Summary
Her demonstrerer vi en optimalisert BODIPY 493/503 fluorescensbasert protokoll for lipiddråpekarakterisering i levervev. Gjennom bruk av ortogonale projeksjoner og 3D-rekonstruksjoner muliggjør fluoroforen vellykket diskriminering mellom mikrovesikulær og makrovesikulær steatose og kan representere en komplementær tilnærming til de klassiske histologiske protokollene for vurdering av leversteatose.
Abstract
Lipiddråper (LD) er spesialiserte organeller som formidler lipidlagring og spiller en svært viktig rolle i å undertrykke lipotoksisitet og forhindre dysfunksjon forårsaket av frie fettsyrer (FAs). Leveren, gitt sin kritiske rolle i kroppens fettmetabolisme, er vedvarende truet av den intracellulære akkumuleringen av LD i form av både mikrovesikulær og makrovesikulær hepatisk steatose. Den histologiske karakteriseringen av LD er vanligvis basert på lipidløselige diazofargestoffer, for eksempel Oil Red O (ORO) farging, men en rekke ulemper hindrer konsekvent bruken av denne analysen med leverprøver. Mer nylig har lipofile fluoroforer 493/503 blitt populære for å visualisere og lokalisere LD på grunn av deres raske opptak og akkumulering i den nøytrale lipiddråpekjernen. Selv om de fleste applikasjoner er godt beskrevet i cellekulturer, er det mindre bevis som viser pålitelig bruk av lipofile fluoroforprober som et LD-bildebehandlingsverktøy i vevsprøver. Her foreslår vi en optimalisert bordipyrrometen (BODIPY) 493/503-basert protokoll for evaluering av LD i leverprøver fra en dyremodell av fettfattig diett (HFD) -indusert hepatisk steatose. Denne protokollen dekker leverprøvepreparering, vevssnitt, BODIPY 493/503-farging, bildeinnsamling og dataanalyse. Vi demonstrerer økt antall, intensitet, arealforhold og diameter av lever-LD ved HFD-fôring. Ved hjelp av ortogonale projeksjoner og 3D-rekonstruksjoner var det mulig å observere hele innholdet av nøytrale lipider i LD-kjernen, som fremsto som nesten sfæriske dråper. Videre var vi med fluoroforen BODIPY 493/503 i stand til å skille mikrovesikler (1 μm < d ≤ 3 μm), mellomliggende vesikler (3 μm < d ≤ 9 μm) og makrovesikler (d > 9 μm), noe som muliggjorde vellykket diskriminering av mikrovesikulær og makrovesikulær steatose. Samlet sett er denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserte protokollen et pålitelig og enkelt verktøy for hepatisk LD-karakterisering og kan representere en komplementær tilnærming til de klassiske histologiske protokollene.
Introduction
Lipiddråper (LD), klassisk sett på som energidepoter, er spesialiserte cellulære organeller som formidler lipidlagring, og de omfatter en hydrofob nøytral lipidkjerne, som hovedsakelig inneholder kolesterolestere og triglyserider (TG), innkapslet av et fosfolipidmonolag 1,2,3.
LD-biogenese forekommer i endoplasmatisk retikulum (ER), som starter med syntesen av triacylglycerol (TAG) og sterolestere. Nøytrale lipider diffunderes mellom brosjyrene i ER-dobbeltlaget ved lave konsentrasjoner, men samles i oljelinser som vokser og knopper til nesten sfæriske dråper fra ER-membran når deres intracellulære konsentrasjon øker4. Deretter overføres proteiner fra ER-dobbeltlaget og cytosolen, spesielt perilipin (PLIN) proteinfamilien, til overflatene av LD-ene for å lette spirende 5,6,7,8,9.
Gjennom ny fettsyresyntese og LD-fusjon eller koalescens vokser LD til forskjellige størrelser. Følgelig varierer størrelsen og antallet LD-er betydelig på tvers av forskjellige celletyper. Små dråper (300-800 nm diameter), som er kjent som innledende LDs (iLDs), kan dannes av nesten alle celler4. Senere i LD-dannelsen er de fleste celler i stand til å konvertere noen iLD-er til større-ekspanderende LD-er (eLD-er >1 μm i diameter). Likevel har bare spesifikke celletyper, som adipocytter og hepatocytter, kapasitet til å danne gigantiske eller overdimensjonerte LD-er (opptil titalls mikrometer i diameter)4,10.
LD spiller en svært viktig rolle i reguleringen av cellulær lipidmetabolisme, undertrykker lipotoksisitet og forhindrer ER-stress, mitokondriell dysfunksjon og til slutt celledød forårsaket av frie fettsyrer (FAs)11,12,13,14. Videre har LDs også vært involvert i reguleringen av genuttrykk, viral replikasjonsproteinsekvestrasjon og membranhandel og signalering 15,16,17. Derfor er feilreguleringen av LD-biogenese et kjennetegn på kroniske sykdommer forbundet med metabolsk syndrom, fedme, type 2 diabetes mellitus (T2DM) og / eller arteriosklerose, for å nevne noen få18,19,20.
Leveren, som et metabolsk knutepunkt, er for det meste ansvarlig for lipidmetabolismen ved å lagre og behandle lipider, og derfor er den konstant truet av lipotoksisitet21. Hepatisk steatose (HS) er et vanlig trekk ved en rekke progressive leversykdommer og er preget av overdreven intracellulær lipidakkumulering i form av cytosoliske LDs som i siste instans kan føre til metabolsk dysfunksjon i leveren, betennelse og avanserte former for ikke-alkoholholdig fettleversykdom22,23,24,25. HS oppstår når graden av fettsyreoksidasjon og eksport som triglyserider i svært lav tetthet lipoproteiner (VLDL) er lavere enn graden av hepatisk fettsyreopptak fra plasma og de novo fettsyresyntese26. Den hepatiske akkumuleringen av lipider forekommer ofte i to former - mikrovesikulær og makrovesikulær steatose - og disse viser forskjellige cytoarkitektoniske egenskaper27. Vanligvis er mikrovesikulær steatose preget av tilstedeværelsen av små LD-er spredt over hele hepatocytten med kjernen plassert sentralt, mens makrovesikulær steatose er preget av tilstedeværelsen av en enkelt stor LD som opptar størstedelen av hepatocytten, skyver kjernen til periferien28,29. Spesielt er disse to typer steatose ofte funnet sammen, og det er fortsatt uklart hvordan disse to LD-mønstrene påvirker sykdomspatogenesen, da bevis fortsatt er inkonsekvent31,32,33,34. Likevel er en slik type analyse ofte ansatt som en "referansestandard" i prekliniske og kliniske studier for å forstå LDs dynamiske oppførsel og karakterisere hepatisk steatose 29,34,35,36.
Leverbiopsier, gullstandarden for diagnostisering og gradering av HS, vurderes rutinemessig ved histologisk hematoksylin og eosin (H&E) analyse, hvor lipiddråper vurderes som ufargede vakuoler i H&E-fargede leverseksjoner37. Selv om det er akseptabelt for evaluering av makrovesikulær steatose, begrenser denne typen farging generelt vurderingen av mikrovesikulær steatose38. Lipidløselige diazofargestoffer, som Oil Red O (ORO), kombineres klassisk med lysfeltmikroskopi for å analysere intracellulære lipidlagre, men disse har fortsatt en rekke ulemper: (i) bruk av etanol eller isopropanol i fargeprosessen, noe som ofte forårsaker forstyrrelse av de opprinnelige LD-ene og sporadisk fusjon til tross for at cellene er fikset39; (ii) den tidkrevende naturen, da ORO-oppløsning krever ny pulveroppløsning og filtrering på grunn av begrenset holdbarhet, og dermed bidrar til mindre konsistente resultater; (iii) og det faktum at ORO flekker mer enn bare lipiddråper og ofte overvurderer hepatisk steatose38.
Følgelig har cellepermeable lipofile fluoroforer, som Nilrød, blitt brukt i enten levende eller faste prøver for å overvinne noen av de nevnte begrensningene. Imidlertid begrenser den ikke-spesifikke karakteren av cellulær lipidorganellmerking gjentatte ganger LD-vurderinger40. Videre varierer de spektrale egenskapene til Nile Red i henhold til miljøets polaritet, noe som ofte kan føre til spektrale skift41.
Den lipofile fluorescerende sonden 1,3,5,7,8-pentametyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (eksitasjonsbølgelengde: 480 nm; utslippsmaksimum: 515 nm; BODIPY 493/503) utviser hydrofobisitetsegenskaper som tillater raskt opptak av intracellulære LD-er, akkumuleres i lipiddråpekjernen og deretter avgir lysegrønn fluorescens12. I motsetning til Nile Red er BODIPY 493/503 ufølsom for miljøpolariteten og har vist seg å være mer selektiv, da den viser høy lysstyrke for LD-bildebehandling. For å flekke nøytrale LD-er, kan dette fargestoffet brukes i levende eller faste celler og vellykket kombinert med andre farge- og / eller merkingsmetoder42. En annen fordel med fargestoffet er at det krever liten innsats å plassere i en løsning og er stabil, og eliminerer dermed behovet for å forberede det til hvert eksperiment42. Selv om BODIPY 493/503-sonden har blitt brukt til å visualisere lokaliseringen og dynamikken til LD i cellekulturer, har noen rapporter også vist pålitelig bruk av dette fargestoffet som et LD-bildebehandlingsverktøy i vev, inkludert den humane vastus lateralis-muskelen43, rotte soleus-muskelen 42 og musetarmen44.
Her foreslår vi en optimalisert BODIPY 493/503-basert protokoll som en alternativ analytisk tilnærming for evaluering av LD-antall, areal og diameter i leverprøver fra en dyremodell av leverstatose. Denne prosedyren dekker leverprøvepreparering, vevssnitt, fargeforhold, bildeopptak og dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) og overholdt Animal Care nasjonale og europeiske direktiver og med ARRIVE-retningslinjene.
1. Eksperimentell design
- Par-hus 13 uker gamle mannlige Wistar-rotter i ventilerte bur under kontrollerte miljøforhold med temperatur (22 ° C ± 1 ° C), fuktighet (50% -60%) og lys (12 t lys-mørk syklus) og med ad libitum tilgang til vann fra springen og standard gnager chow.
- Etter en 2 ukers periode med akklimatisering, tildel rotter vilkårlig i to grupper.
- Fôr kontrollgruppen (CTRL, n = 6) og høyfettdiettgruppene (HFD, n = 6) med henholdsvis standard chow og et fettrikt kosthold (45 % kcal/fett) i 24 uker.
- Overvåk kroppsvekten (BW) ukentlig. Registrer mat- og drikkeforbruket daglig per bur.
2. Forberedelse av leverprøve
- Disseksjon av leveren
- Forbered den peristaltiske pumpen: Før 70 % etanol gjennom slangen, koble en 27 G kanyle til utløpsenden av slangen, og fyll slangen med iskaldt (4 °C) 1x fosfatbufret saltvann (PBS, pH ~7,4) (f.eks. 200 o / min på en peristaltisk pumpe med 1,6 mm I.D. silisiumslange, IV mini dryppsett). Juster for kroppsvekten (f.eks. for en rotte på 100-150 g, bruk en strømningshastighet på ca. 10-12 ml / min).
- Bedøv rotta ved en intraperitoneal injeksjon ved hjelp av en anestesiprotokoll (den endelige konsentrasjonen av ketamin = 75 mg / kg, og den endelige konsentrasjonen av medetomidin = 1 mg / kg).
NOTAT: Forsikre deg om at rotta er fullstendig bedøvet ved hjelp av tåklemmeresponsmetoden. - Plasser rotta på disseksjonsbrettet.
- Rengjør pelsen grundig med 70% etanol, og tørk den med et papirhåndkle.
- Bruk saks, gjør en "U" -formet snitt gjennom huden, og kutt åpen under membranen. Deretter kutter du ribbeholderen rostralt på kantene for å avsløre hjertet.
- Mens 1x PBS kjører, pass nålen gjennom venstre ventrikkel inn i den stigende aorta, og klemme. Deretter kuttes høyre atrium for å tillate drenering når perfusjonen har begynt.
MERK: Leveren skal begynne å blanchere ettersom blod erstattes med PBS. - Bruk saks og Dumont-tang, fjern leveren forsiktig og skyll med 1x PBS.
- Overfør leveren til en petriskål, og vei den.
- Bruk en skalpell, samle levervevsprøver på 5 mm i tykkelse fra sidesiden (1 cm fra kanten) av leverens venstre lobe for innebyggingsprosessen.
MERK: Det gjenværende vevet kan lagres ved -80 °C for langtidslagring.
- Innbygging av levervev
- Forbered en tørrisbeholder, og merk kryomolds riktig med prøve-ID og orientering.
- Plasser noen dråper kryoinnbyggingsmatrise på midten av kryomold for å oppnå optimal skjæretemperatur (OCT).
- Sørg for at vevsprøven er riktig orientert for et tverrsnitt.
MERK: Forsikre deg om at siden som berører bunnen av kryomoven, er den siden som skal seksjoneres først. - Slipp forsiktig mer OCT på kryomold til den er helt dekket. Prøv å unngå dannelse av luftbobler. Om nødvendig, med vanlig tang, fjern eventuelle bobler inne i OCT.
- Plasser kryomolden raskt med den OKT-dekkede prøven i en tørrisbeholder.
MERK: Vevet kan oppbevares ved -80 °C i 3 år.
3. Frossen vevsseksjonering
- Juster kryostattemperaturen (kammer: -21 °C; prøve: -18 °C), og sett inn et nytt sterilt blad.
- Plasser prøvene i kryostaten, i 30 min før du lar temperaturen likevekte.
- Lag et enkelt lag med OCT på prøveplaten for å tillate prøveadhesjon. La OCT fryse, og monter vevsprøven i ønsket retning.
MERK: Skjæreflaten skal være parallell med bladet. For å opprettholde god vedheft, plasser varmeavtrekket på toppen av prøven. De foregående trinnene kan også utføres i en tørrisbeholder med tørris. - Plasser prøven i prøvehodet, og trim overflaten av vevet (noen få 30 μm vevsprøveseksjoner).
- Når området av interesse er tilgjengelig for seksjonering, kutt 12 μm tykke seksjoner, og plasser dem på merkede mikroskopglass holdt ved romtemperatur (RT).
MERK: For å samle seksjonen, flytt lysbildet sakte mot vevsseksjonen. Hvert lysbilde kan samle to leverseksjoner. - La lysbildene tørke i 10 min ved RT.
MERK: Lysbildene kan oppbevares ved -20 °C i 6-12 måneder eller ved -80 °C i opptil 3 år.
4. BODIPY farging
- Tine lysbildene i et lysbildefargingssystem på RT i 30 min.
- Vask med 1x PBS (3x i 5 min hver).
- Sirkle seksjonen med et hydrofobt lag ved hjelp av en barrierepenn.
- Klargjør 500 mikrogram / ml BODIPY 493/503 stamoppløsning: Løs opp 1 mg BODIPY 493/503in 2 ml oppløsningsvæske (90% DMSO; 10% 1x PBS). Beskytt mot lys. Sonikere i et ultralydbad i 1 time (9,5-10 W) ved 37 ° C.
MERK: Oppløsningen kan oppbevares ved -20 °C i minst 30 dager. - Klargjør BODIPY-fargeløsningen (1 μg/ml) ved å tilsette 2 μL BODIPY 493/503 stamløsning og 0,1 μL DAPI-stamløsning (5 mg/ml) til 997,9 μL 1x PBS.
- Inkuber lysbildene (75 μL/slide) med BODIPY 493/503 (1 μg/ml) og DAPI (0,1 μg/ml) ved RT i 40 minutter.
MERK: Hold lysbildene i mørket fra dette trinnet og utover. - Vask lysbildene med 1x PBS (3x i 5 min hver).
- Monter lysbildene med deksler ved hjelp av et fluorescensmonteringsmedium, la dem tørke i 30 minutter og forsegle dem med neglelakk.
MERK: Lysbildene kan lagres ved 4 °C frem til avbildning.
5. Lipid kvantifisering
- Mål serum totalt kolesterol og TG nivåer ved hjelp av en automatisk, validert metode og utstyr.
- Mål de hepatiske TG-nivåene ved hjelp av et triglyserider kolorimetrisk analysesett (materialfortegnelse) i henhold til produsentens protokoll.
6. Oppkjøp av bilde
- Plasser lysbildet på glideholderen for konfokalmikroskop med laserskanning.
- For bildevisualisering og oppkjøp, bruk et konfokalmikroskop med en 20x objektivlinse (plan-apochromat: 20x / 0.8).
- For å unngå kryssprat mellom BODIPY 493/503 og DAPI, bruk sekvensiell (beste signal) skannemodus på konfokalprogramvaren.
- Eksiter BODIPY 593/503 ved hjelp av 488 nm argonlaserlinjen og DAPI ved hjelp av 405 nm laserlinjen. Sett utslippsområdene til 493-589 nm for BODIPY 493/503 og ved 410-464 nm for DAPI.
- Bruk følgende innstillinger: pinhole: 1 AU, oppløsning: 1,024 piksler x 1,024 piksler, bitdybde: 12, pikselstørrelse: 0,415 μm, toveismodus, skannehastighet: 7 (~ 1,58 μs / piksel for et 20x mål), linjegjennomsnitt: 2x og digital zoom: 1.
MERK: De ovennevnte skanningsparametrene må optimaliseres for hvert konfokalmikroskop og mål som brukes. - Sett forsterkningen og digital forsterkning på riktig måte slik at ingen mettede piksler oppdages på rekkeviddeindikatoren.
MERK: Korriger bakgrunnssignalet ved å justere forskyvningen. - Når LD-ene er korrekt identifisert, kan du skaffe bildet med BODIPY- og DAPI-kanalene.
MERK: Alle bildene må anskaffes under samme forhold (eksponering og generelle innstillinger) for hver fargekanal. - For å lage bilder med bredt område (figur 2), endre objektivet til a10x objektivlinse (plan-neofluar: 10x/0.3).
- Velg Tile Scan-modus , og lag mosaikker av 5 per 5 bilder.
MERK: I dette arbeidet hadde hver flis en overlapping på 10% for å kunne slå sammen flisene på riktig måte for analyse. - For å lage 3D- og ortogonale visninger (figur 3A), plasser en dråpe nedsenkningsolje på toppen av dekselglasset og endre objektivet til en 40x objektivlinse (plan-neofluar: 40x/1.30 olje).
- Velg Z-Stack-modus, og ved å justere Z-planet definerer du første og siste posisjon for opptak med et optisk stykke med en optimal tykkelse (~0,5 μm) for å sikre at alle dråpene fanges opp.
MERK: For å øke hastigheten på bildeopptaket og unngå bleking, kan det optiske stykket justeres til en suboptimal størrelse, noe som sikrer minst 30% oversampling for en god 3D-rekonstruksjon. - Velg Orto-modulen , og opprett ortogonale visninger.
- Skaff deg 3D-bilder ved å velge 3D-modulen etter gjengivelsesmodus for gjennomsiktighet med programvaren for konfokalmikroskopet.
7. Analyse av bilder
- Behandle og analysere enkeltplanbildene (20x forstørrelse) med CellProfiler (versjon 4.2.5).
MERK: Rørledningen som ble brukt i dette arbeidet ble tilpasset fra Adomshick et al.45. - Klikk på Bilder-modulen øverst til venstre i CellProfiler-vinduet, og last opp bildene som .tiff filer.
- Bruk modulen NamesAndTypes til å sortere mellom BODIPY- (dråpeverktøy) og DAPI- (kjerner) fargede bilder basert på filnavnene. Utfør LD-analysen bare med BODIPY-fargede bilder.
- For å starte rørledningskonstruksjonen, klikk på Juster moduler, og velg modulen ColorToGray for å konvertere bildene til gråtonebilder.
MERK: For å identifisere objekter kreves gråtonebilder. - Identifiser slippverktøy ved å bruke IdentifyPrimaryObjects-modulen ved hjelp av gråtonebildet.
MERK: Parametrene i denne modulen må justeres for å oppnå god LD-identifikasjon. I dette arbeidet førte definering av LD-er med en størrelse mellom 6 piksler og 300 piksler og en terskelkorreksjonsfaktor på 1,0 til den mest nøyaktige identifikasjonen. - Hvis du vil måle pikselintensiteten til de identifiserte lipiddråpene, legger du til en MeasureObjectIntensitet-modul .
- Legg til en ekstra FilterObjects-modul for å sikre at bare de sterkeste signalene kvantifiseres mens mindre intense signaler ekskluderes fra den endelige lipiddråpeanalysen (minimumsintensitet: 0,15; maksimal intensitet: 1 vilkårlig enhet).
- Hvis du vil måle LD-ene som er relatert til utdataene, legger du til MeasureObjectSizeShape-modulen .
- Legg til en OverlayOutlines-modul på dette tidspunktet for å legge over den identifiserte dråpen på originalbildet, og dermed sikre at segmenteringen også ser nøyaktig ut på det ubehandlede bildet.
MERK: Dette er et valgfritt trinn (kvalitetskontroll). - Legg til en ExportToSpreadsheet-modul på slutten, og klikk på Analyser bilder-knappen nederst til venstre.
8. Statistisk analyse
- Uttrykk resultatene som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet (S.E.M.) ved hjelp av et statistisk analyseprogram.
MERK: I denne studien ble GraphPad-programvaren brukt til statistisk analyse. - Analyser fordelingen av verdier ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov-testen for å vurdere signifikante avvik fra normalitet. Analyser de parametriske dataene ved hjelp av Student sin uparede t-test.
MERK: Verdier på p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede utførelsen av denne teknikken skal resultere i klar lipiddråpefarging for samtidig karakterisering av LD-morfologien (form og lipidkjernetetthet basert på 3D-rekonstruksjonen) sammen med deres romlige fordeling, antall per totalt areal og gjennomsnittlig størrelse (vurdert med rørledningen ovenfor beskrevet, figur 1).
Figur 1: Eksempel på bildebehandling ved hjelp av CellProfiler . (A) Originalbilde av LD-er farget med BODIPY 493/503 (grønn) og kjerner farget med DAPI (blå) i CTL-gruppen. (B) De differensierte LD-ene (magenta) i CTL-gruppen ble overlappet ved hjelp av OverlayOutlines-modulen . (C) Originalbilde av LD-er farget med BODIPY 493/503 (grønn) og kjerner farget med DAPI (blå) i HFD-gruppen. (D) De differensierte LD-ene (magenta) i HFD-gruppen ble overlappet ved hjelp av OverlayOutlines-modulen . Bildene ble tatt ved 20x forstørrelse ved hjelp av et laserpunktskanning konfokalmikroskop. Skalastenger = 50 μm. Forkortelser: CTL = kontrollgruppe; HFD = fettrik diettgruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Serum-TG, totalkolesterol, LDL-c, HDL-c samt lever-TG-innhold ble evaluert (tab 1). HFD-fôrede dyr presenterte en uttalt dyslipidemisk profil, karakterisert ved en aksentuert akkumulering av lever-TG (345 % sammenlignet med CTL, p < 0,001), sammen med en subtil økning i sirkulerende TG-nivåer (129 % sammenlignet med CTL, p > 0,05).
| Parameter | CTL | HFD | |
| Serum | |||
| Totalt kolesterol (mg / dL) | 56,67 ± 9,35 | 80.40 ± 7.45 | |
| LDL (mg/dl) | 7,66 ± 0,84 | 7,40 ± 1,03 | |
| HDL (mg/dl) | 17,83 ± 2,93 | 28.40 ± 2,40 * | |
| Triglyserider (mg/dl) | 154,8 ± 40,17 | 201,2 ± 38,12 | |
| Lever | |||
| Triglyserider (mg/g) | 15.29 ± 1.31 | 52,83 ± 6,73 *** |
Tabell 1: Serum-TG, totalkolesterol, LDL-c, HDL-c og innholdet av lever-TG. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM (n = 5-6 per gruppe). p < 0,001 versus CTL. Statistisk analyse ble utført med Student sin uparede t-test. Forkortelser: CTL = kontrollgruppe; HFD = fettrik diettgruppe.
Figur 2 viser representative vidvinkelbilder (flisskanning med 10x objektiv) av leverseksjoner der LD er farget med BODIPY 493/503 (grønn) og kjerner er farget med DAPI (blå). Individuelle LD-er av forskjellige størrelser ble vellykket visualisert med BODIPY 493/503-farging, som viste et utbredt distribusjonsmønster hos HFD-fôrede dyr.
Figur 2: Representative bilder av LD-akkumulering i levervev. LD farget med BODIPY 493/503 (grønn), og kjerner farget med DAPI (blå). Bildene ble tatt ved 10x forstørrelse ved hjelp av et laserpunktskanning konfokalmikroskop. Skalastenger = 200 μm. Forkortelser: CTL = kontrollgruppe; HFD = fettrik diettgruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3A viser representative ortogonale projeksjoner med et 20x objektiv og 3D-bilder med et 40x mål for hepatiske LDs. Enkeltplanbilder ble behandlet og analysert av CellProfiler (versjon 4.2.5) for å vurdere fluorescensintensiteten, antall, areal og diameter av LC-ene (figur 3B-E). Det var mulig å bekrefte at de HFD-fôrede dyrene viste et økt antall lever-LD (151 % vs. CTL, figur 3B), og dette ble bekreftet av den forsterkede BODIPY 493/503-fluorescensintensiteten (182 % vs. CTL, p < 0,001, figur 3C). Videre ble arealforholdet mellom LD nesten tredoblet (360 % vs. CTL, p < 0,0001, figur 3D) da de presenterte større diametre (182 % vs. CTL, figur 3E) hos HFD-matede dyr. For å vurdere størrelsesfordelingen ble LD-ene kategorisert i tre grupper i henhold til diameterområdene: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm og d > 9 μm (figur 3F). Dyrene som ble fôret med HFD viste en større enn 20% økning i antall overdimensjonerte, makrovesikulære lever-LDs (d > 9 μm, p < 0,0001) sammen med en nesten tre ganger reduksjon i antall mikrovesikler mindre enn 3 μm i diameter (1 μm < d ≤ 3 μm, p < 0,0001).
Figur 3: Ortogonale / 3D-visninger av LDs og dataanalyse. (A) Representative ortogonale projeksjoner og 3D-gjengitte bilder av hepatiske lipiddråper (grønn, BODIPY 493/503) og kjerner (blå, DAPI) i leveren hos mus som fikk en normal eller HFD diett. Bildene ble tatt ved 20x (venstre) og 40x (høyre) forstørrelse ved hjelp av et laserpunktskanning konfokalmikroskop. Skalastenger = 20 μm. (B) Antall lever-LDs. (C) Fluorescensintensitet av de hepatiske LDs. (D) Arealforholdet mellom de hepatiske LD-ene. (E) Lipiddråpediametre. (F) Fraksjonelle forhold mellom grupper av hepatiske lipiddråper med forskjellige diametre: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm og d > 9 μm. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. n = 5-6 mus/gruppe; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Statistisk analyse ble utført med Student sin uparede t-test. Forkortelser: CTL = kontrollgruppe; HFD = fettrik diettgruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserte protokollen for LD-vurdering hadde som mål å utvikle en ny bildebehandlingsmetode for evaluering av hepatisk steatose. Gitt den sterke korrelasjonen mellom fedme og fettleversykdom, ble den vestlige stilen med høyt fett diett brukt til å etablere en dyremodell av hepatisk steatose26. En robust økning i hepatisk TG-innhold ble bekreftet av et kvantitativt triglyseridkolorimetrisk analysesett, som antydet et økt hepatisk lipidosescenario hos HFD-matede dyr. Deretter ble graden av LD-akkumulering visualisert av fluorescerende sonde BODIPY 493/503 under lav forstørrelse. Som forventet viste BODIPY 493/503-fargingen en utbredt spredning av vesikulære strukturer over levervevet i HFD-gruppen. Ved å ty til ortogonale projeksjoner og 3D-rekonstruksjoner var det mulig å observere at LD-kjernen presenterte et fullt innhold av nøytrale lipider, som dukket opp som nesten sfæriske dråper. Videre var den robuste økningen i LD-området per totalt areal tydelig (360% vs. CTL-gruppen), og dette området var mest sannsynlig fylt med nøytrale TGer gitt deres kvantitative score i HFD-gruppen (52,83 mg / g ± 6,73 mg / g; 346% vs. CTL-gruppen). For ytterligere å karakterisere LD-dynamikken ved HFD-fôring ble mikro- eller makrovesikulæren av hepatisk steatose analysert. Ved å bruke LD-diameterområdene som tidligere er beskrevet i litteratur 4,46,47, var det mulig å diskriminere et signifikant fall i mikrovesikulær LD-telling (1 μm < d ≤ 3 μm), som parallelt med en proporsjonal økning i LD-makrovesikler (d > 9 μm). Flere studier har rapportert at LDs i hepatocytter kan danne overdimensjonerte LDs (opptil titalls mikrometer i diameter) 4,46,47, som er i tråd med dagens resultater.
I de senere år har klassiske lipidfargestoffer gradvis blitt erstattet med et nytt utvalg av fluorescerende lipofile prober, som BODIPY, gitt deres nøytrale og plane struktur stabilisert av et difluoroboronkompleks48; Disse probene har vist seg å være svært effektive til å merke LDs for å studere deres morfologi, dynamikk og interaksjon med andre organeller i levende celler og noen faste vev49,50. Innenfor den fluorescerende lipiddråpeprotokollen som presenteres her for vurdering av leversteatose, er det noen kritiske trinn for suksessen til teknikken som hovedsakelig er avhengig av vevpreparasjon og bildeoppkjøp. Siden BODIPY-signalet kan blekes av UV-lys51, må LD-bildeinnsamling skje før avbildning av andre fluorescerende fargestoffer som er begeistret av UV-lys, for eksempel de kjente DNA-fluorescerende fargestoffene. Videre anbefales det sterkt å beskytte mikroskoplysbildene mot lyseksponering for å forhindre BODIPY fluorescensslukking før avbildning. Selv om 3D-rekonstruksjonen av LD-er er svært nyttig for studiet av deres morfologi, er det ekstremt tidkrevende, siden 3D-rekonstruerte bilder består av flere uavhengige 2D-bilder. Derfor bør forskere vurdere å unngå dette trinnet når det primære målet med forsøket utelukkende er vurdering av mikro- og makrovesikulær hepatisk steatose. For å unngå systematiske skjevheter bør to uavhengige observatører blindet for behandlingsgruppen utføre datainnsamlingen og analysen. Den semi-automatiserte bildebehandlingsprogramvaren (Cell Profiler-rørledningen) bidrar ytterligere til en semi-blind kvantifisering og overvinner den økte behandlingstiden som konsekvent observeres i manuell analyse.
Denne teknikken kan utvides til bredere applikasjoner i kombinasjon med immunhistokjemifarging av andre vev og arter, så lenge de optimale BODIPY-konsentrasjonene og bildeopptaksinnstillingene er bestemt for å maksimere signal/bakgrunnsforholdet. Slike eksperimentelle innstillinger kan tillate samtidig påvisning av andre antigener, forutsatt at den andre fluoroforen som brukes, ikke overlapper med BODIPY-eksitasjons-/emisjonsspektrene.
Samlet sett er den optimaliserte BODIPY 493/503 fluorescensbaserte protokollen som presenteres her, et pålitelig og enkelt verktøy for LD-karakterisering og kan representere en komplementær tilnærming til de klassiske histologiske protokollene som ofte brukes til å bekrefte og gradere hepatisk steatose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av nasjonale og europeiske midler via den portugisiske Science and Technology Foundation (FCT), European Regional Development Fund (FEDER) og Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) og POCI-01-0145-FEDER-007440. Forfatterne vil gjerne takke støtten fra iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, et anlegg ved Det medisinske fakultet ved Universitetet i Coimbra og medlem av den nasjonale infrastrukturen PPBI-portugisisk plattform for BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), samt støtte fra FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
References
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L.
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P.
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
