositivo de infusão direta da planta, (F) anel de plastisol e (E) esses dois componentes conectados e ligados a uma árvore cítrica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Seção transversal da nervura central da folha de uma planta cítrica de 25 cm. Imagens mostrando 24 h após o tratamento com (A) 2 mM CFDA ou (B) 20% DMSO em H2O usando o dispositivo de infusão direta da planta. (C) Cortes transversais de vários tecidos vegetais 24 h após o tratamento com CFDA 2 mM, incluindo o tronco 5 cm acima do dispositivo de infusão direta da planta (canto superior esquerdo), o tronco 5 cm abaixo do dispositivo de infusão direta da planta (meio esquerdo), a raiz (inferior esquerda), a nervura central da folha (superior direita), o pecíolo foliar (médio direito) e o mesofilo foliar (inferior direito). Barras de escala = 1 mm. Abreviações: CFDA = 5,6-carboxifluoresceína-diacetato; DMSO = dimetil sulfóxido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Monitoramento do título de CLas (medido por equivalentes do genoma de CLas por equivalentes do genoma dos citros) ao longo do tempo usando qPCR. (A) Evolução temporal mostrando alterações no título de DNA de CLas, comparando as cinco plantas tratadas com 19 mg de estreptomicina com as cinco plantas tratadas com uma testemunha H2O. Os pontos representam a média de um determinado tratamento em um determinado momento. As barras de erro representam o erro padrão da média. (B) Gráfico de barras mostrando o título médio de CLas das plantas tratadas com H2O e estreptomicina em todos os momentos. As barras de erro representam o intervalo de confiança de 95%, e os asteriscos denotam diferenças significativas (* = p < 0,05) entre os títulos médios de CLas para as plantas tratadas com estreptomicina e H2de acordo com uma ANOVA one-way. (C) Imagens representativas de plantas cítricas 0 meses e 2 meses após o tratamento por infusão direta de plantas com (C) H2O ou (D) estreptomicina. As plantas tratadas com estreptomicina apresentam novo crescimento foliar verde-claro após 2 meses, o que é sugestivo de redução no título de CLas. Abreviação: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Monitoramento da mortalidade de ninfas de psilídeos em plantas juvenis de cidros infestados por ACP. Gráficos de barras mostrando (A) as contagens iniciais estimadas de ovos e (B) as ninfas sobreviventes de D. citri em três descargas de citros 7 dias após o tratamento com controle de água e várias diluições de imidaclopride. As barras de erro representam o erro padrão da média, e os asteriscos denotam diferenças significativas (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) entre um dado nível de tratamento e o controle da água de acordo com uma ANOVA one-way seguida de uma análise post-hoc de Tukey. Imagens de D. citri infestado por ninfas de citros 7 dias após o tratamento com (C) controle de água ou (D) 528 μL/L de imidaclopride usando o dispositivo de infusão direta da planta. Abreviaturas: ACP = psilídeo asiático dos citros; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Volume por amostra (μL) | Componente | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR com BRYT Green Dye Master Mix | |||||
| 5 | Modelo de DNA (20 ng/μL) | |||||
| 0.5 | Primer F e R de 10 μM para CLas | Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (avançado); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Reverso) |
||||
| 0.5 | Primer F e R de 10 μM para limpeza de citros | Desidratina cítrica: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (Avançado); AAAACTTCACCGATCCACCAG (Reverso) |
||||
| 6.5 | H2O | |||||
Tabela 1: A mistura de qPCR utilizada para quantificar o título de CLas em linhagens de citros tratadas com estreptomicina. A sequência dos primers 16S Las Long e primers de desidratina cítrica para quantificação de DNA CLas e DNA cítrico são mostrados.
| Passo | Temperatura (°C) | Hora | |
| 1 | Desnaturação Inicial | 95 | 2 minutos |
| 2 | Desnaturar | 95 | 15 s |
| 3 | Recozimento | 60 | Anos 20 |
| 4 | Extensão | 72 | Anos 20 |
| 5 | Vá para a etapa 2, repita 39x | ||
| 6 | Curva de fusão | 60 rampa para 95 a 0,2 °C/s | 3 minutos |
Tabela 2: Condições de reação para a qPCR usada para quantificar o título de CLas em linhagens de citros tratadas com estreptomicina.
Figura Suplementar S1: Imagens mostrando o processo de montagem do molde para geração do anel de plastisol. (A) Blocos plásticos encaixados foram utilizados para gerar a primeira camada do molde do anel plastisolal. (B) Solução uniformemente misturada contendo borracha de silicone RTV, catalisador, corante alimentar e sabão. (C) Despejada uniformemente a primeira camada do molde do anel plastisol. (D) Imagem dos padrões de anéis de plastisol com a impressão central do núcleo na parte superior. (E) Padrões de anéis de plastisol inseridos na segunda camada não curada do molde. (F) Fita adesiva e martelo de borracha usados para fixar os padrões como cura da segunda camada. (G) Terceira camada do molde adicionada até que fique nivelado com a parte superior dos padrões. (H) Remoção dos padrões do molde. (I) Molde de anel de plastisol totalmente construído. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S2: Imagens mostrando o processo de montagem do anel de plastisol associado ao dispositivo de infusão direta da planta. (A) Componentes de montagem do anel de plastisol, incluindo o molde, o núcleo central com um O-ring e o núcleo do canal de entrega. (B) Revestimento dos núcleos em óleo de cozinha spray antiaderente para facilitar a remoção do anel de plastisol após o endurecimento. (C) Inserção do núcleo central e O-ring no molde. (D) Inserção do núcleo do canal de entrega perpendicular ao núcleo central. (E) Montagem adequada dos componentes do núcleo do anel de plastisol na cavidade do molde. (F) Plastisol utilizado para a geração do anel plastisol. (G) Aquecimento do plastisol no micro-ondas. (H) Agitar o plastisol após aquecimento. (I) Verificação da temperatura do plastisol. (J) Despejar o plastisol aquecido no núcleo montado. (K) Permitir o resfriamento do plastisol ao redor do núcleo montado. (L) Anéis de plastisol totalmente montados ligados ao dispositivo de infusão direta da planta. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S3: Imagens que mostram o processo de montagem do dispositivo de infusão direta da planta. (A) Fazer um furo no centro da planta cítrica para criar um canal para a entrega de compostos. (B) Vista frontal do furo perfurado. (C) Corte através do anel de plastisol com uma lâmina de barbear oposta ao canal de entrega do composto. (D) Encaixar firmemente o anel de plastisol ao redor da haste no local do furo previamente perfurado. (E) Encaixe do dispositivo de infusão direta da planta no anel de plastisol, com a torneira de entrega do composto no dispositivo inserida no canal do anel de plastisol. (F) Usar fita de silicone para fixar o dispositivo de infusão direta da planta ao anel de plastisol e manter todo o aparelho no lugar. (G) Enchimento da câmara do dispositivo de infusão direta da planta com o composto de interesse. (H) Usar uma seringa para puxar o ar do furo perfurado na planta e iniciar o fluxo do composto. (I) Aplicar filme selante de cera na abertura da câmara do dispositivo de infusão direta da planta e furar um orifício para evitar vácuo. (J) Dispositivo de infusão direta de plantas totalmente montado em uma planta de citros. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 1: O núcleo central do anel de plastisol . STL para uma árvore de 4 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 2: O núcleo central do anel de plastisol . STL para uma árvore de 6 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 3: O núcleo central do anel de plastisol . STL para uma árvore de 8 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 4: O núcleo central do anel de plastisol . STL para uma árvore de 10 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 5: O núcleo central do anel de plastisol . STL para uma árvore de 12 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 6: O núcleo central do anel plastisol. STL para uma árvore de 14 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 7: O núcleo do canal de entrega do anel de plastisol . STL para uma árvore de 4 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 8: O núcleo do canal de entrega do anel de plastisol . STL para uma árvore de 6 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 9: O núcleo do canal de entrega do anel plastisol. STL para uma árvore de 8 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 10: O núcleo do canal de entrega do anel de plastisol . STL para uma árvore de 10 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 11: O núcleo do canal de entrega do anel de plastisol . STL para uma árvore de 12 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 12: O núcleo do canal de entrega do anel plastisol. STL para uma árvore de 14 mm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 13: O dispositivo de infusão direta da planta . Arquivo STL. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo Suplementar 14: O padrão usado para criar o molde para o anel de plastisol. Arquivo STL. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Para que o dispositivo de DPI seja considerado um método viável para a entrega de compostos exógenos em plantas, ele deve contribuir para a absorção robusta e consistente de compostos em uma variedade de tipos de tecidos. O experimento utilizando CFDA mostrou claramente movimento de compostos acropetais e basipetais, bem como no sistema vascular e nas células do mesofilo da folha. Além disso, e presumivelmente porque o furo usado neste dispositivo de IPD fornece uma grande quantidade de área superficial para a captação do composto, a CFDA estava presente em quantidades relativamente iguais em todas as seções do caule, não apenas em um pequeno subconjunto da vasculatura adjacente ao dispositivo, como foi visto em estudos anteriores de captação de corante em plantas usando injeção de tronco6. Adicionalmente, a liberação de proteína fluorescente verde e corante floral foi testada usando o dispositivo DPI, e uma distribuição desses compostos semelhante à CFDA foi observada (dados não mostrados). Esses dados sugerem que o dispositivo pode ser usado para entregar sistemicamente uma variedade de compostos que variam em tamanho e estrutura molecular. No entanto, é importante notar que houve diferenças na absorção do composto com base no estágio de desenvolvimento foliar, com folhas mais jovens em desenvolvimento ocupando mais composto do que folhas mais velhas estabelecidas. Isso pode ser devido às alterações nas propriedades vasculares presentes no tecido sumidouro versus tecido fonte e deve ser otimizado para um determinado experimento.
O dispositivo de IPD mostrou absorção de compostos suficiente para a visualização de CFDA, GFP e corante floral, e também levou o suficiente para mostrar os efeitos antibacterianos e inseticidas da estreptomicina e imidaclopride, respectivamente. Ambos os compostos resultaram em alterações na viabilidade do organismo-alvo 1 semana após um único tratamento de 2,0 mL. Esses dados sugerem que o dispositivo de IPD pode ser usado em ensaios de planta inteira para testar a viabilidade de uma ampla variedade de compostos para o controle de pragas microbianas e de insetos. Além disso, devido ao seu contato direto com o sistema vascular, este dispositivo pode até mesmo fornecer uma oportunidade para testar compostos que não são eficientemente absorvidos pelas raízes ou células epidérmicas. De particular interesse seria a interferência de RNA (RNAi), uma vez que poderia ser usada para modular a expressão gênica dentro da planta hospedeira, patógeno ou vetor patógeno. Pesquisas anteriores que introduziram o RNA hairpin através de um orifício perfurado no tronco de macieiras e uvas mostraram que as moléculas de RNA estavam restritas ao tecido do xilema, sugerindo que essas moléculas podem ser eficazes apenas contra organismos mastigadores e alimentadores de seiva de xilema22. Dado que o dispositivo de DPI usa um sistema de entrega de furo perfurado semelhante, é lógico que o RNA hairpin entregue com este dispositivo também pode ser restrito ao tecido do xilema. No entanto, a diminuição observada no título das CLas limitadas ao floema após o tratamento com estreptomicina a partir do dispositivo de IPS sugere fortemente que esse antibiótico estava presente no floema. Portanto, é provável que a distribuição vascular dos compostos liberados usando o dispositivo de DPI seja dependente de seu tamanho e química, e cada molécula deve ser avaliada individualmente.
Embora haja uma série de dispositivos DPI disponíveis comercialmente no mercado, o dispositivo descrito aqui pode ser fabricado internamente e é modificável. Desta forma, melhorias e mudanças de tamanho podem ser feitas com base na espécie vegetal e no desenho experimental que está sendo usado, e não depende de produtos comerciais. Além disso, o dispositivo é semi-permanentemente ligado à planta, o que significa que vários tratamentos de um determinado composto podem ser realizados simultaneamente sem ter que rejuvendo a planta com várias injeções de composto. Em uma nota de advertência, o dispositivo pode vazar se não for instalado corretamente. Como resultado, o composto é perdido para o meio ambiente em vez de ser entregue à planta. Portanto, deve-se tomar cuidado para inspecionar o dispositivo em busca de quaisquer sinais de vazamento durante a configuração e nos primeiros dias depois. Embora a perfuração de um buraco na árvore seja potencialmente prejudicial, este método foi escolhido para garantir uma absorção robusta e consistente do composto. Além disso, não foram observados efeitos adversos sobre a fitossanidade com a fixação do dispositivo de IPS nesses experimentos. No entanto, plantas extras devem ser incluídas no planejamento experimental para substituir aquelas que podem perder vigor ao longo de um determinado experimento. Por fim, como esse dispositivo usa fluxo passivo para introduzir compostos, pode ser difícil prever a taxa de absorção em diferentes espécies de plantas ou estágios de desenvolvimento da mesma espécie. Isso pode complicar os experimentos se a velocidade de absorção do composto for um fator limitante. Para obter os melhores resultados, os experimentos devem ser planejados de modo que seja fornecido tempo suficiente para que a planta absorva totalmente os 2,5 mL do composto, o que pode levar até 1 semana. Em conclusão, este dispositivo de IPD é uma ferramenta eficaz para a rápida avaliação da atividade in planta de compostos antimicrobianos ou inseticidas contra CLas e seu vetor, D. citri, fornecendo assim mais informações sobre a eficácia sistêmica e influência no desempenho das plantas do que o ensaio foliar destacado apresentadoanteriormente23. Sem dúvida, a variedade de aplicações desse sistema vai muito além dos usos específicos descritos neste estudo.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse. O uso de nomes comerciais, firmas ou corporações nesta publicação é para informação e conveniência do leitor. Tal uso não constitui um endosso ou aprovação oficial pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos ou pelo Serviço de Pesquisa Agrícola de qualquer produto ou serviço, com exclusão de outros que possam ser adequados. O Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) proíbe a discriminação em todos os seus programas e atividades com base em raça, cor, origem nacional, idade, deficiência e, quando aplicável, sexo, estado civil, status familiar, status parental, religião, orientação sexual, informações genéticas, crenças políticas, represália ou porque toda ou parte da renda de um indivíduo é derivada de qualquer programa de assistência pública. Nem todas as bases proibidas se aplicam a todos os programas. Pessoas com deficiência que necessitem de meios alternativos para comunicação de informações do programa (Braille, letras grandes, fita de áudio, etc.) devem entrar em contato com o Centro TARGET do USDA pelo telefone (202) 720-2600 (voz e TDD). Para registrar uma queixa de discriminação, escreva para USDA, Diretor, Escritório de Direitos Civis, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410, ou ligue para (800) 795-3272 (voz) ou (202) 720-6382 (TDD). O USDA é um provedor e empregador de oportunidades iguais.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Mant Acon pelas plantas utilizadas neste estudo. O financiamento foi fornecido pelo projeto CRIS 8062-22410-007-000-D do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA) e pelo USDA NIFA grant 2020-70029-33176.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
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