Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Summary

In dieser Arbeit demonstrieren wir ein optimiertes BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basiertes Protokoll zur Charakterisierung von Lipidtröpfchen in Lebergewebe. Durch die Verwendung von orthogonalen Projektionen und 3D-Rekonstruktionen ermöglicht der Fluorophor eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose und kann einen komplementären Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen zur Beurteilung der hepatischen Steatose darstellen.

Abstract

Lipidtröpfchen (LDs) sind spezialisierte Organellen, die die Lipidspeicherung vermitteln und eine sehr wichtige Rolle bei der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von Funktionsstörungen spielen, die durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht werden. Die Leber ist aufgrund ihrer entscheidenden Rolle im Fettstoffwechsel des Körpers ständig durch die intrazelluläre Anhäufung von LDs in Form von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Lebersteatose bedroht. Die histologische Charakterisierung von LDs basiert in der Regel auf lipidlöslichen Diazofarbstoffen, wie z. B. der Oil Red O (ORO)-Färbung, aber eine Reihe von Nachteilen erschweren die Verwendung dieser Analyse mit Leberproben durchweg. In jüngerer Zeit sind lipophile Fluorophore 493/503 aufgrund ihrer schnellen Aufnahme und Akkumulation in den neutralen Lipidtröpfchenkern für die Visualisierung und Lokalisierung von LDs populär geworden. Obwohl die meisten Anwendungen in Zellkulturen gut beschrieben sind, gibt es weniger Evidenz für den zuverlässigen Einsatz von lipophilen Fluorophorsonden als LD-Bildgebungswerkzeug in Gewebeproben. In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes Bordipyrromethen (BODIPY) 493/503 basiertes Protokoll für die Evaluierung von LDs in Leberproben aus einem Tiermodell der fettreichen Diät (HFD)-induzierten hepatischen Steatose vor. Dieses Protokoll umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die BODIPY 493/503-Färbung, die Bildaufnahme und die Datenanalyse. Wir zeigen eine erhöhte Anzahl, Intensität, Flächenzahl und Durchmesser von hepatischen LDs bei HFD-Ernährung. Mittels orthogonaler Projektionen und 3D-Rekonstruktionen war es möglich, den vollen Gehalt an neutralen Lipiden im LD-Kern zu beobachten, die als nahezu kugelförmige Tröpfchen auftraten. Darüber hinaus konnten wir mit dem Fluorophor BODIPY 493/503 Mikrovesikel (1 μm < d ≤ 3 μm), intermediäre Vesikel (3 μm 9 μm) unterscheiden, was eine erfolgreiche Unterscheidung von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose ermöglicht. Insgesamt ist dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll ein zuverlässiges und einfaches Werkzeug für die hepatische LD-Charakterisierung und könnte einen ergänzenden Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen darstellen.

Introduction

Lipidtröpfchen (LDs), die klassischerweise als Energiedepots angesehen werden, sind spezialisierte Zellorganellen, die die Lipidspeicherung vermitteln, und sie bestehen aus einem hydrophoben neutralen Lipidkern, der hauptsächlich Cholesterinester und Triglyceride (TGs) enthält und von einer Phospholipid-Monoschicht eingekapselt ^{ist 1,2,3}.

Die LD-Biogenese findet im endoplasmatischen Retikulum (ER) statt, beginnend mit der Synthese von Triacylglycerin (TAG) und Sterolestern. Neutrale Lipide diffundieren in geringen Konzentrationen zwischen den Segeln der ER-Doppelschicht, verschmelzen aber zu Öllinsen, die wachsen und zu fast kugelförmigen Tröpfchen aus der ER-Membran austreiben, wenn ihre intrazelluläre Konzentration steigt⁴. Anschließend translozieren Proteine aus der ER-Doppelschicht und dem Zytosol, insbesondere die Perilipin (PLIN)-Proteinfamilie, auf die Oberflächen der LDs, um die Knospung zu erleichtern 5,6,7,8,9.

Durch die Synthese neuer Fettsäuren und die Fusion oder Koaleszenz von LDs wachsen LDs in unterschiedliche Größen heran. Dementsprechend unterscheiden sich Größe und Anzahl der LDs zwischen den verschiedenen Zelltypen erheblich. Kleine Tröpfchen (300-800 nm Durchmesser), die als initiale LDs (iLDs) bezeichnet werden, können von fast allen Zellen gebildet werden⁴. Später in der LD-Bildung sind die meisten Zellen in der Lage, einige iLDs in größere, expandierende LDs (eLDs >1 μm Durchmesser) umzuwandeln. Doch nur bestimmte Zelltypen, wie Adipozyten und Hepatozyten, haben die Fähigkeit, riesige oder übergroße LDs (bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser) zu ^bilden4,10.

LDs spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung des zellulären Fettstoffwechsels, der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von ER-Stress, mitochondrialer Dysfunktion und letztendlich des Zelltods, der durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht wird11,12,13,14. Darüber hinaus sind LDs auch an der Regulation der Genexpression, der Sequestrierung von viralen Replikationsproteinen sowie des Membrantransports und der Signalübertragung beteiligt^15,16,17. Daher ist die Fehlregulation der LD-Biogenese ein Kennzeichen chronischer Krankheiten, die mit metabolischem Syndrom, Adipositas, Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und/oder Arteriosklerose, um nur einige zu nennen, assoziiert sind^18,19,20.

Die Leber als Stoffwechselknotenpunkt ist hauptsächlich für den Fettstoffwechsel verantwortlich, indem sie Lipide speichert und verarbeitet, und ist daher ständig von Fettotoxizität bedroht²¹. Die hepatische Steatose (HS) ist ein häufiges Merkmal einer Reihe von fortschreitenden Lebererkrankungen und ist gekennzeichnet durch eine übermäßige intrazelluläre Lipidakkumulation in Form von zytosolischen LDs, die letztendlich zu Stoffwechselstörungen der Leber, Entzündungen und fortgeschrittenen Formen der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung führen können^22,23,24,25. HS tritt auf, wenn die Rate der Fettsäureoxidation und des Exports als Triglyceride innerhalb von Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDLs) niedriger ist als die Rate der hepatischen Fettsäureaufnahme aus dem Plasma und der de novo Fettsäuresynthese²⁶. Die hepatische Akkumulation von Lipiden tritt häufig in zwei Formen auf – mikrovesikuläre und makrovesikuläre Steatose -, und diese weisen unterschiedliche zytoarchitektonische Merkmale auf²⁷. Typischerweise ist die mikrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein kleiner LDs gekennzeichnet, die über die gesamte Hepatozyten verteilt sind und deren Kern zentral platziert ist, während die makrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein einer einzigen großen LD gekennzeichnet ist, die den größten Teil der Hepatozyten einnimmt und den Kern in die Peripherie drückt^28,29. Bemerkenswert ist, dass diese beiden Arten der Steatose oft zusammen gefunden werden, und es bleibt unklar, wie diese beiden LD-Muster die Krankheitspathogenese beeinflussen, da die Evidenz immer noch uneinheitlich ist^31,32,33,34. Diese Art der Analyse wird jedoch häufig als “Referenzstandard” in präklinischen und klinischen Studien verwendet, um das dynamische Verhalten von LDs zu verstehen und die hepatische Steatose zu charakterisieren 29,34,35,36.

Leberbiopsien, der Goldstandard für die Diagnose und Einstufung von HS, werden routinemäßig durch histologische Hämatoxylin- und Eosinanalysen (H&E) beurteilt, bei denen Lipidtröpfchen als ungefärbte Vakuolen in H&E-gefärbten Leberschnitten ausgewertet werden³⁷. Diese Art der Färbung ist zwar für die Beurteilung der makrovesikulären Steatose akzeptabel, schränkt aber im Allgemeinen die Beurteilung der mikrovesikulären Steatose^{ein 38}. Fettlösliche Diazofarbstoffe, wie z. B. Oil Red O (ORO), werden klassischerweise mit der Hellfeldmikroskopie kombiniert, um intrazelluläre Lipidspeicher zu analysieren, aber diese haben immer noch eine Reihe von Nachteilen: (i) die Verwendung von Ethanol oder Isopropanol im Färbeprozess, was häufig zur Störung der nativen LDs und gelegentlich zur Fusion führt, obwohl die Zellen fixiert sind³⁹; (ii) die zeitaufwändige Natur, da die ORO-Lösung aufgrund der begrenzten Haltbarkeit frisches Pulver auflöst und filtriert, was zu weniger konsistenten Ergebnissen beiträgt; (iii) und die Tatsache, dass ORO mehr als nur Lipidtröpfchen färbt und die hepatische Steatose oft überschätzt³⁸.

Folglich wurden zelldurchlässige lipophile Fluorophore, wie z. B. Nilrot, entweder in lebenden oder fixierten Proben verwendet, um einige der oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Die unspezifische Natur der Markierung zellulärer Lipidorganellen schränkt die LD-Bewertungen jedoch immer wieder ein⁴⁰. Darüber hinaus variieren die spektralen Eigenschaften von Nilrot je nach Polarität der Umgebung, was häufig zu spektralen Verschiebungen führen kann⁴¹.

Die lipophile Fluoreszenzsonde 1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (Anregungswellenlänge: 480 nm; Emissionsmaximum: 515 nm; BODIPY 493/503) weist hydrophobe Eigenschaften auf, die eine schnelle Aufnahme durch intrazelluläre LDs ermöglichen, akkumuliert sich im Lipidtröpfchenkern und emittiert anschließend hellgrüne Fluoreszenz¹². Im Gegensatz zu Nilrot ist BODIPY 493/503 unempfindlich gegenüber der Polarität der Umgebung und hat sich als selektiver erwiesen, da es eine hohe Helligkeit für die LD-Bildgebung aufweist. Um neutrale LDs zu färben, kann dieser Farbstoff in lebenden oder fixierten Zellen verwendet und erfolgreich mit anderen Färbe- und/oder Markierungsmethoden gekoppelt werden⁴². Ein weiterer Vorteil des Farbstoffs besteht darin, dass er wenig Kraftaufwand erfordert, um ihn in eine Lösung zu geben, und stabil ist, so dass er nicht für jedes Experiment neu vorbereitet werden muss⁴². Obwohl die Sonde BODIPY 493/503 erfolgreich eingesetzt wurde, um die Lokalisation und Dynamik von LDs in Zellkulturen zu visualisieren, haben einige Berichte auch die zuverlässige Verwendung dieses Farbstoffs als LD-Bildgebungswerkzeug in Geweben wie dem menschlichen Musculus vastus lateralis⁴³, dem Musculus soleus 42 der Ratte⁴² und dem Darm^{der Maus 44} gezeigt.

In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes BODIPY 493/503-basiertes Protokoll als alternativen analytischen Ansatz für die Bewertung der LD-Anzahl, -Fläche und des LD-Durchmessers in Leberproben aus einem Tiermodell der hepatischen Steatose vor. Dieses Verfahren umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die Färbebedingungen, die Bildaufnahme und die Datenanalyse.

Protocol

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von der Tierschutzbehörde des Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) (ORBEA, #9/2018) genehmigt und entsprachen den nationalen und europäischen Richtlinien für die Tierpflege sowie den ARRIVE-Richtlinien. 1. Versuchsplanung Paarhaltung von 13 Wochen alten männlichen Wistar-Ratten in belüfteten Käfigen unter kontrollierten Umgebungsbedingungen von Temperatur (22 °C ± 1 °C), Luftf…

Representative Results

Die erfolgreiche Durchführung dieser Technik sollte zu einer eindeutigen Lipidtröpfchenfärbung für die gleichzeitige Charakterisierung der LD-Morphologie (Form und Lipidkerndichte basierend auf der 3D-Rekonstruktion) zusammen mit ihrer räumlichen Verteilung, Anzahl pro Gesamtfläche und durchschnittlicher Größe (bewertet mit der oben beschriebenen Pipeline, Abbildung 1) führen. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" …

Discussion

Dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll zur LD-Beurteilung zielte darauf ab, einen neuen Bildgebungsansatz für die Beurteilung der hepatischen Steatose zu entwickeln. Aufgrund des starken Zusammenhangs zwischen Adipositas und Fettlebererkrankungen wurde die fettreiche Diät nach westlichem Vorbild verwendet, um ein Tiermodell der Lebersteatose zu etablieren²⁶. Ein robuster Anstieg der hepatischen TG-Gehalte wurde durch ein quantitatives kolorimetrisches Triglycerid-Assay-Kit bestäti…

Materials

1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss