Summary
In dieser Arbeit demonstrieren wir ein optimiertes BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basiertes Protokoll zur Charakterisierung von Lipidtröpfchen in Lebergewebe. Durch die Verwendung von orthogonalen Projektionen und 3D-Rekonstruktionen ermöglicht der Fluorophor eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose und kann einen komplementären Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen zur Beurteilung der hepatischen Steatose darstellen.
Abstract
Lipidtröpfchen (LDs) sind spezialisierte Organellen, die die Lipidspeicherung vermitteln und eine sehr wichtige Rolle bei der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von Funktionsstörungen spielen, die durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht werden. Die Leber ist aufgrund ihrer entscheidenden Rolle im Fettstoffwechsel des Körpers ständig durch die intrazelluläre Anhäufung von LDs in Form von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Lebersteatose bedroht. Die histologische Charakterisierung von LDs basiert in der Regel auf lipidlöslichen Diazofarbstoffen, wie z. B. der Oil Red O (ORO)-Färbung, aber eine Reihe von Nachteilen erschweren die Verwendung dieser Analyse mit Leberproben durchweg. In jüngerer Zeit sind lipophile Fluorophore 493/503 aufgrund ihrer schnellen Aufnahme und Akkumulation in den neutralen Lipidtröpfchenkern für die Visualisierung und Lokalisierung von LDs populär geworden. Obwohl die meisten Anwendungen in Zellkulturen gut beschrieben sind, gibt es weniger Evidenz für den zuverlässigen Einsatz von lipophilen Fluorophorsonden als LD-Bildgebungswerkzeug in Gewebeproben. In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes Bordipyrromethen (BODIPY) 493/503 basiertes Protokoll für die Evaluierung von LDs in Leberproben aus einem Tiermodell der fettreichen Diät (HFD)-induzierten hepatischen Steatose vor. Dieses Protokoll umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die BODIPY 493/503-Färbung, die Bildaufnahme und die Datenanalyse. Wir zeigen eine erhöhte Anzahl, Intensität, Flächenzahl und Durchmesser von hepatischen LDs bei HFD-Ernährung. Mittels orthogonaler Projektionen und 3D-Rekonstruktionen war es möglich, den vollen Gehalt an neutralen Lipiden im LD-Kern zu beobachten, die als nahezu kugelförmige Tröpfchen auftraten. Darüber hinaus konnten wir mit dem Fluorophor BODIPY 493/503 Mikrovesikel (1 μm < d ≤ 3 μm), intermediäre Vesikel (3 μm < d ≤ 9 μm) und Makrovesikel (d > 9 μm) unterscheiden, was eine erfolgreiche Unterscheidung von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose ermöglicht. Insgesamt ist dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll ein zuverlässiges und einfaches Werkzeug für die hepatische LD-Charakterisierung und könnte einen ergänzenden Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen darstellen.
Introduction
Lipidtröpfchen (LDs), die klassischerweise als Energiedepots angesehen werden, sind spezialisierte Zellorganellen, die die Lipidspeicherung vermitteln, und sie bestehen aus einem hydrophoben neutralen Lipidkern, der hauptsächlich Cholesterinester und Triglyceride (TGs) enthält und von einer Phospholipid-Monoschicht eingekapselt ist 1,2,3.
Die LD-Biogenese findet im endoplasmatischen Retikulum (ER) statt, beginnend mit der Synthese von Triacylglycerin (TAG) und Sterolestern. Neutrale Lipide diffundieren in geringen Konzentrationen zwischen den Segeln der ER-Doppelschicht, verschmelzen aber zu Öllinsen, die wachsen und zu fast kugelförmigen Tröpfchen aus der ER-Membran austreiben, wenn ihre intrazelluläre Konzentration steigt4. Anschließend translozieren Proteine aus der ER-Doppelschicht und dem Zytosol, insbesondere die Perilipin (PLIN)-Proteinfamilie, auf die Oberflächen der LDs, um die Knospung zu erleichtern 5,6,7,8,9.
Durch die Synthese neuer Fettsäuren und die Fusion oder Koaleszenz von LDs wachsen LDs in unterschiedliche Größen heran. Dementsprechend unterscheiden sich Größe und Anzahl der LDs zwischen den verschiedenen Zelltypen erheblich. Kleine Tröpfchen (300-800 nm Durchmesser), die als initiale LDs (iLDs) bezeichnet werden, können von fast allen Zellen gebildet werden4. Später in der LD-Bildung sind die meisten Zellen in der Lage, einige iLDs in größere, expandierende LDs (eLDs >1 μm Durchmesser) umzuwandeln. Doch nur bestimmte Zelltypen, wie Adipozyten und Hepatozyten, haben die Fähigkeit, riesige oder übergroße LDs (bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser) zu bilden4,10.
LDs spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung des zellulären Fettstoffwechsels, der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von ER-Stress, mitochondrialer Dysfunktion und letztendlich des Zelltods, der durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht wird11,12,13,14. Darüber hinaus sind LDs auch an der Regulation der Genexpression, der Sequestrierung von viralen Replikationsproteinen sowie des Membrantransports und der Signalübertragung beteiligt15,16,17. Daher ist die Fehlregulation der LD-Biogenese ein Kennzeichen chronischer Krankheiten, die mit metabolischem Syndrom, Adipositas, Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und/oder Arteriosklerose, um nur einige zu nennen, assoziiert sind18,19,20.
Die Leber als Stoffwechselknotenpunkt ist hauptsächlich für den Fettstoffwechsel verantwortlich, indem sie Lipide speichert und verarbeitet, und ist daher ständig von Fettotoxizität bedroht21. Die hepatische Steatose (HS) ist ein häufiges Merkmal einer Reihe von fortschreitenden Lebererkrankungen und ist gekennzeichnet durch eine übermäßige intrazelluläre Lipidakkumulation in Form von zytosolischen LDs, die letztendlich zu Stoffwechselstörungen der Leber, Entzündungen und fortgeschrittenen Formen der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung führen können22,23,24,25. HS tritt auf, wenn die Rate der Fettsäureoxidation und des Exports als Triglyceride innerhalb von Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDLs) niedriger ist als die Rate der hepatischen Fettsäureaufnahme aus dem Plasma und der de novo Fettsäuresynthese26. Die hepatische Akkumulation von Lipiden tritt häufig in zwei Formen auf - mikrovesikuläre und makrovesikuläre Steatose -, und diese weisen unterschiedliche zytoarchitektonische Merkmale auf27. Typischerweise ist die mikrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein kleiner LDs gekennzeichnet, die über die gesamte Hepatozyten verteilt sind und deren Kern zentral platziert ist, während die makrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein einer einzigen großen LD gekennzeichnet ist, die den größten Teil der Hepatozyten einnimmt und den Kern in die Peripherie drückt28,29. Bemerkenswert ist, dass diese beiden Arten der Steatose oft zusammen gefunden werden, und es bleibt unklar, wie diese beiden LD-Muster die Krankheitspathogenese beeinflussen, da die Evidenz immer noch uneinheitlich ist31,32,33,34. Diese Art der Analyse wird jedoch häufig als "Referenzstandard" in präklinischen und klinischen Studien verwendet, um das dynamische Verhalten von LDs zu verstehen und die hepatische Steatose zu charakterisieren 29,34,35,36.
Leberbiopsien, der Goldstandard für die Diagnose und Einstufung von HS, werden routinemäßig durch histologische Hämatoxylin- und Eosinanalysen (H&E) beurteilt, bei denen Lipidtröpfchen als ungefärbte Vakuolen in H&E-gefärbten Leberschnitten ausgewertet werden37. Diese Art der Färbung ist zwar für die Beurteilung der makrovesikulären Steatose akzeptabel, schränkt aber im Allgemeinen die Beurteilung der mikrovesikulären Steatoseein 38. Fettlösliche Diazofarbstoffe, wie z. B. Oil Red O (ORO), werden klassischerweise mit der Hellfeldmikroskopie kombiniert, um intrazelluläre Lipidspeicher zu analysieren, aber diese haben immer noch eine Reihe von Nachteilen: (i) die Verwendung von Ethanol oder Isopropanol im Färbeprozess, was häufig zur Störung der nativen LDs und gelegentlich zur Fusion führt, obwohl die Zellen fixiert sind39; (ii) die zeitaufwändige Natur, da die ORO-Lösung aufgrund der begrenzten Haltbarkeit frisches Pulver auflöst und filtriert, was zu weniger konsistenten Ergebnissen beiträgt; (iii) und die Tatsache, dass ORO mehr als nur Lipidtröpfchen färbt und die hepatische Steatose oft überschätzt38.
Folglich wurden zelldurchlässige lipophile Fluorophore, wie z. B. Nilrot, entweder in lebenden oder fixierten Proben verwendet, um einige der oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Die unspezifische Natur der Markierung zellulärer Lipidorganellen schränkt die LD-Bewertungen jedoch immer wieder ein40. Darüber hinaus variieren die spektralen Eigenschaften von Nilrot je nach Polarität der Umgebung, was häufig zu spektralen Verschiebungen führen kann41.
Die lipophile Fluoreszenzsonde 1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (Anregungswellenlänge: 480 nm; Emissionsmaximum: 515 nm; BODIPY 493/503) weist hydrophobe Eigenschaften auf, die eine schnelle Aufnahme durch intrazelluläre LDs ermöglichen, akkumuliert sich im Lipidtröpfchenkern und emittiert anschließend hellgrüne Fluoreszenz12. Im Gegensatz zu Nilrot ist BODIPY 493/503 unempfindlich gegenüber der Polarität der Umgebung und hat sich als selektiver erwiesen, da es eine hohe Helligkeit für die LD-Bildgebung aufweist. Um neutrale LDs zu färben, kann dieser Farbstoff in lebenden oder fixierten Zellen verwendet und erfolgreich mit anderen Färbe- und/oder Markierungsmethoden gekoppelt werden42. Ein weiterer Vorteil des Farbstoffs besteht darin, dass er wenig Kraftaufwand erfordert, um ihn in eine Lösung zu geben, und stabil ist, so dass er nicht für jedes Experiment neu vorbereitet werden muss42. Obwohl die Sonde BODIPY 493/503 erfolgreich eingesetzt wurde, um die Lokalisation und Dynamik von LDs in Zellkulturen zu visualisieren, haben einige Berichte auch die zuverlässige Verwendung dieses Farbstoffs als LD-Bildgebungswerkzeug in Geweben wie dem menschlichen Musculus vastus lateralis43, dem Musculus soleus 42 der Ratte42 und dem Darmder Maus 44 gezeigt.
In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes BODIPY 493/503-basiertes Protokoll als alternativen analytischen Ansatz für die Bewertung der LD-Anzahl, -Fläche und des LD-Durchmessers in Leberproben aus einem Tiermodell der hepatischen Steatose vor. Dieses Verfahren umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die Färbebedingungen, die Bildaufnahme und die Datenanalyse.
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Protocol
Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von der Tierschutzbehörde des Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) (ORBEA, #9/2018) genehmigt und entsprachen den nationalen und europäischen Richtlinien für die Tierpflege sowie den ARRIVE-Richtlinien.
1. Versuchsplanung
- Paarhaltung von 13 Wochen alten männlichen Wistar-Ratten in belüfteten Käfigen unter kontrollierten Umgebungsbedingungen von Temperatur (22 °C ± 1 °C), Luftfeuchtigkeit (50%-60%) und Licht (12 h Hell-Dunkel-Zyklus) und mit Ad-libitum-Zugang zu Leitungswasser und Standard-Nagetierfutter.
- Nach einer 2-wöchigen Eingewöhnungsphase werden die Ratten willkürlich in zwei Gruppen eingeteilt.
- Füttern Sie die Kontrollgruppe (CTRL, n = 6) und die fettreiche Diätgruppe (HFD, n = 6) 24 Wochen lang mit Standardfutter bzw. einer fettreichen Diät (45 % kcal/Fett).
- Überwachen Sie wöchentlich das Körpergewicht (BW). Erfassen Sie den täglichen Verzehr von Speisen und Getränken pro Käfig.
2. Vorbereitung der Leberprobe
- Leberdissektion
- Peristaltikpumpe vorbereiten: 70%iges Ethanol durch den Schlauch laufen lassen, eine 27-G-Nadel an das Auslassende des Schlauchs anschließen und den Schlauch mit eiskalter (4 °C) 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH ~7,4) ansaugen (z. B. 200 U/min an einer Peristaltikpumpe mit 1,6 mm Innendurchmesser Silikonschlauch, IV-Mini-Tropfset). Passen Sie das Körpergewicht an (z. B. verwenden Sie für eine 100-150 g schwere Ratte eine Flussrate von ca. 10-12 ml/min).
- Die Ratte wird durch eine intraperitoneale Injektion unter Verwendung eines Anästhesieprotokolls betäubt (die Endkonzentration von Ketamin = 75 mg/kg und die Endkonzentration von Medetomidin = 1 mg/kg).
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Ratte mit der Zehenquetschmethode vollständig betäubt ist. - Legen Sie die Ratte auf das Seziertablett.
- Desinfizieren Sie das Fell gründlich mit 70% Ethanol und trocknen Sie es mit einem Papiertuch.
- Machen Sie mit einer Schere einen U-förmigen Schnitt durch die Haut und schneiden Sie unterhalb des Zwerchfells auf. Schneiden Sie dann den Brustkorb an den Rändern rostal durch, um das Herz freizulegen.
- Während das 1x PBS läuft, führen Sie die Nadel durch die linke Herzkammer in die aufsteigende Aorta und klemmen Sie sie ab. Dann wird der rechte Vorhof geschnitten, um eine Drainage zu ermöglichen, sobald die Durchblutung begonnen hat.
Anmerkungen: Die Leber sollte anfangen zu blanchieren, wenn das Blut durch PBS ersetzt wird. - Entfernen Sie die Leber vorsichtig mit einer Schere und einer Dumont-Pinzette und spülen Sie sie mit 1x PBS ab.
- Übertragen Sie die Leber auf eine Petrischale und wiegen Sie sie.
- Sammeln Sie mit einem Skalpell 5 mm dicke Lebergewebeproben von der lateralen Seite (1 cm vom Rand entfernt) des linken Leberlappens für den Einbettungsprozess.
HINWEIS Das restliche Gewebe kann zur Langzeitlagerung bei −80 °C gelagert werden.
- Einbettung von Lebergewebe
- Bereiten Sie einen Trockeneisbehälter vor und beschriften Sie die Kryoformen ordnungsgemäß mit der Proben-ID und -ausrichtung.
- Geben Sie ein paar Tropfen der Kryo-Einbettungsmatrix auf die Mitte des Kryomolds, um die optimale Schnitttemperatur (OCT) zu erreichen.
- Stellen Sie sicher, dass die Gewebeprobe für einen Querschnitt richtig ausgerichtet ist.
Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Seite, die den Boden des Kryofolds berührt, die Seite ist, die zuerst geschnitten wird. - Geben Sie vorsichtig mehr OCT auf das Kryomold, bis es vollständig bedeckt ist. Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Entfernen Sie bei Bedarf mit einer einfachen Pinzette alle Blasen im OCT.
- Legen Sie das Kryomold mit der OCT-bedeckten Probe schnell in einen Trockeneisbehälter.
HINWEIS: Die Gewebe können 3 Jahre bei −80 °C gelagert werden.
3. Schnitt von gefrorenem Gewebe
- Stellen Sie die Kryostattemperatur ein (Kammer: −21 °C; Probe: −18 °C) und setzen Sie eine neue sterile Klinge ein.
- Legen Sie die Proben für 30 Minuten in den Kryostaten, bevor Sie die Temperatur ausgleichen lassen.
- Machen Sie eine einzelne Schicht OCT auf der Probenscheibe, um die Haftung der Probe zu ermöglichen. Lassen Sie das OCT einfrieren und montieren Sie die Gewebeprobe in der gewünschten Ausrichtung.
Anmerkungen: Die Schnittfläche sollte parallel zur Klinge sein. Um eine gute Haftung zu gewährleisten, platzieren Sie den Wärmeabsauger auf der Oberseite der Probe. Die vorherigen Schritte können auch in einem Trockeneisbehälter mit Trockeneis durchgeführt werden. - Legen Sie die Probe in den Probenkopf und schneiden Sie die Oberfläche des Gewebes ab (einige 30 μm große Gewebeprobenabschnitte).
- Sobald der interessierende Bereich für die Schnitterstellung zugänglich ist, schneiden Sie 12 μm dicke Schnitte und legen Sie sie auf beschriftete Objektträger, die bei Raumtemperatur (RT) aufbewahrt werden.
Anmerkungen: Um den Schnitt zu entnehmen, bewegen Sie den Objektträger langsam in Richtung des Gewebeschnitts. Auf jedem Objektträger können zwei Leberabschnitte gesammelt werden. - Lassen Sie die Objektträger 10 Minuten bei RT trocknen.
HINWEIS: Die Objektträger können 6-12 Monate bei −20 °C oder bis zu 3 Jahre bei −80 °C gelagert werden.
4. BODIPY-Färbung
- Tauen Sie die Objektträger in einem Objektträgerfärbesystem bei RT für 30 Minuten auf.
- Mit 1x PBS waschen (je 3x für je 5 min).
- Umkreisen Sie den Abschnitt mit einer hydrophoben Schicht und verwenden Sie einen Barrierestift.
- 500 μg/ml BODIPY 493/503 Stammlösung herstellen: 1 mg BODIPY 493/503 in 2 ml Lösungsmittel (90 % DMSO; 10 % 1x PBS) auflösen. Vor Licht schützen. Beschallung im Ultraschallbad für 1 h (9,5-10 W) bei 37 °C.
Anmerkungen: Die Lösung kann mindestens 30 Tage bei −20 °C gelagert werden. - Bereiten Sie die BODIPY-Färbelösung (1 μg/ml) vor, indem Sie 2 μl BODIPY 493/503-Stammlösung und 0,1 μl DAPI-Stammlösung (5 mg/ml) zu 997,9 μl 1x PBS hinzufügen.
- Die Objektträger (75 μl/Objektträger) werden mit BODIPY 493/503 (1 μg/ml) und DAPI (0,1 μg/ml) bei RT für 40 min inkubiert.
HINWEIS: Halten Sie die Folien ab diesem Schritt im Dunkeln. - Waschen Sie die Objektträger mit 1x PBS (3x für je 5 min).
- Fixieren Sie die Objektträger mit Deckgläsern mit einem Fluoreszenz-Eindeckmedium, lassen Sie sie 30 Minuten trocknen und versiegeln Sie sie mit Nagellack.
HINWEIS: Die Objektträger können bis zur Belichtung bei 4 °C gelagert werden.
5. Quantifizierung der Lipide
- Messen Sie den Gesamtcholesterin- und TG-Spiegel im Serum mit einer automatischen, validierten Methode und Ausrüstung.
- Messen Sie die hepatischen TG-Spiegel mit einem kolorimetrischen Triglycerid-Assay-Kit (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
6. Bildaufnahme
- Legen Sie den Objektträger auf den konfokalen Laserscanning-Objektträgerhalter.
- Verwenden Sie für die Bildvisualisierung und -aufnahme ein konfokales Mikroskop mit einer 20-fach-Objektivlinse (Plan-Apochromat: 20-fach/0,8).
- Um ein Übersprechen zwischen dem BODIPY 493/503 und dem DAPI zu vermeiden, verwenden Sie den sequenziellen Scan-Modus (bestes Signal) in der konfokalen Software.
- Anregen Sie den BODIPY 593/503 mit der 488 nm Argon-Laserlinie und den DAPI mit der 405 nm Laserlinie. Stellen Sie die Emissionsbereiche auf 493-589 nm für BODIPY 493/503 und auf 410-464 nm für DAPI ein.
- Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Lochblende: 1 AE, Auflösung: 1.024 Pixel x 1.024 Pixel, Bittiefe: 12, Pixelgröße: 0,415 μm, bidirektionaler Modus, Scangeschwindigkeit: 7 (~1,58 μs/Pixel für ein 20-faches Objektiv), Zeilenmittelung: 2x und Digitalzoom: 1.
HINWEIS: Die oben genannten Scanparameter müssen für jedes verwendete konfokale Mikroskop und Objektiv optimiert werden. - Stellen Sie die Verstärkung und die digitale Verstärkung so ein, dass keine gesättigten Pixel auf der Entfernungsanzeige erkannt werden.
HINWEIS: Korrigieren Sie das Hintergrundsignal, indem Sie den Offset anpassen. - Sobald die LDs korrekt identifiziert sind, nehmen Sie das Bild mit den BODIPY- und DAPI-Kanälen auf.
HINWEIS: Alle Bilder müssen unter den gleichen Bedingungen (Belichtung und allgemeine Einstellungen) für jeden Farbkanal aufgenommen werden. - Um großflächige Bilder zu erstellen (Abbildung 2), wechseln Sie das Objektiv zu einer 10-fach-Objektivlinse (Plan-Neofluar: 10-fach/0,3).
- Wählen Sie den Kachelscan-Modus und erstellen Sie Mosaike aus 5 pro 5 Bildern.
HINWEIS: In dieser Arbeit hatte jede Kachel eine Überlappung von 10 %, um die Kacheln für die Analyse angemessen zusammenzuführen. - Um 3D- und orthogonale Ansichten zu erstellen (Abbildung 3A), geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die Oberseite des Deckglases und tauschen Sie das Objektiv gegen eine 40-fache Objektivlinse aus (plan-neofluar: 40-fach/1,30 Öl).
- Wählen Sie den Z-Stack-Modus und definieren Sie durch Anpassen der Z-Ebene die erste und letzte Position für die Erfassung mit einer optischen Schicht mit einer optimalen Dicke (~0,5 μm), um sicherzustellen, dass alle Tröpfchen erfasst werden.
HINWEIS: Um die Bildaufnahme zu beschleunigen und ein Ausbleichen zu vermeiden, kann der optische Schnitt auf eine suboptimale Größe eingestellt werden, um ein Oversampling von mindestens 30 % für eine gute 3D-Rekonstruktion zu gewährleisten. - Wählen Sie das Modul Ortho aus, und erstellen Sie orthogonale Ansichten.
- Erfassen Sie 3D-Bilder, indem Sie das 3D-Modul nach dem Transparenz-Rendering-Modus mit der konfokalen Mikroskop-Software auswählen.
7. Analyse von Bildern
- Verarbeiten und analysieren Sie die Einzelebenenbilder (20-fache Vergrößerung) mit CellProfiler (Version 4.2.5).
HINWEIS: Die in dieser Arbeit verwendete Pipeline wurde von Adomshick et al.45. Der Teufel - Klicken Sie auf das Modul Bilder in der oberen linken Ecke des CellProfiler-Fensters und laden Sie die Bilder als .tiff Dateien hoch.
- Verwenden Sie das NamesAndTypes-Modul , um basierend auf den Dateinamen zwischen BODIPY- (Tröpfchen) und DAPI- (Kernen) gefärbten Bildern zu sortieren. Führen Sie die LD-Analyse nur mit BODIPY-gefärbten Bildern durch.
- Um die Pipeline-Konstruktion zu starten, klicken Sie auf Module anpassen und wählen Sie das Modul ColorToGray aus, um die Bilder in Graustufenbilder zu konvertieren.
HINWEIS: Zur Identifizierung von Objekten sind Graustufenbilder erforderlich. - Identifizieren Sie Tröpfchen, indem Sie das IdentifyPrimaryObjects-Modul mithilfe des Graustufenbilds verwenden.
HINWEIS: Die Parameter in diesem Modul müssen angepasst werden, um eine gute LD-Identifizierung zu erreichen. In dieser Arbeit führte die Definition von LDs mit einer Größe zwischen 6 Pixeln und 300 Pixeln und einem Schwellenwertkorrekturfaktor von 1,0 zur genauesten Identifizierung. - Um die Pixelintensität der identifizierten Lipidtröpfchen zu messen, fügen Sie ein MeasureObjectIntensity-Modul hinzu.
- Fügen Sie ein zusätzliches FilterObjects-Modul hinzu, um sicherzustellen, dass nur die stärksten Signale quantifiziert werden, während weniger intensive Signale von der abschließenden Lipidtröpfchenanalyse ausgeschlossen werden (minimale Intensität: 0,15; maximale Intensität: 1 beliebige Einheit).
- Um die LDs zu messen, die sich auf die Ausgabedaten beziehen, fügen Sie das Modul MeasureObjectSizeShape hinzu.
- Fügen Sie an dieser Stelle ein OverlayOutlines-Modul hinzu, um das identifizierte Tröpfchen über das Originalbild zu legen und so sicherzustellen, dass die Segmentierung auch auf dem unverarbeiteten Bild korrekt aussieht.
HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt (Qualitätskontrolle). - Fügen Sie am Ende ein ExportToSpreadsheet-Modul hinzu und klicken Sie auf die Schaltfläche Bilder analysieren in der unteren linken Ecke.
8. Statistische Analyse
- Drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.) mit einer beliebigen Software für die statistische Analyse aus.
HINWEIS: In dieser Studie wurde die GraphPad-Software für die statistische Analyse verwendet. - Analysieren Sie die Verteilung der Werte mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test, um signifikante Abweichungen von der Normalverteilung zu bewerten. Analysieren Sie die parametrischen Daten mit dem ungepaarten t-Test des Schülers.
HINWEIS: Werte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
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Representative Results
Die erfolgreiche Durchführung dieser Technik sollte zu einer eindeutigen Lipidtröpfchenfärbung für die gleichzeitige Charakterisierung der LD-Morphologie (Form und Lipidkerndichte basierend auf der 3D-Rekonstruktion) zusammen mit ihrer räumlichen Verteilung, Anzahl pro Gesamtfläche und durchschnittlicher Größe (bewertet mit der oben beschriebenen Pipeline, Abbildung 1) führen.
Abbildung 1: Beispielhafte Bildverarbeitung mit CellProfiler . (A) Originalbild von LDs, die mit BODIPY 493/503 (grün) gefärbt wurden, und Kernen, die mit DAPI (blau) in der CTL-Gruppe gefärbt wurden. (B) Die differenzierten LDs (magenta) der CTL-Gruppe wurden mit dem Modul OverlayOutlines überlagert. (C) Originalbild von LDs, die mit BODIPY 493/503 (grün) gefärbt wurden, und Kernen, die mit DAPI (blau) in der HFD-Gruppe gefärbt wurden. (D) Die differenzierten LDs (Magenta) der HFD-Gruppe wurden mit dem Modul OverlayOutlines überlagert. Die Bilder wurden mit 20-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Laserpunkt-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: CTL = Kontrollgruppe; HFD = fettreiche Diätgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Serum-TGs, Gesamtcholesterin, LDL-c, HDL-c sowie die hepatischen TG-Gehalte wurden ausgewertet (Tabelle 1). Die mit HFD gefütterten Tiere wiesen ein ausgeprägtes dyslipidämisches Profil auf, das durch eine akzentuierte Akkumulation von hepatischen TGs ( 345 % im Vergleich zu CTL, p < 0,001) sowie einen subtilen Anstieg der zirkulierenden TG-Spiegel (129 % im Vergleich zu CTL, p > 0,05) gekennzeichnet war.
| Parameter | CTL | HFD | |
| Serum | |||
| Gesamtcholesterin (mg/dl) | 56.67 ± 9.35 | 80.40 ± 7.45 | |
| LDL (mg/dl) | 7,66 ± 0,84 | 7.40 ± 1.03 | |
| HDL (mg/dl) | 17.83 ± 2.93 | 28.40 ± 2.40 * | |
| Triglyceride (mg/dl) | 154,8 ± 40,17 | 201,2 ± 38,12 | |
| Leber | |||
| Triglyceride (mg/g) | 15.29 ± 1.31 | 52.83 ± 6.73 *** |
Tabelle 1: Serum-TGs, Gesamtcholesterin, LDL-c, HDL-c und die hepatischen TG-Gehalte. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt (n = 5-6 pro Gruppe). p < 0,001 gegenüber CTL. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten t-Test eines Schülers durchgeführt. Abkürzungen: CTL = Kontrollgruppe; HFD = fettreiche Diätgruppe.
Abbildung 2 zeigt repräsentative Weitbereichsbilder (Kachelscans mit einem 10-fachen Objektiv) von Leberschnitten, in denen LDs mit BODIPY 493/503 (grün) und Zellkerne mit DAPI (blau) gefärbt sind. Einzelne LDs unterschiedlicher Größe wurden erfolgreich mit BODIPY 493/503 Färbung visualisiert, die ein weit verbreitetes Verteilungsmuster in den HFD-gefütterten Tieren zeigte.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der LD-Akkumulation im Lebergewebe. LDs, die mit BODIPY 493/503 (grün) gefärbt wurden, und Kerne, die mit DAPI (blau) gefärbt wurden. Die Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Laserpunkt-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzungen: CTL = Kontrollgruppe; HFD = fettreiche Diätgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3A zeigt repräsentative orthogonale Projektionen mit einem 20x-Objektiv und 3D-Bilder mit einem 40x-Objektiv hepatischer LDs. Einzelebenenbilder wurden mit CellProfiler (Version 4.2.5) verarbeitet und analysiert, um die Fluoreszenzintensität, -anzahl, -fläche und -durchmesser der LCs zu beurteilen (Abbildung 3B-E). Es konnte bestätigt werden, dass die mit HFD gefütterten Tiere eine erhöhte Anzahl hepatischer LDs aufwiesen (151% vs. CTL, Abbildung 3B), was durch die erhöhte BODIPY 493/503 Fluoreszenzintensität (182% vs. CTL, p < 0,001, Abbildung 3C) bestätigt wurde. Darüber hinaus hat sich das Flächenverhältnis der LDs fast verdreifacht (360 % vs. CTL, p < 0,0001, Abbildung 3D), da sie bei den mit HFD gefütterten Tieren größere Durchmesser (182 % vs. CTL, Abbildung 3E) aufwiesen. Zur Beurteilung der Größenverteilung wurden die LDs nach den Durchmesserbereichen in drei Gruppen eingeteilt: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm und d > 9 μm (Abbildung 3F). Die Tiere, die mit dem HFD gefüttert wurden, zeigten einen Anstieg der Anzahl der übergroßen, makrovesikulären Leber-LDs um mehr als 20 % (d > 9 μm, p < 0,0001) sowie eine fast dreifache Verringerung der Anzahl der Mikrovesikel mit einem Durchmesser von weniger als 3 μm (1 μm < d ≤ 3 μm, p < 0,0001).
Abbildung 3: Orthogonale/3D-Ansichten von LDs und Datenanalyse. (A) Repräsentative orthogonale Projektionen und 3D-gerenderte Bilder von hepatischen Lipidtröpfchen (grün, BODIPY 493/503) und Zellkernen (blau, DAPI) in der Leber von Mäusen, die mit einer normalen oder HFD-Diät gefüttert wurden. Die Bilder wurden mit 20-facher (links) und 40-facher (rechts) Vergrößerung mit einem konfokalen Laserpunkt-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Anzahl der hepatischen LDs. (C) Fluoreszenzintensität der hepatischen LDs. (D) Flächenverhältnis der hepatischen LDs. (E) Lipidtröpfchendurchmesser. (F) Fraktionsverhältnisse von Gruppen hepatischer Lipidtröpfchen mit unterschiedlichen Durchmessern: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm und d > 9 μm. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. n = 5-6 Mäuse/Gruppe; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Die statistische Analyse wurde mit dem ungepaarten t-Test eines Schülers durchgeführt. Abkürzungen: CTL = Kontrollgruppe; HFD = fettreiche Diätgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll zur LD-Beurteilung zielte darauf ab, einen neuen Bildgebungsansatz für die Beurteilung der hepatischen Steatose zu entwickeln. Aufgrund des starken Zusammenhangs zwischen Adipositas und Fettlebererkrankungen wurde die fettreiche Diät nach westlichem Vorbild verwendet, um ein Tiermodell der Lebersteatose zu etablieren26. Ein robuster Anstieg der hepatischen TG-Gehalte wurde durch ein quantitatives kolorimetrisches Triglycerid-Assay-Kit bestätigt, das auf ein erhöhtes hepatisches Lipidose-Szenario bei den mit HFD gefütterten Tieren hindeutete. Anschließend wurde der Grad der LD-Akkumulation mit der Fluoreszenzsonde BODIPY 493/503 unter geringer Vergrößerung visualisiert. Wie erwartet, zeigte die BODIPY 493/503-Färbung eine weit verbreitete Verteilung vesikulärer Strukturen über das Lebergewebe in der HFD-Gruppe. Mittels orthogonaler Projektionen und 3D-Rekonstruktionen konnte beobachtet werden, dass der LD-Kern einen vollen Gehalt an neutralen Lipiden aufwies, die als nahezu kugelförmige Tröpfchen auftraten. Darüber hinaus war der robuste Anstieg der LD-Fläche pro Gesamtfläche deutlich erkennbar (360 % gegenüber der CTL-Gruppe), und dieser Bereich war aufgrund ihres quantitativen Scores in der HFD-Gruppe (52,83 mg/g ± 6,73 mg/g; 346 % gegenüber der CTL-Gruppe) höchstwahrscheinlich mit neutralen TGs gefüllt. Um die LD-Dynamik bei HFD-Fütterung weiter zu charakterisieren, wurde die mikro- oder makrovesikuläre Natur der hepatischen Steatose analysiert. Anhand der zuvor in der Literatur 4,46,47 beschriebenen LD-Durchmesserbereiche konnte ein signifikanter Abfall der mikrovesikulären LD-Zahl (1 μm < d ≤ 3 μm) unterschieden werden, der parallel zu einem proportionalen Anstieg der LD-Makrovesikel (d > 9 μm) ging. Mehrere Studien haben berichtet, dass LDs in Hepatozyten übergroße LDs (bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser) bilden können4,46,47, was mit den vorliegenden Ergebnissen übereinstimmt.
In den letzten Jahren wurden klassische Lipidfarbstoffe allmählich durch eine neue Anordnung fluoreszierender lipophiler Sonden, wie z. B. BODIPY, ersetzt, da ihre neutrale und planare Struktur durch einen Difluorborkomplex stabilisiertwird 48; Diese Sonden haben sich als sehr effektiv bei der Markierung von LDs erwiesen, um ihre Morphologie, Dynamik und Interaktion mit anderen Organellen in lebenden Zellen und einigen fixierten Geweben zu untersuchen49,50. Innerhalb des hier vorgestellten Protokolls für fluoreszenzgefärbte Lipidtröpfchen zur Beurteilung der hepatischen Steatose gibt es einige entscheidende Schritte für den Erfolg der Technik, die hauptsächlich auf der Gewebepräparation und der Bildaufnahme beruhen. Da das BODIPY-Signal durch UV-Licht51 gebleicht werden kann, muss die LD-Bildgebungserfassung vor der Abbildung anderer Fluoreszenzfarbstoffe erfolgen, die durch UV-Licht angeregt werden, wie z. B. die allgemein bekannten DNA-Fluoreszenzfarbstoffe. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, die Objektträger vor Lichteinwirkung zu schützen, um eine BODIPY-Fluoreszenzlöschung vor der Bildgebung zu verhindern. Obwohl die 3D-Rekonstruktion von LDs für die Untersuchung ihrer Morphologie sehr nützlich ist, ist sie extrem zeitaufwändig, da 3D-rekonstruierte Bilder aus mehreren unabhängigen 2D-Bildern zusammengesetzt sind. Daher sollten Forscher in Betracht ziehen, diesen Schritt zu vermeiden, wenn das primäre Ziel des Experiments ausschließlich die Beurteilung der mikro- und makrovesikulären Lebersteatose ist. Um Verzerrungen zu vermeiden, sollten zwei unabhängige Beobachter, die für die Behandlungsgruppe blind sind, die Datenerfassung und -analyse durchführen. Die halbautomatische Bildverarbeitungssoftware (Cell Profiler Pipeline) trägt weiter zu einer halbblinden Quantifizierung bei und überwindet die bei der manuellen Analyse durchgängig beobachtete erhöhte Verarbeitungszeit.
Diese Technik kann in Kombination mit der immunhistochemischen Färbung anderer Gewebe und Spezies auf breitere Anwendungen ausgeweitet werden, sofern die optimalen BODIPY-Konzentrationen und Bildaufnahmeeinstellungen bestimmt wurden, um das Signal-/Hintergrundverhältnis zu maximieren. Solche Versuchsanordnungen können den gleichzeitigen Nachweis anderer Antigene ermöglichen, vorausgesetzt, dass sich der zweite verwendete Fluorophor nicht mit den BODIPY-Anregungs-/Emissionsspektren überlappt.
Insgesamt ist das hier vorgestellte optimierte BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll ein zuverlässiges und einfaches Werkzeug für die LD-Charakterisierung und könnte einen ergänzenden Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen darstellen, die häufig zur Bestätigung und Einstufung der hepatischen Steatose verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde aus nationalen und europäischen Mitteln über die portugiesische Wissenschafts- und Technologiestiftung (FCT), den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) und das Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) finanziert: 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) und POCI-01-0145-FEDER-007440. Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung von iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, einer Einrichtung der Medizinischen Fakultät der Universität Coimbra und Mitglied der nationalen Infrastruktur PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), sowie für die Unterstützung von FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
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