Summary
هنا ، نعرض بروتوكولا محسنا قائما على مضان BODIPY 493/503 لتوصيف قطرات الدهون في أنسجة الكبد. من خلال استخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، يسمح الفلوروفور بالتمييز الناجح بين التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية لتقييم التنكس الدهني الكبدي.
Abstract
قطرات الدهون (LDs) هي عضيات متخصصة تتوسط في تخزين الدهون وتلعب دورا مهما للغاية في قمع السمية الدهنية ومنع الخلل الوظيفي الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs). الكبد ، نظرا لدوره الحاسم في استقلاب الدهون في الجسم ، مهدد باستمرار من خلال تراكم LDs داخل الخلايا في شكل تنكس دهني كبدي حويصلي وكبير. يعتمد التوصيف النسيجي ل LDs عادة على أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل تلطيخ Oil Red O (ORO) ، ولكن هناك عددا من العيوب التي تعيق باستمرار استخدام هذا التحليل مع عينات الكبد. في الآونة الأخيرة ، أصبحت الفلوروفورات المحبة للدهون 493/503 شائعة لتصور وتحديد موقع LDs بسبب امتصاصها السريع وتراكمها في قلب قطرات الدهون المحايدة. على الرغم من أن معظم التطبيقات موصوفة جيدا في مزارع الخلايا ، إلا أن هناك أدلة أقل تثبت الاستخدام الموثوق لتحقيقات الفلوروفور المحبة للدهون كأداة تصوير LD في عينات الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على ثنائي بيروميثين البورون (BODIPY) 493/503 لتقييم LDs في عينات الكبد من نموذج حيواني لنظام غذائي عالي الدهون (HFD) الناجم عن تنكس دهني كبدي. يغطي هذا البروتوكول تحضير عينات الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وتلطيخ BODIPY 493/503 ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات. لقد أظهرنا زيادة في عدد وشدة ونسبة المساحة وقطر LDs الكبدية عند تغذية HFD. باستخدام الإسقاطات المتعامدة وإعادة البناء 3D ، كان من الممكن مراقبة المحتوى الكامل للدهون المحايدة في قلب LD ، والتي ظهرت على شكل قطرات كروية تقريبا. علاوة على ذلك ، مع الفلوروفور BODIPY 493/503 ، تمكنا من التمييز بين الحويصلات الدقيقة (1 ميكرومتر < د ≤ 3 ميكرومتر) ، والحويصلات الوسيطة (3 ميكرومتر < د ≤ 9 ميكرومتر) ، والحويصلات الكبيرة (د > 9 ميكرومتر) ، مما يسمح بالتمييز الناجح للتنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير . بشكل عام ، يعد هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 أداة موثوقة وبسيطة لتوصيف LD الكبدي وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية.
Introduction
قطرات الدهون (LDs) ، التي ينظر إليها تقليديا على أنها مستودعات للطاقة ، هي عضيات خلوية متخصصة تتوسط في تخزين الدهون ، وهي تتألف من نواة دهنية محايدة كارهة للماء ، والتي تحتوي بشكل أساسي على استرات الكوليسترول والدهون الثلاثية (TGs) ، مغلفة بطبقة أحادية فوسفوليبيد1،2،3.
يحدث التكوين الحيوي LD في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، بدءا من تخليق ثلاثي الجلسرين (TAG) واسترات الستيرول. تنتشر الدهون المحايدة بين وريقات الطبقة المزدوجة ER بتركيزات منخفضة ولكنها تتجمع في عدسات زيتية تنمو وتنبت في قطرات كروية تقريبا من غشاء ER عندما يزيد تركيزها داخل الخلايا4. بعد ذلك ، تنتقل البروتينات من طبقة ER المزدوجة والعصارة الخلوية ، وخاصة عائلة بروتين perilipin (PLIN) ، إلى أسطح LDs لتسهيل التبرعم5،6،7،8،9.
من خلال تخليق الأحماض الدهنية الجديدة واندماج LD أو الاندماج ، تنمو LDs إلى أحجام مختلفة. وفقا لذلك ، يختلف حجم وعدد LDs اختلافا كبيرا عبر أنواع الخلايا المختلفة. يمكن تشكيل قطرات صغيرة (قطرها 300-800 نانومتر) ، والتي تعرف باسم LDs الأولية (iLDs) ، بواسطة جميع الخلايا4 تقريبا. في وقت لاحق من تكوين LD ، تكون معظم الخلايا قادرة على تحويل بعض iLDs إلى LDs أكبر حجما (قطرها > 1 ميكرومتر). ومع ذلك ، فإن أنواعا معينة فقط من الخلايا ، مثل الخلايا الشحمية وخلايا الكبد ، لديها القدرة على تكوين LDs عملاقة أو كبيرة الحجم (يصل قطرها إلى عشرات الميكرونات)4,10.
تلعب LDs دورا مهما جدا في تنظيم استقلاب الدهون الخلوية ، وقمع السمية الدهنية ، ومنع إجهاد ER ، واختلال وظائف الميتوكوندريا ، وفي النهاية موت الخلايا الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs) 11،12،13،14. علاوة على ذلك ، تورطت LDs أيضا في تنظيم التعبير الجيني ، وعزل بروتين التكاثر الفيروسي ، والاتجار بالأغشية والإشارة15،16،17. لذلك ، فإن سوء تنظيم التكوين الحيوي LD هو السمة المميزة للأمراض المزمنة المرتبطة بمتلازمة التمثيل الغذائي ، والسمنة ، وداء السكري من النوع 2 (T2DM) ، و / أو تصلب الشرايين ، على سبيل المثال لا الحصر18،19،20.
الكبد ، كمركز استقلابي ، مسؤول في الغالب عن استقلاب الدهون عن طريق تخزين ومعالجة الدهون ، وبالتالي ، فهو مهدد باستمرار بالسمية الدهنية21. التنكس الدهني الكبدي (HS) هو سمة شائعة لسلسلة من أمراض الكبد التقدمية ويتميز بتراكم الدهون المفرط داخل الخلايا في شكل LDs الخلوية التي قد تؤدي في النهاية إلى خلل وظيفي في التمثيل الغذائي في الكبد ، والتهاب ، وأشكال متقدمة من مرض الكبد الدهني غير الكحولي22،23،24،25. يحدث HS عندما يكون معدل أكسدة الأحماض الدهنية وتصديرها كدهون ثلاثية داخل البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (VLDLs) أقل من معدل امتصاص الأحماض الدهنية الكبدية من البلازما وتخليق الأحماض الدهنية الجديدة 26. غالبا ما يحدث التراكم الكبدي للدهون في شكلين - التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير - وهذه تظهر خصائص معمارية خلوية مميزة27. عادة ، يتميز التنكس الدهني الحويصلي الدقيق بوجود LDs صغيرة منتشرة في جميع أنحاء خلية الكبد مع وضع النواة مركزيا ، في حين يتميز التنكس الدهني الحويصلي الكبير بوجود LD كبير واحد يحتل الجزء الأكبر من خلية الكبد ، مما يدفع النواة إلى المحيط28,29. والجدير بالذكر أن هذين النوعين من التنكس الدهني غالبا ما يتم العثور عليهما معا ، ولا يزال من غير الواضح كيف يؤثر هذان النمطان من LD على التسبب في المرض ، حيث لا تزال الأدلة غير متسقة31،32،33،34. ومع ذلك ، غالبا ما يستخدم هذا النوع من التحليل ك "معيار مرجعي" في الدراسات قبل السريرية والسريرية لفهم السلوك الديناميكي ل LDs وتوصيف التنكس الدهني الكبدي29،34،35،36.
يتم تقييم خزعات الكبد ، المعيار الذهبي لتشخيص وتصنيف HS ، بشكل روتيني عن طريق تحليل الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) النسيجي ، حيث يتم تقييم قطرات الدهون على أنها فجوات غير ملوثة في أقسام الكبد الملطخة H&E37. في حين أنه مقبول لتقييم التنكس الدهني الحويصلي الكبير ، فإن هذا النوع من التلوين يضيق عموما تقييم التنكس الدهني الحويصليالدقيق 38. يتم دمج أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل Oil Red O (ORO) ، بشكل كلاسيكي مع الفحص المجهري برايتفيلد لتحليل مخازن الدهون داخل الخلايا ، ولكن لا يزال لها عدد من العيوب: (i) استخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول في عملية التلوين ، والتي غالبا ما تسبب تعطيل LDs الأصلية والانصهار العرضي على الرغم من إصلاح الخلايا39; (ii) الطبيعة المستهلكة للوقت ، حيث يتطلب محلول ORO إذابة مسحوق طازج وترشيحه بسبب مدة الصلاحية المحدودة ، مما يساهم في نتائج أقل اتساقا ؛ (iii) وحقيقة أن ORO يلطخ أكثر من مجرد قطرات دهنية وغالبا ما يبالغ في تقدير التنكس الدهني الكبدي38.
وبالتالي ، تم استخدام الفلوروفورات المحبة للدهون المنفذة للخلايا ، مثل النيل الأحمر ، إما في عينات حية أو ثابتة للتغلب على بعض القيود المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير المحددة لوضع العلامات على عضيات الدهون الخلوية تضيق مرارا وتكرارا تقييمات LD40. علاوة على ذلك ، تختلف الخصائص الطيفية لأحمر النيل وفقا لقطبية البيئة ، والتي يمكن أن تؤدي في كثير من الأحيان إلى تحولات طيفية41.
مسبار الفلورسنت المحب للدهون 1،3،5،7،8-خماسي ميثيل-4-بورا-3a، 4adiaza-s-indacene (الطول الموجي للإثارة: 480 نانومتر ؛ الحد الأقصى للانبعاث: 515 نانومتر ؛ BODIPY 493/503) خصائص الكارهة للماء التي تسمح بامتصاصه السريع بواسطة LDs داخل الخلايا ، ويتراكم في قلب قطرات الدهون ، وبالتالي ينبعث منه مضان أخضر فاتح12. على عكس النيل الأحمر ، فإن BODIPY 493/503 غير حساس لقطبية البيئة وقد ثبت أنه أكثر انتقائية ، لأنه يعرض سطوعا عاليا لتصوير LD. من أجل تلطيخ LDs المحايدة ، يمكن استخدام هذه الصبغة في الخلايا الحية أو الثابتة وتقترن بنجاح بطرق تلطيخ و / أو وضع العلامات الأخرى42. ميزة أخرى للصبغة هي أنها تتطلب القليل من الجهد لوضعها في محلول ومستقرة ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى إعدادها حديثا لكل تجربة42. على الرغم من أن مسبار BODIPY 493/503 قد تم استخدامه بنجاح لتصور توطين وديناميكيات LDs في مزارع الخلايا ، فقد أظهرت بعض التقارير أيضا الاستخدام الموثوق لهذه الصبغة كأداة تصوير LD في الأنسجة بما في ذلك عضلة الأوعية الدموية البشرية43 ، وعضلة الفئران الوحيدة 42 ، وأمعاء الفأر44.
هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على BODIPY 493/503 كنهج تحليلي بديل لتقييم رقم LD ومساحته وقطره في عينات الكبد من نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي. يغطي هذا الإجراء تحضير عينة الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وظروف التلوين ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل هيئة رعاية الحيوان التابعة لمعهد كويمبرا للبحوث السريرية والطبية الحيوية (iCBR) (ORBEA ، # 9/2018) وامتثلت للتوجيهات الوطنية والأوروبية لرعاية الحيوان ومع إرشادات ARRIVE.
1. التصميم التجريبي
- ذكور فئران Wistar البالغة من العمر 13 أسبوعا في أقفاص جيدة التهوية في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة لدرجة الحرارة (22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) والرطوبة (50٪ -60٪) والضوء (12 ساعة دورة الضوء والظلام ) ومع الوصول إلى مياه الصنبور وتشاو القوارض القياسية.
- بعد فترة 2 أسبوع من التأقلم ، تعيين الفئران بشكل تعسفي إلى مجموعتين.
- قم بتغذية المجموعة الضابطة (CTRL ، n = 6) ومجموعات النظام الغذائي عالية الدهون (HFD ، n = 6) مع تشاو قياسي ونظام غذائي عالي الدهون (45٪ كيلو كالوري / دهون) ، على التوالي ، لمدة 24 أسبوعا.
- مراقبة وزن الجسم (BW) أسبوعيا. سجل استهلاك الأطعمة والمشروبات يوميا لكل قفص.
2. تحضير عينة الكبد
- تشريح الكبد
- تحضير المضخة التمعجية: قم بتشغيل 70٪ من الإيثانول عبر الأنبوب ، وقم بتوصيل إبرة 27 جم بنهاية مخرج الأنبوب ، وقم بتجهيز الأنبوب بمحلول ملحي بارد (4 درجات مئوية) 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة ~ 7.4) (على سبيل المثال ، 200 دورة في الدقيقة على مضخة تمعجية مع أنبوب سيليكون 1.6 مم معرف ، مجموعة تنقيط صغيرة IV). اضبط وزن الجسم (على سبيل المثال ، بالنسبة للفأر 100-150 جم ، استخدم معدل تدفق يبلغ حوالي 10-12 مل / دقيقة).
- تخدير الجرذ عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام بروتوكول التخدير (التركيز النهائي للكيتامين = 75 ملغم / كغم ، والتركيز النهائي للميديتوميدين = 1 ملغم / كغم).
ملاحظة: تأكد من تخدير الجرذ تماما باستخدام طريقة استجابة قرصة إصبع القدم. - ضع الجرذ على صينية التشريح.
- قم بتطهير الفراء جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول ، وجففه بمنشفة ورقية.
- باستخدام المقص ، قم بعمل شق على شكل حرف "U" عبر الجلد ، واقطعه أسفل الحجاب الحاجز. ثم ، قم بقص القفص الصدري بشكل دائري على الحواف لفضح القلب.
- أثناء تشغيل 1x PBS ، مرر الإبرة عبر البطين الأيسر إلى الشريان الأورطي الصاعد ، والمشبك. بعد ذلك ، يتم قطع الأذين الأيمن للسماح بالتصريف بمجرد بدء التروية.
ملاحظة: يجب أن يبدأ الكبد في التبييض حيث يتم استبدال الدم ب PBS. - باستخدام المقص وملقط Dumont ، قم بإزالة الكبد بعناية ، واشطفه باستخدام 1x PBS.
- نقل الكبد إلى طبق بتري ، ووزنه.
- باستخدام مشرط ، اجمع عينات الأنسجة الكبدية بسمك 5 مم من الجانب الجانبي (1 سم من الحافة) من الفص الأيسر للكبد لعملية التضمين.
ملاحظة يمكن تخزين الأنسجة المتبقية في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- تضمين أنسجة الكبد
- قم بإعداد وعاء ثلج جاف ، وقم بتسمية قوالب التبريد بشكل صحيح بمعرف العينة والاتجاه.
- ضع بضع قطرات من مصفوفة التضمين بالتبريد على وسط cryomold لعمل درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
- تأكد من توجيه عينة الأنسجة بشكل صحيح لقسم عرضي.
ملاحظة: تأكد من أن الجانب الذي يلامس الجزء السفلي من cryomold هو الجانب الذي سيتم تقسيمه أولا. - قم بإسقاط المزيد من OCT بعناية على cryomold حتى يتم تغطيته بالكامل. حاول تجنب تكوين فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر ، باستخدام ملقط عادي ، قم بإزالة أي فقاعات داخل OCT.
- ضع cryomold بسرعة مع العينة المغطاة OCT في وعاء ثلج جاف.
ملاحظة: يمكن تخزين الأنسجة في -80 درجة مئوية لمدة 3 سنوات.
3. تقسيم الأنسجة المجمدة
- اضبط درجة حرارة cryostat (الغرفة: -21 درجة مئوية ؛ العينة: -18 درجة مئوية) ، وأدخل شفرة معقمة جديدة.
- ضع العينات في جهاز التبريد لمدة 30 دقيقة قبل السماح لتوازن درجة الحرارة.
- اصنع طبقة واحدة من OCT على قرص العينة للسماح بالتصاق العينة. اسمح ل OCT بالتجميد ، وقم بتركيب عينة الأنسجة في الاتجاه المطلوب.
ملاحظة: يجب أن يكون سطح القطع موازيا للشفرة. للحفاظ على التصاق جيد ، ضع مستخرج الحرارة أعلى العينة. يمكن أيضا تنفيذ الخطوات السابقة في وعاء ثلج جاف به ثلج جاف. - ضع العينة في رأس العينة ، وقم بقص سطح الأنسجة (بضعة أقسام عينة من الأنسجة 30 ميكرومتر).
- بمجرد الوصول إلى منطقة الاهتمام للتقسيم ، قم بقطع أقسام بسمك 12 ميكرومتر ، وضعها على شرائح مجهرية مصنفة محفوظة في درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: لجمع القسم، حرك الشريحة ببطء نحو قسم الأنسجة. يمكن لكل شريحة جمع قسمين من الكبد. - اترك الشرائح تجف لمدة 10 دقائق في RT.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة 6-12 شهرا أو عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 سنوات.
4. تلطيخ بوديبي
- قم بإذابة الشرائح في نظام تلطيخ الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة.
- يغسل مع 1x PBS (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).
- ضع دائرة حول القسم بطبقة كارهة للماء باستخدام قلم حاجز.
- تحضير محلول مخزون BODIPY 493/503 500 ميكروغرام / مل: قم بإذابة 1 مجم من BODIPY 493/503in 2 مل من المذيب (90٪ DMSO ؛ 10٪ 1x PBS). يحفظ بعيدا عن الضوء. Sonicate في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 ساعة (9.5-10 W) عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل. - قم بإعداد محلول تلطيخ BODIPY (1 ميكروغرام / مل) بإضافة 2 ميكرولتر من محلول مخزون BODIPY 493/503 و 0.1 ميكرولتر من محلول مخزون DAPI (5 مجم / مل) إلى 997.9 ميكرولتر من 1x PBS.
- احتضان الشرائح (75 ميكرولتر / شريحة) باستخدام BODIPY 493/503 (1 ميكروغرام / مل) و DAPI (0.1 ميكروغرام / مل) في RT لمدة 40 دقيقة.
ملاحظة: احتفظ بالشرائح في الظلام من هذه الخطوة فصاعدا. - اغسل الشرائح باستخدام 1x PBS (3x لمدة 5 دقائق لكل منهما).
- قم بتركيب الشرائح باستخدام أغطية باستخدام وسيط تثبيت مضان ، واتركها تجف لمدة 30 دقيقة ، وأغلقها بطلاء الأظافر.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى التصوير.
5. تحديد كمية الدهون
- قم بقياس مستويات الكوليسترول الكلي في الدم و TG باستخدام طريقة ومعدات تلقائية تم التحقق من صحتها.
- قم بقياس مستويات TG الكبدية باستخدام مجموعة الفحص اللوني للدهون الثلاثية (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
6. الحصول على الصور
- ضع الشريحة على حامل شرائح المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر.
- لتصور الصورة والحصول عليها ، استخدم مجهرا متحد البؤر بعدسة موضوعية 20x (plan-apochromat: 20x / 0.8).
- لتجنب الحديث المتبادل بين BODIPY 493/503 و DAPI ، استخدم وضع المسح المتسلسل (أفضل إشارة) على البرنامج البؤري.
- قم بإثارة BODIPY 593/503 باستخدام خط ليزر الأرجون 488 نانومتر و DAPI باستخدام خط الليزر 405 نانومتر. اضبط نطاقات الانبعاثات عند 493-589 نانومتر ل BODIPY 493/503 وعند 410-464 نانومتر ل DAPI.
- استخدم الإعدادات التالية: الثقب: 1 وحدة فلكية، الدقة: 1024 بكسل × 1024 بكسل، عمق البت: 12، حجم البكسل: 0.415 ميكرومتر، الوضع ثنائي الاتجاه، سرعة المسح الضوئي: 7 (~ 1.58 ميكرو ثانية/بكسل لهدف 20x)، متوسط الخط: 2x، والتكبير الرقمي: 1.
ملاحظة: يجب تحسين معلمات المسح المذكورة أعلاه لكل مجهر متحد البؤر والهدف المستخدم. - اضبط الكسب والكسب الرقمي بشكل مناسب بحيث لا يتم اكتشاف أي وحدات بكسل مشبعة على مؤشر النطاق.
ملاحظة: قم بتصحيح إشارة الخلفية عن طريق ضبط الإزاحة. - بمجرد تحديد LDs بشكل صحيح ، احصل على الصورة باستخدام قنوات BODIPY و DAPI.
ملاحظة: يجب التقاط جميع الصور في نفس الظروف (التعرض والإعدادات العامة) لكل قناة لون. - لإنشاء صور واسعة المساحة (الشكل 2) ، قم بتغيير الهدف إلى عدسة موضوعية a10x (مخطط نيوفلور: 10x / 0.3).
- حدد وضع مسح التجانب ، وقم بعمل فسيفساء من 5 لكل 5 صور.
ملاحظة: في هذا العمل ، كان لكل بلاطة تداخل بنسبة 10٪ من أجل دمج المربعات بشكل مناسب للتحليل. - لإنشاء طرق عرض ثلاثية الأبعاد ومتعامدة (الشكل 3 أ) ، ضع قطرة من زيت الغمر أعلى زجاج الغطاء ، وقم بتغيير الهدف إلى عدسة موضوعية 40x (مخطط نيوفلور: زيت 40x / 1.30).
- حدد وضع Z-Stack ، وبضبط مستوى Z ، حدد المواضع الأولى والأخيرة للاكتساب باستخدام شريحة بصرية بسمك مثالي (~ 0.5 ميكرومتر) لضمان التقاط جميع القطرات.
ملاحظة: لتسريع الحصول على الصورة وتجنب التبييض ، يمكن ضبط الشريحة الضوئية على حجم دون المستوى الأمثل ، مما يضمن أخذ عينات زائدة بنسبة 30٪ على الأقل لإعادة بناء ثلاثية الأبعاد جيدة. - حدد وحدة Ortho ، وقم بإنشاء طرق عرض متعامدة.
- احصل على صور ثلاثية الأبعاد عن طريق تحديد الوحدة ثلاثية الأبعاد بعد وضع تقديم الشفافية باستخدام برنامج المجهر متحد البؤر.
7. تحليل الصور
- معالجة وتحليل الصور أحادية المستوى (تكبير 20x) باستخدام CellProfiler (الإصدار 4.2.5).
ملاحظة: تم تكييف خط الأنابيب المستخدم في هذا العمل من Adomshick et al.45. - انقر فوق وحدة الصور في الزاوية العلوية اليسرى من نافذة CellProfiler ، وقم بتحميل الصور كملفات .tiff.
- استخدم الوحدة النمطية NamesAndTypes للفرز بين الصور الملطخة BODIPY- (قطرة) و DAPI- (النوى) بناء على أسماء الملفات. قم بإجراء تحليل LD فقط مع الصور الملطخة ب BODIPY.
- لبدء إنشاء خط الأنابيب ، انقر فوق ضبط الوحدات النمطية ، وحدد الوحدة النمطية ColorToGray لتحويل الصور إلى صور ذات تدرج رمادي.
ملاحظة: لتحديد الكائنات، يلزم وجود صور بتدرج الرمادي. - حدد القطرات باستخدام وحدة IdentifyPrimaryObjects باستخدام صورة التدرج الرمادي.
ملاحظة: يجب ضبط المعلمات في هذه الوحدة لتحقيق تحديد جيد ل LD. في هذا العمل ، أدى تحديد LDs بحجم يتراوح بين 6 بكسل و 300 بكسل وعامل تصحيح عتبة 1.0 إلى تحديد الهوية الأكثر دقة. - لقياس كثافة البكسل لقطرات الدهون المحددة ، أضف وحدة MeasureObjectIntensity .
- أضف وحدة FilterObjects إضافية لضمان تحديد الإشارات الأقوى فقط بينما يتم استبعاد الإشارات الأقل كثافة من تحليل قطرات الدهون النهائي (الحد الأدنى للشدة: 0.15 ؛ الحد الأقصى للشدة: 1 وحدة تعسفية).
- لقياس LDs المتعلقة ببيانات الإخراج ، أضف الوحدة النمطية MeasureObjectSizeShape .
- أضف وحدة OverlayOutlines في هذه المرحلة لتراكب المعالجة التجميعية المحددة على الصورة الأصلية ، وبالتالي ، تأكد من أن التجزئة تبدو دقيقة على الصورة غير المعالجة أيضا.
ملاحظة: هذه خطوة اختيارية (مراقبة الجودة). - أضف وحدة ExportToSpreadsheet في النهاية ، وانقر فوق الزر "تحليل الصور " في الزاوية اليسرى السفلية.
8. التحليل الإحصائي
- عبر عن النتائج كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (S.E.M.) باستخدام أي تطبيق برنامج تحليل إحصائي.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام برنامج GraphPad للتحليل الإحصائي. - تحليل توزيع القيم باستخدام اختبار Kolmogorov-Smirnov لتقييم الانحرافات الكبيرة عن الحالة الطبيعية. تحليل البيانات البارامترية باستخدام اختبار t غير المزاوج للطالب.
ملاحظة: اعتبرت قيم p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب أن يؤدي التنفيذ الناجح لهذه التقنية إلى تلطيخ واضح لقطرات الدهون للتوصيف المتزامن لمورفولوجيا LD (الشكل وكثافة لب الدهون بناء على إعادة البناء ثلاثية الأبعاد) جنبا إلى جنب مع توزيعها المكاني ، والعدد لكل مساحة إجمالية ، ومتوسط الحجم (تم تقييمه باستخدام خط الأنابيب الموصوف أعلاه ، الشكل 1).
الشكل 1: معالجة الصور باستخدام CellProfiler . (أ) الصورة الأصلية ل LDs الملطخة ب BODIPY 493/503 (أخضر) ونوى ملطخة ب DAPI (أزرق) في مجموعة CTL. (ب) تم تراكب LDs المتمايزة (أرجواني) لمجموعة CTL باستخدام وحدة OverlayOutlines . (C) الصورة الأصلية ل LDs الملطخة ب BODIPY 493/503 (أخضر) ونوى ملطخة ب DAPI (أزرق) في مجموعة HFD. (د) تم تراكب LDs المتمايزة (أرجواني) لمجموعة HFD باستخدام وحدة OverlayOutlines . تم التقاط الصور بتكبير 20x باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح نقطة الليزر. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: CTL = المجموعة الضابطة ؛ HFD = مجموعة النظام الغذائي عالية الدهون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تقييم TGs في الدم ، الكوليسترول الكلي ، LDL-c ، HDL-c ، وكذلك محتويات TG الكبدية (الجدول 1). قدمت الحيوانات التي تغذيها HFD صورة واضحة لعسر شحميات الدم ، تتميز بتراكم بارز ل TGs الكبدية (345٪ عند مقارنتها ب CTL ، p < 0.001) ، إلى جانب زيادة طفيفة في مستويات TG المتداولة (129٪ عند مقارنتها ب CTL ، p > 0.05).
| البارامتر | سي تي ال | هفد | |
| مصل | |||
| الكوليسترول الكلي (ملغم / ديسيلتر) | 56.67 ± 9.35 | 80.40 ± 7.45 | |
| LDL (ملغم / ديسيلتر) | 7.66 ± 0.84 | 7.40 ± 1.03 | |
| HDL (ملغم / ديسيلتر) | 17.83 ± 2.93 | 28.40 ± 2.40 * | |
| الدهون الثلاثية (ملغم / ديسيلتر) | 154.8 ± 40.17 | 201.2 ± 38.12 | |
| كبد | |||
| الدهون الثلاثية (ملغم / جم) | 15.29 ± 1.31 | 52.83 ± 6.73 *** |
الجدول 1: TGs في الدم ، الكوليسترول الكلي ، LDL-c ، HDL-c ، ومحتويات TG الكبدية. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM (n = 5-6 لكل مجموعة). p < 0.001 مقابل CTL. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير المزاوج للطالب. الاختصارات: CTL = المجموعة الضابطة ؛ HFD = مجموعة النظام الغذائي عالية الدهون.
يوضح الشكل 2 صورا تمثيلية واسعة المنطقة (مسح البلاط بهدف 10x) لأقسام الكبد التي تكون فيها LDs ملطخة ب BODIPY 493/503 (أخضر) وتكون النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). تم تصور LDs الفردية من مختلف الأحجام بنجاح مع تلطيخ BODIPY 493/503 ، والذي أظهر نمط توزيع واسع النطاق في الحيوانات التي تتغذى على HFD.
الشكل 2: صور تمثيلية لتراكم LD في الأنسجة الكبدية. LDs ملطخة ب BODIPY 493/503 (أخضر) ، ونوى ملطخة ب DAPI (أزرق). تم التقاط الصور بتكبير 10x باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح نقطة الليزر. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: CTL = المجموعة الضابطة ؛ HFD = مجموعة النظام الغذائي عالية الدهون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يوضح الشكل 3A إسقاطات متعامدة تمثيلية ذات هدف 20x وصور ثلاثية الأبعاد مع هدف 40x من LDs الكبدية. تمت معالجة الصور أحادية المستوى وتحليلها بواسطة CellProfiler (الإصدار 4.2.5) لتقييم شدة التألق والعدد والمساحة وقطر LCs (الشكل 3B-E). كان من الممكن تأكيد أن الحيوانات التي تغذت على HFD أظهرت عددا متزايدا من LDs الكبدية (151٪ مقابل CTL ، الشكل 3B) ، وقد تم تأكيد ذلك من خلال شدة مضان BODIPY 493/503 المعززة (182٪ مقابل CTL ، p < 0.001 ، الشكل 3C). علاوة على ذلك ، تضاعفت نسبة مساحة LDs ثلاث مرات تقريبا (360٪ مقابل CTL ، p < 0.0001 ، الشكل 3D) لأنها قدمت أقطار أكبر (182٪ مقابل CTL ، الشكل 3E) في الحيوانات التي تتغذى على HFD. لتقييم توزيع الحجم ، تم تصنيف LDs إلى ثلاث مجموعات وفقا لنطاقات القطر: 1 ميكرومتر < د ≤ 3 ميكرومتر ، 3 ميكرومتر < د ≤ 9 ميكرومتر ، و d > 9 ميكرومتر (الشكل 3F). أظهرت الحيوانات التي تغذت على HFD زيادة أكبر من 20٪ في عدد LDs الكبدية الحويصلية الكبيرة الحجم (d > 9 μm ، p < 0.0001) إلى جانب انخفاض ما يقرب من ثلاثة أضعاف في عدد الحويصلات الدقيقة التي يقل قطرها عن 3 ميكرومتر (1 ميكرومتر < d ≤ 3 μm ، p < 0.0001).
الشكل 3: طرق عرض متعامدة / ثلاثية الأبعاد ل LDs وتحليل البيانات. (أ) إسقاطات متعامدة تمثيلية وصور ثلاثية الأبعاد لقطرات الدهون الكبدية (خضراء ، BODIPY 493/503) ونوى (زرقاء ، DAPI) في كبد الفئران التي تغذت على نظام غذائي طبيعي أو HFD. تم التقاط الصور بتكبير 20x (يسار) و 40x (يمين) باستخدام مجهر متحد البؤر لمسح نقطة الليزر. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. ب: عدد المنخفضات الجليدية الكبدية. ج: شدة مضان الإضاءة. د: نسبة مساحة المنخفضات الأرضية الكبدية. ه: أقطار قطرات الليبيدات. (F) النسب الكسرية لمجموعات من قطرات الدهون الكبدية بأقطار مختلفة: 1 ميكرومتر < د ≤ 3 ميكرومتر ، 3 ميكرومتر < د ≤ 9 ميكرومتر ، و d > 9 ميكرومتر. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. n = 5-6 الفئران / المجموعة ؛ * ع < 0.05 ، ** ع < 0.01 ، *** ص < 0.001 ، **** ص < 0.0001. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير المزاوج للطالب. الاختصارات: CTL = المجموعة الضابطة ؛ HFD = مجموعة النظام الغذائي عالية الدهون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يهدف هذا البروتوكول القائم على مضان BODIPY 493/503 لتقييم LD إلى تطوير نهج تصوير جديد لتقييم التنكس الدهني الكبدي. نظرا للعلاقة القوية بين السمنة وأمراض الكبد الدهنية ، تم استخدام النظام الغذائي عالي الدهون على النمط الغربي لإنشاء نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي26. تم تأكيد زيادة قوية في محتويات TG الكبدية من خلال مجموعة الفحص اللوني للدهون الثلاثية الكمية ، والتي اقترحت سيناريو دهني كبدي مرتفع في الحيوانات التي تتغذى على HFD. بعد ذلك ، تم تصور درجة تراكم LD بواسطة مسبار الفلورسنت BODIPY 493/503 تحت التكبير المنخفض. كما هو متوقع ، كشف تلطيخ BODIPY 493/503 عن توزيع واسع النطاق للهياكل الحويصلية عبر الأنسجة الكبدية في مجموعة HFD. باللجوء إلى الإسقاطات المتعامدة وإعادة بناء 3D ، كان من الممكن ملاحظة أن قلب LD قدم محتوى كاملا من الدهون المحايدة ، والتي ظهرت على شكل قطرات كروية تقريبا. علاوة على ذلك ، كانت الزيادة القوية في مساحة LD لكل مساحة إجمالية واضحة (360٪ مقابل مجموعة CTL) ، ومن المرجح أن تكون هذه المنطقة مليئة ب TGs المحايدة نظرا لدرجتها الكمية في مجموعة HFD (52.83 مجم / جم ± 6.73 مجم / جم ؛ 346٪ مقابل مجموعة CTL). لمزيد من توصيف ديناميكيات LD عند تغذية HFD ، تم تحليل الطبيعة الدقيقة أو الحويصلية الكبيرة للتنكس الدهني الكبدي. باستخدام نطاقات قطر LD الموصوفة سابقا في الأدبيات4،46،47 ، كان من الممكن تمييز انخفاض كبير في عدد LD الحويصلي الدقيق (1 ميكرومتر < د ≤ 3 ميكرومتر) ، والذي يوازي الزيادة النسبية في الحويصلات الكبيرة LD (d > 9 μm). أفادت العديد من الدراسات أن LDs في خلايا الكبد يمكن أن تشكل LDs كبيرة الحجم (يصل قطرها إلى عشرات الميكرونات)4،46،47 ، وهو ما يتماشى مع النتائج الحالية.
في السنوات الأخيرة ، تم استبدال الأصباغ الدهنية الكلاسيكية تدريجيا بمجموعة جديدة من مجسات الفلورسنت المحبة للدهون ، مثل BODIPY ، نظرا لهيكلها المحايد والمستوي الذي استقر بواسطة مركب ثنائي فلوروبورون48. وقد ثبت أن هذه المجسات فعالة جدا في وضع علامات على LDs لدراسة مورفولوجيتها وديناميكياتها وتفاعلها مع العضيات الأخرى في الخلايا الحية وبعض الأنسجة الثابتة 49,50. ضمن بروتوكول قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت المقدم هنا لتقييم التنكس الدهني الكبدي ، هناك بعض الخطوات الحاسمة لنجاح التقنية التي تعتمد في الغالب على تحضير الأنسجة والحصول على الصور. نظرا لأنه يمكن تبييض إشارة BODIPY بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية51 ، يجب أن يحدث الحصول على تصوير LD قبل تصوير أصباغ الفلورسنت الأخرى التي تثيرها الأشعة فوق البنفسجية ، مثل أصباغ الفلورسنت DNA المعروفة. علاوة على ذلك ، يوصى بشدة بحماية شرائح المجهر من التعرض للضوء من أجل منع تبريد مضان BODIPY قبل التصوير. على الرغم من أن إعادة بناء 3D من LDs مفيد جدا لدراسة مورفولوجيتها ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا للغاية ، نظرا لأن الصور المعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد تتكون من عدة صور 2D مستقلة. لذلك ، يجب على الباحثين التفكير في تجنب هذه الخطوة عندما يكون الهدف الأساسي للتجربة هو فقط تقييم التنكس الدهني الكبدي الجزئي والحويصلي. لتجنب التحيز ، يجب على اثنين من المراقبين المستقلين الذين أعموا عن مجموعة العلاج إجراء الحصول على البيانات وتحليلها. يساهم برنامج معالجة الصور شبه الآلي (خط أنابيب Cell Profiler) بشكل أكبر في القياس الكمي شبه الأعمى ويتغلب على وقت المعالجة المتزايد الذي يتم ملاحظته باستمرار في التحليل اليدوي.
يمكن توسيع هذه التقنية لتشمل تطبيقات أوسع بالاقتران مع تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية للأنسجة والأنواع الأخرى ، طالما تم تحديد تركيزات BODIPY المثلى وإعدادات التقاط الصور لزيادة نسبة الإشارة / الخلفية إلى أقصى حد. قد تسمح هذه الإعدادات التجريبية بالكشف المتزامن عن مستضدات أخرى بشرط ألا يتداخل الفلوروفور الثاني المستخدم مع أطياف الإثارة / الانبعاث BODIPY.
بشكل عام ، يعد البروتوكول المحسن القائم على التألق BODIPY 493/503 المقدم هنا أداة موثوقة وبسيطة لتوصيف LD وقد يمثل نهجا تكميليا للبروتوكولات النسيجية الكلاسيكية التي غالبا ما تستخدم لتأكيد التنكس الدهني الكبدي وتصنيفه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل الصناديق الوطنية والأوروبية عبر مؤسسة العلوم والتكنولوجيا البرتغالية (FCT) ، والصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية (FEDER) ، وبرنامج العوامل التشغيلية للمنافسة (COMPETE): 2020.09481.BD ، UIDP / 04539/2020 (CIBB) ، و POCI-01-0145-FEDER-007440. يود المؤلفون أن يشكروا دعم iLAB - مختبر الفحص المجهري والتصوير الحيوي ، وهو مرفق تابع لكلية الطب بجامعة كويمبرا وعضو في البنية التحتية الوطنية PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122) ، بالإضافة إلى الدعم من FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
References
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L.
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P.
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
