Summary
En este documento, demostramos un protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la caracterización de gotas de lípidos en el tejido hepático. Mediante el uso de proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, el fluoróforo permite una discriminación exitosa entre esteatosis microvesicular y macrovesicular y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos para la evaluación de esteatosis hepática.
Abstract
Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos especializados que median el almacenamiento de lípidos y desempeñan un papel muy importante en la supresión de la lipotoxicidad y la prevención de la disfunción causada por los ácidos grasos libres (FA). El hígado, dado su papel crítico en el metabolismo de las grasas del cuerpo, está persistentemente amenazado por la acumulación intracelular de LD en forma de esteatosis hepática microvesicular y macrovesicular. La caracterización histológica de los LD se basa típicamente en colorantes diazo solubles en lípidos, como la tinción Oil Red O (ORO), pero una serie de desventajas dificultan consistentemente el uso de este análisis con muestras de hígado. Más recientemente, los fluoróforos lipofílicos 493/503 se han vuelto populares para visualizar y localizar LD debido a su rápida absorción y acumulación en el núcleo de gotas de lípidos neutros. Aunque la mayoría de las aplicaciones están bien descritas en cultivos celulares, hay menos evidencia que demuestre el uso confiable de sondas de fluoróforos lipofílicos como una herramienta de imagen LD en muestras de tejido. En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en diprometeno de boro (BODIPY) 493/503 para la evaluación de LD en muestras de hígado de un modelo animal de esteatosis hepática inducida por dieta alta en grasas (HFD). Este protocolo cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, la tinción BODIPY 493/503, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Demostramos un aumento del número, la intensidad, la relación de área y el diámetro de LD hepáticas al alimentarse con HFD. Usando proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, fue posible observar el contenido completo de lípidos neutros en el núcleo LD, que aparecieron como gotitas casi esféricas. Además, con el fluoróforo BODIPY 493/503, pudimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermedias (3 μm < d ≤ 9 μm) y macrovesículas (d > 9 μm), permitiendo la discriminación exitosa de esteatosis microvesicular y macrovesicular. En general, este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 es una herramienta fiable y sencilla para la caracterización hepática de LD y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos.
Introduction
Las gotas de lípidos (LD), clásicamente vistas como depósitos de energía, son orgánulos celulares especializados que median el almacenamiento de lípidos, y comprenden un núcleo lipídico neutro hidrófobo, que contiene principalmente ésteres de colesterol y triglicéridos (TG), encapsulados por una monocapa de fosfolípidos 1,2,3.
La biogénesis de LD ocurre en el retículo endoplásmico (RE), comenzando con la síntesis de triacilglicerol (TAG) y ésteres de esteroles. Los lípidos neutros se difunden entre las valvas de la bicapa ER a bajas concentraciones, pero se unen en lentes de aceite que crecen y brotan en gotitas casi esféricas de la membrana ER cuando su concentración intracelular aumenta4. Posteriormente, las proteínas de la bicapa ER y el citosol, particularmente la familia de proteínas perilipina (PLIN), se translocan a las superficies de las LD para facilitar la gemación 5,6,7,8,9.
A través de la síntesis de nuevos ácidos grasos y la fusión o coalescencia de LD, los LD crecen en diferentes tamaños. En consecuencia, el tamaño y el número de LD difieren considerablemente entre los diferentes tipos de células. Las pequeñas gotas (300-800 nm de diámetro), que se conocen como LD iniciales (iLDs), pueden ser formadas por casi todas las células4. Más adelante en la formación de LD, la mayoría de las células son capaces de convertir algunos iLD en LD más grandes que se expanden (eLD >1 μm de diámetro). Sin embargo, solo tipos celulares específicos, como los adipocitos y los hepatocitos, tienen la capacidad de formar LD gigantes o de gran tamaño (hasta decenas de micras de diámetro)4,10.
Las LD juegan un papel muy importante en la regulación del metabolismo lipídico celular, suprimiendo la lipotoxicidad y previniendo el estrés del RE, la disfunción mitocondrial y, en última instancia, la muerte celular causada por ácidos grasos libres (AF)11,12,13,14. Además, las LD también han sido implicadas en la regulación de la expresión génica, el secuestro de proteínas de replicación viral y el tráfico y señalización de membranas15,16,17. Por lo tanto, la mala regulación de la biogénesis de LD es un sello distintivo de las enfermedades crónicas asociadas con el síndrome metabólico, la obesidad, la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y / o la arteriosclerosis, por nombrar solo algunas 18,19,20.
El hígado, como centro metabólico, es el principal responsable del metabolismo de los lípidos mediante el almacenamiento y procesamiento de lípidos, y, por lo tanto, está constantemente amenazado por la lipotoxicidad21. La esteatosis hepática (HS) es una característica común de una serie de enfermedades hepáticas progresivas y se caracteriza por una acumulación excesiva de lípidos intracelulares en forma de LD citosólicas que, en última instancia, pueden conducir a disfunción metabólica hepática, inflamación y formas avanzadas de enfermedad del hígado graso no alcohólico22,23,24,25. La HS ocurre cuando la tasa de oxidación de ácidos grasos y exportación como triglicéridos dentro de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) es menor que la tasa de absorción de ácidos grasos hepáticos de la síntesis plasmática y de novo de ácidos grasos26. La acumulación hepática de lípidos ocurre a menudo en dos formas, esteatosis microvesicular y macrovesicular, y éstas presentan características citoarquitectónicas distintas27. Típicamente, la esteatosis microvesicular se caracteriza por la presencia de pequeñas LDs dispersas por todo el hepatocito con el núcleo colocado centralmente, mientras que la esteatosis macrovesicular se caracteriza por la presencia de una sola LD grande que ocupa la mayor parte del hepatocito, empujando el núcleo hacia la periferia28,29. En particular, estos dos tipos de esteatosis a menudo se encuentran juntos, y no está claro cómo estos dos patrones de LD influyen en la patogénesis de la enfermedad, ya que la evidencia aún es inconsistente31,32,33,34. Sin embargo, ese tipo de análisis se emplea a menudo como un "estándar de referencia" en estudios preclínicos y clínicos para comprender el comportamiento dinámico de los LD y caracterizar la esteatosis hepática 29,34,35,36.
Las biopsias hepáticas, el estándar de oro para diagnosticar y clasificar la HS, se evalúan rutinariamente mediante análisis histológico de hematoxilina y eosina (H&E), donde las gotitas de lípidos se evalúan como vacuolas no teñidas en secciones hepáticas teñidas con H&E37. Aunque aceptable para la evaluación de la esteatosis macrovesicular, este tipo de tinción generalmente estrecha la evaluación de la esteatosis microvesicular38. Los colorantes diazosolubles en lípidos, como Oil Red O (ORO), se combinan clásicamente con microscopía de campo claro para analizar las reservas de lípidos intracelulares, pero todavía tienen una serie de desventajas: (i) el uso de etanol o isopropanol en el proceso de tinción, que a menudo causa la interrupción de los LD nativos y la fusión ocasional a pesar de que las células están fijadas39; ii) el carácter lento, ya que la solución ORO requiere la disolución y el filtrado del polvo fresco debido a la vida útil limitada, lo que contribuye a resultados menos consistentes; (iii) y el hecho de que ORO tiñe más que solo gotas lipídicas y a menudo sobreestima la esteatosis hepática38.
En consecuencia, los fluoróforos lipofílicos permeables a las células, como el rojo del Nilo, se han utilizado en muestras vivas o fijas para superar algunas de las limitaciones antes mencionadas. Sin embargo, la naturaleza no específica del etiquetado de orgánulos lipídicos celulares reduce repetidamente las evaluaciones de LD40. Además, las propiedades espectrales del Rojo del Nilo varían según la polaridad del medio ambiente, lo que a menudo puede conducir a cambios espectrales41.
La sonda fluorescente lipofílica 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno (longitud de onda de excitación: 480 nm; emisión máxima: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibe características de hidrofobicidad que permiten su rápida absorción por LD intracelular, se acumula en el núcleo de gotas lipídicas y, posteriormente, emite fluorescencia verde brillante12. A diferencia del Nile Red, BODIPY 493/503 es insensible a la polaridad del entorno y se ha demostrado que es más selectivo, ya que muestra un alto brillo para imágenes LD. Para teñir LDs neutros, este colorante puede ser utilizado en células vivas o fijas y acoplado con éxito con otros métodos de tinción y/o etiquetado42. Otra ventaja del tinte es que requiere poco esfuerzo para colocarlo en una solución y es estable, eliminando así la necesidad de prepararlo recién para cada experimento42. A pesar de que la sonda BODIPY 493/503 se ha empleado con éxito para visualizar la localización y la dinámica de LD en cultivos celulares, algunos informes también han demostrado el uso confiable de este colorante como una herramienta de imagen LD en tejidos, incluido el músculo vasto lateral humano43, el músculo sóleo de rata42 y el intestino de ratón44.
En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en BODIPY 493/503 como un enfoque analítico alternativo para la evaluación del número, área y diámetro de LD en muestras hepáticas de un modelo animal de esteatosis hepática. Este procedimiento cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, las condiciones de tinción, la adquisición de imágenes y el análisis de datos.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Instituto Coimbra de Investigación Clínica y Biomédica (iCBR) Organismo de Bienestar Animal (ORBEA, # 9 / 2018) y cumplieron con las Directivas Nacionales y Europeas de Cuidado de Animales y con las directrices ARRIVE.
1. Diseño experimental
- Parejas de ratas Wistar macho de 13 semanas de edad en jaulas ventiladas en condiciones ambientales controladas de temperatura (22 °C ± 1 °C), humedad (50%-60%) y luz (ciclo luz-oscuridad de 12 h) y con acceso ad libitum al agua del grifo y comida estándar para roedores.
- Después de un período de aclimatación de 2 semanas, asigne arbitrariamente a las ratas en dos grupos.
- Alimente a los grupos de control (CTRL, n = 6) y dieta alta en grasas (HFD, n = 6) con comida estándar y una dieta alta en grasas (45% kcal / grasa), respectivamente, durante 24 semanas.
- Controle el peso corporal (PC) semanalmente. Registre el consumo diario de alimentos y bebidas por jaula.
2. Preparación de la muestra de hígado
- Disección hepática
- Prepare la bomba peristáltica: Pase etanol al 70% a través del tubo, conecte una aguja de 27 G al extremo de salida del tubo y prepare el tubo con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH ~ 7.4) (por ejemplo, 200 rpm en una bomba peristáltica con tubo de silicio I.D. de 1.6 mm, mini juego de goteo IV). Ajuste el peso corporal (por ejemplo, para una rata de 100-150 g, use un caudal de aproximadamente 10-12 ml / min).
- Anestesiar a la rata mediante una inyección intraperitoneal utilizando un protocolo de anestesia (la concentración final de ketamina = 75 mg / kg y la concentración final de medetomidina = 1 mg / kg).
NOTA: Asegúrese de que la rata esté completamente anestesiada usando el método de respuesta de pellizco del dedo del pie. - Coloque la rata en la bandeja de disección.
- Desinfecte bien el pelaje con etanol al 70% y séquelo con una toalla de papel.
- Con unas tijeras, haga una incisión en forma de "U" a través de la piel y córtela por debajo del diafragma. Luego, corte la caja torácica rostralmente en los bordes para exponer el corazón.
- Mientras el PBS 1x está funcionando, pase la aguja a través del ventrículo izquierdo hasta la aorta ascendente y la pinza. Luego, se corta la aurícula derecha para permitir el drenaje una vez que la perfusión ha comenzado.
NOTA: El hígado debe comenzar a blanquearse a medida que la sangre se reemplaza con PBS. - Usando tijeras y pinzas Dumont, retire el hígado con cuidado y enjuague con 1x PBS.
- Transfiera el hígado a una placa de Petri y péselo.
- Usando un bisturí, recolecte muestras de tejido hepático de 5 mm de espesor desde el lado lateral (1 cm del borde) del lóbulo izquierdo del hígado para el proceso de incrustación.
NOTA El tejido restante se puede almacenar a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
- Incrustación de tejido hepático
- Prepare un recipiente de hielo seco y etiquete adecuadamente los criomoldes con la identificación y orientación de la muestra.
- Coloque unas gotas de matriz de incrustación criogénica en el centro del criomold para obtener la temperatura de corte óptima (OCT).
- Asegúrese de que la muestra de tejido esté orientada correctamente para una sección transversal.
NOTA: Asegúrese de que el lado que toca la parte inferior del criomold sea el lado que se seccionará primero. - Deje caer con cuidado más OCT sobre el criomold hasta que esté completamente cubierto. Trate de evitar la formación de burbujas de aire. Si es necesario, con pinzas simples, retire cualquier burbuja dentro de la OCT.
- Coloque rápidamente el criomold con la muestra cubierta de OCT en un recipiente de hielo seco.
NOTA: Los tejidos pueden almacenarse a −80 °C durante 3 años.
3. Sección de tejido congelado
- Ajuste la temperatura del criostato (cámara: -21 °C; muestra: -18 °C) e inserte una nueva cuchilla estéril.
- Coloque las muestras en el criostato durante 30 minutos antes de permitir que la temperatura se equilibre.
- Haga una sola capa de OCT en el disco de la muestra para permitir la adhesión de la muestra. Deje que la OCT se congele y monte la muestra de tejido en la orientación deseada.
NOTA: La superficie de corte debe ser paralela a la cuchilla. Para mantener una buena adherencia, coloque el extractor de calor en la parte superior de la muestra. Los pasos anteriores también se pueden realizar en un recipiente de hielo seco con hielo seco. - Coloque la muestra en la cabeza de la muestra y recorte la superficie del tejido (algunas secciones de muestra de tejido de 30 μm).
- Una vez que la región de interés sea accesible para la sección, corte secciones de 12 μm de espesor y colóquelas en portaobjetos de microscopio etiquetados que se mantengan a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Para recoger la sección, mueva lentamente el portaobjetos hacia la sección de tejido. Cada diapositiva puede recoger dos secciones del hígado. - Deje que los portaobjetos se sequen durante 10 minutos en RT.
NOTA: Los portaobjetos se pueden almacenar a -20 °C durante 6-12 meses o a -80 °C durante un máximo de 3 años.
4. Tinción BODIPY
- Descongele los portaobjetos en un sistema de tinción de portaobjetos a RT durante 30 min.
- Lavar con 1x PBS (3x durante 5 min cada uno).
- Rodee la sección con una capa hidrófoba con un bolígrafo de barrera.
- Preparar 500 μg/ml de solución madre de BODIPY 493/503: Disolver 1 mg de BODIPY 493/503 en 2 ml de disolvente (90% DMSO; 10% 1x PBS). Proteger de la luz. Sonicar en un baño ultrasónico durante 1 h (9.5-10 W) a 37 °C.
NOTA: La solución puede conservarse a -20 °C durante al menos 30 días. - Preparar la solución de tinción BODIPY (1 μg/ml) añadiendo 2 μL de solución madre BODIPY 493/503 y 0,1 μL de solución madre DAPI (5 mg/ml) a 997,9 μL de 1x PBS.
- Incubar los portaobjetos (75 μL/portaobjetos) con BODIPY 493/503 (1 μg/ml) y DAPI (0,1 μg/ml) a RT durante 40 min.
NOTA: Mantenga las diapositivas en la oscuridad desde este paso en adelante. - Lave las diapositivas con 1x PBS (3x durante 5 minutos cada una).
- Monte las guías con cubreobjetos utilizando un medio de montaje de fluorescencia, déjelas secar durante 30 minutos y séllelas con esmalte de uñas.
NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a 4 °C hasta obtener imágenes.
5. Cuantificación de lípidos
- Mida los niveles séricos de colesterol total y TG utilizando un método y equipo automático y validado.
- Mida los niveles de TG hepática utilizando un kit de ensayo colorimétrico de triglicéridos (Tabla de materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
6. Adquisición de imágenes
- Coloque el portaobjetos en el portaobjetos del microscopio confocal de escaneo láser.
- Para la visualización y adquisición de imágenes, utilice un microscopio confocal con una lente objetivo de 20x (plano-apocromático: 20x/0.8).
- Para evitar la diafonía entre el BODIPY 493/503 y DAPI, utilice el modo de escaneo secuencial (mejor señal) en el software confocal.
- Excite el BODIPY 593/503 usando la línea láser de argón de 488 nm y el DAPI usando la línea láser de 405 nm. Establezca los rangos de emisión en 493-589 nm para BODIPY 493/503 y en 410-464 nm para DAPI.
- Utilice los siguientes ajustes: estenopeico: 1 UA, resolución: 1.024 píxeles x 1.024 píxeles, profundidad de bits: 12, tamaño de píxel: 0,415 μm, modo bidireccional, velocidad de escaneo: 7 (~1,58 μs/píxel para un objetivo de 20x), promedio de línea: 2x y zoom digital: 1.
NOTA: Los parámetros de escaneo mencionados anteriormente deben optimizarse para cada microscopio confocal y objetivo utilizado. - Establezca la ganancia y la ganancia digital adecuadamente para que no se detecten píxeles saturados en el indicador de rango.
NOTA: Corrija la señal de fondo ajustando el desplazamiento. - Una vez identificados correctamente los LDs, adquirir la imagen con los canales BODIPY y DAPI.
NOTA: Todas las imágenes deben adquirirse en las mismas condiciones (exposición y ajustes generales) para cada canal de color. - Para crear imágenes de área amplia (Figura 2), cambie el objetivo a una lente de objetivo de 10x (plan-neofluar: 10x/0.3).
- Seleccione el modo Escaneo de mosaico y haga mosaicos de imágenes de 5 por 5.
NOTA: En este trabajo, cada mosaico tenía una superposición del 10% para combinar adecuadamente los mosaicos para el análisis. - Para crear vistas 3D y ortogonales (Figura 3A), coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y cambie el objetivo a una lente de objetivo de 40x (plano-neofluar: aceite 40x/1.30).
- Seleccione el modo Z-Stack y, ajustando el plano Z, defina la primera y la última posición para la adquisición con un corte óptico con un grosor óptimo (~0,5 μm) para garantizar que se capturen todas las gotas.
NOTA: Para acelerar la adquisición de imágenes y evitar el blanqueamiento, el corte óptico se puede ajustar a un tamaño subóptimo, asegurando al menos un 30% de sobremuestreo para una buena reconstrucción 3D. - Seleccione el módulo Orto y cree vistas ortogonales.
- Adquiera imágenes 3D seleccionando el módulo 3D siguiendo el modo de representación de transparencia con el software de microscopio confocal.
7. Análisis de imágenes
- Procese y analice las imágenes de un solo plano (aumento de 20x) con CellProfiler (versión 4.2.5).
NOTA: La tubería utilizada en este trabajo fue adaptada de Adomshick et al.45. - Haga clic en el módulo Imágenes en la esquina superior izquierda de la ventana de CellProfiler y cargue las imágenes como .tiff archivos.
- Utilice el módulo NamesAndTypes para ordenar entre imágenes teñidas con BODIPY- (droplet) y DAPI- (núcleos) en función de los nombres de archivo. Realice el análisis LD solo con imágenes teñidas con BODIPY.
- Para iniciar la construcción de la canalización, haga clic en Ajustar módulos y seleccione el módulo ColorToGray para convertir las imágenes en imágenes en escala de grises.
NOTA: Para identificar objetos, se requieren imágenes en escala de grises. - Identifique gotas empleando el módulo IdentifyPrimaryObjects utilizando la imagen en escala de grises.
NOTA: Los parámetros de este módulo deben ajustarse para lograr una buena identificación de LD. En este trabajo, la definición de LD con un tamaño entre 6 píxeles y 300 píxeles y un factor de corrección de umbral de 1.0 condujo a la identificación más precisa. - Para medir la intensidad de píxeles de las gotas de lípidos identificadas, agregue un módulo MeasureObjectIntensity .
- Agregue un módulo FilterObjects adicional para garantizar que solo se cuantifiquen las señales más fuertes, mientras que las señales menos intensas se excluyen del análisis final de gotas de lípidos (intensidad mínima: 0.15; intensidad máxima: 1 unidad arbitraria).
- Para medir los LD relacionados con los datos de salida, agregue el módulo MeasureObjectSizeShape .
- Agregue un módulo OverlayOutline en este punto para superponer la gota identificada en la imagen original y, por lo tanto, asegúrese de que la segmentación también se vea precisa en la imagen sin procesar.
NOTA: Este es un paso opcional (control de calidad). - Agregue un módulo ExportToSpreadsheet al final y haga clic en el botón Analizar imágenes en la esquina inferior izquierda.
8. Análisis estadístico
- Expresar los resultados como media ± error estándar de la media (S.E.M.) utilizando cualquier aplicación de software de análisis estadístico.
NOTA: En este estudio, se utilizó el software GraphPad para el análisis estadístico. - Analice la distribución de valores utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov para evaluar desviaciones significativas de la normalidad. Analice los datos paramétricos utilizando la prueba t no pareada del estudiante.
NOTA: Los valores de p < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
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Representative Results
La ejecución exitosa de esta técnica debe resultar en una tinción clara de gotas lipídicas para la caracterización simultánea de la morfología LD (forma y densidad del núcleo lipídico basada en la reconstrucción 3D) junto con su distribución espacial, número por área total y tamaño promedio (evaluado con la tubería descrita anteriormente, Figura 1).
Figura 1: Procesamiento de imágenes de muestra con CellProfiler . (A) Imagen original de LDs teñidos con BODIPY 493/503 (verde) y núcleos teñidos con DAPI (azul) en el grupo CTL. (B) Los LD diferenciados (magenta) del grupo CTL se superpusieron utilizando el módulo OverlayConlines . (C) Imagen original de LDs teñidos con BODIPY 493/503 (verde) y núcleos teñidos con DAPI (azul) en el grupo HFD. (D) Los LD diferenciados (magenta) del grupo HFD se superpusieron utilizando el módulo OverlayOutline . Las imágenes se tomaron con un aumento de 20x utilizando un microscopio confocal de barrido de punto láser. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: CTL = grupo control; HFD = grupo de dieta alta en grasas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se evaluaron los TGs séricos, colesterol total, LDL-c, HDL-c, así como el contenido de TG hepático (Tabla 1). Los animales alimentados con HFD presentaron un perfil dislipidémico pronunciado, caracterizado por una acumulación acentuada de TG hepáticas (345% cuando se compara con CTL, p < 0,001), junto con un aumento sutil en los niveles circulantes de TG (129% en comparación con CTL, p > 0,05).
| Parámetro | CTL | HFD | |
| Suero | |||
| Colesterol total (mg/dL) | 56,67 ± 9,35 | 80,40 ± 7,45 | |
| LDL (mg/dL) | 7,66 ± 0,84 | 7,40 ± 1,03 | |
| HDL (mg/dL) | 17,83 ± 2,93 | 28,40 ± 2,40 * | |
| Triglicéridos (mg/dL) | 154,8 ± 40,17 | 201,2 ± 38,12 | |
| Hígado | |||
| Triglicéridos (mg/g) | 15.29 ± 1.31 | 52,83 ± 6,73 *** |
Tabla 1: TGs séricos, colesterol total, LDL-c, HDL-c y contenidos de TG hepática. Los datos se expresan como media ± SEM (n = 5-6 por grupo). p < 0,001 versus CTL. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t no pareada de Student. Abreviaturas: CTL = grupo control; HFD = grupo de dieta alta en grasas.
La Figura 2 muestra imágenes representativas de área amplia (exploraciones de mosaicos con un objetivo de 10x) de secciones hepáticas en las que los LD se tiñen con BODIPY 493/503 (verde) y los núcleos se tiñen con DAPI (azul). Los LD individuales de varios tamaños se visualizaron con éxito con la tinción BODIPY 493/503, que mostró un patrón de distribución generalizado en los animales alimentados con HFD.
Figura 2: Imágenes representativas de la acumulación de LD en tejido hepático. LDs teñidos con BODIPY 493/503 (verde), y núcleos teñidos con DAPI (azul). Las imágenes se tomaron con un aumento de 10x utilizando un microscopio confocal de barrido de punto láser. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: CTL = grupo control; HFD = grupo de dieta alta en grasas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 3A muestra proyecciones ortogonales representativas con un objetivo 20x e imágenes 3D con un objetivo 40x de LD hepáticas. Las imágenes de un solo plano fueron procesadas y analizadas por CellProfiler (versión 4.2.5) para evaluar la intensidad de fluorescencia, el número, el área y el diámetro de las LC (Figura 3B-E). Fue posible confirmar que los animales alimentados con HFD mostraron un mayor número de LDs hepáticas (151% vs. CTL, Figura 3B), y esto fue corroborado por la intensidad de fluorescencia aumentada BODIPY 493/503 (182% vs. CTL, p < 0,001, Figura 3C). Además, la relación de área de LDs casi se triplicó (360% vs. CTL, p < 0,0001, Figura 3D) ya que presentaron diámetros mayores (182% vs. CTL, Figura 3E) en los animales alimentados con HFD. Para evaluar la distribución del tamaño, los LD se clasificaron en tres grupos de acuerdo con los rangos de diámetro: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm y d > 9 μm (Figura 3F). Los animales alimentados con HFD mostraron un aumento superior al 20% en el número de LD hepáticas macrovesiculares de gran tamaño (d > 9 μm, p < 0,0001) junto con una reducción de casi tres veces en el número de microvesículas menores de 3 μm de diámetro (1 μm < d ≤ 3 μm, p < 0,0001).
Figura 3: Vistas ortogonales/3D de LDs y análisis de datos. (A) Proyecciones ortogonales representativas e imágenes renderizadas en 3D de gotitas lipídicas hepáticas (verde, BODIPY 493/503) y núcleos (azul, DAPI) en el hígado de ratones alimentados con una dieta normal o HFD. Las imágenes se tomaron con un aumento de 20x (izquierda) y 40x (derecha) utilizando un microscopio confocal de barrido de punto láser. Barras de escala = 20 μm. (B) Número de LD hepáticas. (C) Intensidad de fluorescencia de las LD hepáticas. (D) Relación de área de las LD hepáticas. (E) Diámetros de gotas lipídicas. (F) Proporciones fraccionarias de grupos de gotitas lipídicas hepáticas con diferentes diámetros: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm y d > 9 μm. Los datos se presentan como media ± SEM. n = 5-6 ratones/grupo; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001. El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t no pareada de Student. Abreviaturas: CTL = grupo control; HFD = grupo de dieta alta en grasas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la evaluación de LD tuvo como objetivo desarrollar un nuevo enfoque de imagen para la evaluación de la esteatosis hepática. Dada la fuerte correlación entre la obesidad y la enfermedad del hígado graso, se utilizó la dieta alta en grasas al estilo occidental para establecer un modelo animal de esteatosis hepática26. Un aumento robusto en el contenido de TG hepática fue confirmado por un kit de ensayo colorimétrico cuantitativo de triglicéridos, que sugirió un escenario de lipidosis hepática elevada en los animales alimentados con HFD. Posteriormente, el grado de acumulación de LD fue visualizado por la sonda fluorescente BODIPY 493/503 bajo aumento. Como era de esperar, la tinción BODIPY 493/503 reveló una amplia distribución de las estructuras vesiculares a través del tejido hepático en el grupo HFD. Recurriendo a proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, fue posible observar que el núcleo LD presentaba un contenido completo de lípidos neutros, que aparecían como gotitas casi esféricas. Además, el robusto aumento en el área de LD por área total fue claramente evidente (360% vs. grupo CTL), y esta área probablemente estaba llena de TG neutros dada su puntuación cuantitativa en el grupo HFD (52.83 mg / g ± 6.73 mg / g; 346% vs. grupo CTL). Para caracterizar aún más la dinámica de LD en la alimentación con HFD, se analizó la naturaleza micro o macrovesicular de la esteatosis hepática. Utilizando los rangos de diámetro de LD previamente descritos en la literatura 4,46,47, fue posible discriminar una caída significativa en el recuento de LD microvesicular (1 μm < d ≤ 3 μm), que fue paralela a un aumento proporcional de las macrovesículas de LD (d > 9 μm). Varios estudios han reportado que las LDs en hepatocitos pueden formar LDs de gran tamaño (hasta decenas de micras de diámetro)4,46,47, lo que está en línea con los resultados actuales.
En los últimos años, los colorantes lipídicos clásicos han sido sustituidos gradualmente por una nueva matriz de sondas lipofílicas fluorescentes, como BODIPY, dada su estructura neutra y plana estabilizada por un complejo de difluoroboro48; estas sondas han demostrado ser muy eficaces en el marcado de LDs para estudiar su morfología, dinámica e interacción con otros orgánulos en células vivas y algunos tejidos fijos 49,50. Dentro del protocolo de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia presentado aquí para la evaluación de la esteatosis hepática, hay algunos pasos críticos para el éxito de la técnica que se basan principalmente en la preparación de tejidos y la adquisición de imágenes. Dado que la señal BODIPY puede ser blanqueada por la luz UV51, la adquisición de imágenes LD debe ocurrir antes de obtener imágenes de otros tintes fluorescentes que son excitados por la luz UV, como los colorantes fluorescentes de ADN comúnmente conocidos. Además, se recomienda encarecidamente proteger los portaobjetos del microscopio de la exposición a la luz para evitar que BODIPY se apague por fluorescencia antes de la obtención de imágenes. Aunque la reconstrucción 3D de los LD es muy útil para el estudio de su morfología, consume mucho tiempo, ya que las imágenes reconstruidas en 3D se componen de varias imágenes 2D independientes. Por lo tanto, los investigadores deben considerar evitar este paso cuando el objetivo principal del experimento es únicamente la evaluación de la esteatosis hepática micro y macrovesicular. Para evitar sesgos, dos observadores independientes cegados al grupo de tratamiento deben llevar a cabo la adquisición y el análisis de los datos. El software de procesamiento de imágenes semiautomatizado (Cell Profiler pipeline) contribuye aún más a una cuantificación semiciega y supera el aumento del tiempo de procesamiento observado constantemente en el análisis manual.
Esta técnica puede extenderse a aplicaciones más amplias en combinación con la tinción inmunohistoquímica de otros tejidos y especies, siempre que se hayan determinado las concentraciones óptimas de BODIPY y los ajustes de adquisición de imágenes para maximizar la relación señal/fondo. Tales ajustes experimentales pueden permitir la detección simultánea de otros antígenos siempre que el segundo fluoróforo utilizado no se solape con los espectros de excitación/emisión de BODIPY.
En general, el protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 presentado aquí es una herramienta confiable y simple para la caracterización de LD y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos a menudo empleados para confirmar y clasificar la esteatosis hepática.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por fondos nacionales y europeos a través de la Fundación Portuguesa de Ciencia y Tecnología (FCT), el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y el Programa Operacional Factores de Competitividad (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) y POCI-01-0145-FEDER-007440. Los autores desean agradecer el apoyo de iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, una instalación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Coimbra y miembro de la infraestructura nacional PPBI-Plataforma Portuguesa de Bioimagen (POCI-01-0145-FEDER-022122), así como el apoyo de FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
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