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Biochemistry

हेपेटिक स्टीटोसिस मूल्यांकन के लिए 3 डी पुनर्निर्माण के साथ फ्लोरोसेंट-सना हुआ लिपिड बूंदों का विश्लेषण

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65206
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4
1Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 3Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 4Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

Summary

यहां, हम यकृत ऊतक में लिपिड बूंद लक्षण वर्णन के लिए एक अनुकूलित बीओडीआईपीवाई 493/503 प्रतिदीप्ति-आधारित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं। ऑर्थोगोनल अनुमानों और 3 डी पुनर्निर्माण के उपयोग के माध्यम से, फ्लोरोफोरे माइक्रोवेसिकुलर और मैक्रोवेसिकुलर स्टीटोसिस के बीच सफल भेदभाव की अनुमति देता है और हेपेटिक स्टीटोसिस मूल्यांकन के लिए शास्त्रीय हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल के लिए एक पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

Abstract

लिपिड ड्रॉपलेट्स (एलडी) विशेष अंग हैं जो लिपिड भंडारण को मध्यस्थ करते हैं और लिपोटॉक्सिसिटी को दबाने और मुक्त फैटी एसिड (एफए) के कारण होने वाली शिथिलता को रोकने में बहुत महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यकृत, शरीर के वसा चयापचय में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, माइक्रोवेसिकुलर और मैक्रोवेसिकुलर हेपेटिक स्टीटोसिस दोनों के रूप में एलडी के इंट्रासेल्युलर संचय से लगातार खतरा होता है। एलडी का हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन आमतौर पर लिपिड-घुलनशील डायज़ो रंगों पर आधारित होता है, जैसे कि ऑयल रेड ओ (ओआरओ) धुंधला, लेकिन कई नुकसान लगातार यकृत नमूनों के साथ इस विश्लेषण के उपयोग में बाधा डालते हैं। हाल ही में, लिपोफिलिक फ्लोरोफोरेस 493/503 तटस्थ लिपिड ड्रॉपलेट कोर में उनके तेजी से उत्थान और संचय के कारण एलडी को देखने और पता लगाने के लिए लोकप्रिय हो गए हैं। भले ही अधिकांश अनुप्रयोगों को सेल संस्कृतियों में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, ऊतक के नमूनों में एलडी इमेजिंग उपकरण के रूप में लिपोफिलिक फ्लोरोफोरे जांच के विश्वसनीय उपयोग का प्रदर्शन करने वाले कम सबूत हैं। यहां, हम उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) प्रेरित यकृत स्टीटोसिस के पशु मॉडल से यकृत नमूनों में एलडी के मूल्यांकन के लिए एक अनुकूलित बोरॉन डाइप्रोमेथेन (बीओडीआईपीवाई) 493/503-आधारित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। इस प्रोटोकॉल में यकृत नमूना तैयारी, ऊतक खंडन, बीओडीआईपीवाई 493/503 धुंधला, छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण शामिल है। हम एचएफडी फीडिंग पर हेपेटिक एलडी की बढ़ी हुई संख्या, तीव्रता, क्षेत्र अनुपात और व्यास का प्रदर्शन करते हैं। ऑर्थोगोनल अनुमानों और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके, एलडी कोर में तटस्थ लिपिड की पूरी सामग्री का निरीक्षण करना संभव था, जो लगभग गोलाकार बूंदों के रूप में दिखाई दिया। इसके अलावा, फ्लोरोफोर बीओडीआईपीवाई 493/503 के साथ, हम माइक्रोवेसिकल्स (1 μm < d ≤ 3 μm), मध्यवर्ती पुटिकाओं (3 μm < d ≤ 9 μm), और मैक्रोवेसिकल्स (d > 9 μm) को अलग करने में सक्षम थे, जिससे माइक्रोवेसिकुलर और मैक्रोवेसिकुलर स्टीटोसिस के सफल भेदभाव की अनुमति मिलती है। कुल मिलाकर, यह बीओडीआईपीवाई 493/503 प्रतिदीप्ति-आधारित प्रोटोकॉल यकृत एलडी लक्षण वर्णन के लिए एक विश्वसनीय और सरल उपकरण है और शास्त्रीय हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल के लिए एक पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

Introduction

लिपिड बूंदें (एलडी), शास्त्रीय रूप से ऊर्जा डिपो के रूप में देखी जाती हैं, विशेष सेलुलर ऑर्गेनेल हैं जो लिपिड भंडारण की मध्यस्थता करते हैं, और उनमें एक हाइड्रोफोबिक न्यूट्रल लिपिड कोर शामिल होता है, जिसमें मुख्य रूप से कोलेस्ट्रॉल एस्टर और ट्राइग्लिसराइड्स (टीजी) होते हैं, जो फॉस्फोलिपिड मोनोलेयर 1,2,3 द्वारा समझाया जाता है।

एलडी बायोजेनेसिस एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में होता है, जो ट्राईसिलेग्लिसरॉल (टीएजी) और स्टेरोल एस्टर के संश्लेषण से शुरू होता है। तटस्थ लिपिड कम सांद्रता पर ईआर बाइलेयर के पत्रक के बीच फैल जाते हैं, लेकिन तेल लेंस में समा जाते हैं जो ईआर झिल्ली से लगभग गोलाकार बूंदों में बढ़ते हैं और कली होते हैं जब उनकी इंट्रासेल्युलरएकाग्रता बढ़ जाती है। इसके बाद, ईआर बाइलेयर और साइटोसोल से प्रोटीन, विशेष रूप से पेरिलिपिन (पीएलआईएन) प्रोटीन परिवार, 5,6,7,8,9 को सुविधाजनक बनाने के लिए एलडी की सतहों पर स्थानांतरित हो जाते हैं।

नए फैटी एसिड संश्लेषण और एलडी संलयन या सहवास के माध्यम से, एलडी विभिन्न आकारों में बढ़ते हैं। तदनुसार, विभिन्न सेल प्रकारों में एलडी का आकार और संख्या काफी भिन्न होती है। छोटी बूंदें (300-800 एनएम व्यास), जिन्हें प्रारंभिक एलडी (आईएलडी) के रूप में जाना जाता है, लगभगसभी कोशिकाओं द्वारा बनाई जा सकती हैं। बाद में एलडी गठन में, अधिकांश कोशिकाएं कुछ आईएलडी को बड़े लोगों में बदलने में सक्षम होती हैं-विस्तारित एलडी (ईएलडी >1 μm व्यास में)। फिर भी, सिर्फ विशिष्ट सेल प्रकार, जैसे कि एडिपोसाइट्स और हेपेटोसाइट्स, विशाल या सुपरसाइज्ड एलडी (व्यास में दसियों माइक्रोन तक) बनाने की क्षमता रखते हैं।

एलडी सेलुलर लिपिड चयापचय के नियमन में बहुत महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लिपोटॉक्सिसिटी को दबाते हैं, और ईआर तनाव, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को रोकते हैं, और अंततः, मुक्त फैटी एसिड (एफए) 11,12,13,14 के कारण कोशिका मृत्यु को रोकते हैं। इसके अलावा, एलडी को जीन अभिव्यक्ति, वायरल प्रतिकृति प्रोटीन अनुक्रम, और झिल्ली तस्करी और सिग्नलिंग15,16,17 के विनियमन में भी फंसाया गया है। इसलिए, एलडी बायोजेनेसिस का गलत विनियमन चयापचय सिंड्रोम, मोटापा, टाइप 2 मधुमेह मेलेटस (टी 2 डीएम), और / या धमनीकाठिन्य से जुड़ी पुरानी बीमारियों की एक पहचान है, कुछ18,19,20 नाम देने के लिए।

यकृत, एक चयापचय हब के रूप में, ज्यादातर लिपिड को संग्रहीत और संसाधित करके लिपिड चयापचय के लिए जिम्मेदार है, और इसलिए, यह लगातार लिपोटॉक्सिसिटी21 से खतरा है। हेपेटिक स्टीटोसिस (एचएस) प्रगतिशील यकृत रोगों की एक श्रृंखला की एक सामान्य विशेषता है और साइटोसोलिक एलडी के रूप में अत्यधिक इंट्रासेल्युलर लिपिड संचय की विशेषता है, जो अंततः, यकृत चयापचय शिथिलता, सूजन और गैर-मादक फैटी यकृत रोग 22,23,24,25 के उन्नत रूपों का कारण बन सकता है।. एचएस तब होता है जब फैटी एसिड ऑक्सीकरण और बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल) के भीतर ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में निर्यात की दर प्लाज्मा और डी नोवो फैटी एसिड संश्लेषण26 से यकृत फैटी एसिड अपटेक की दर से कम होती है। लिपिड का यकृत संचय अक्सर दो रूपों में होता है- माइक्रोवेसिकुलर और मैक्रोवेसिकुलर स्टीटोसिस- और ये अलग-अलग साइटोआर्किटेक्टोनिकविशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं। आमतौर पर, माइक्रोवेसिकुलर स्टीटोसिस को नाभिक के साथ पूरे हेपेटोसाइट में फैले छोटे एलडी की उपस्थिति की विशेषता होती है, जबकि मैक्रोवेसिकुलर स्टीटोसिस को एक बड़े एलडी की उपस्थिति की विशेषता होती है जो हेपेटोसाइट के बड़े हिस्से पर कब्जा कर लेता है, नाभिक को परिधि28,29 तक धकेल देता है।. विशेष रूप से, इन दो प्रकार के स्टीटोसिस अक्सर एक साथ पाए जाते हैं, और यह स्पष्ट नहीं है कि ये दो एलडी पैटर्न रोग रोगजनन को कैसे प्रभावित करते हैं, क्योंकि सबूत अभी भी असंगत हैं31,32,33,34। फिर भी, इस तरह के विश्लेषण को अक्सर एलडी के गतिशील व्यवहार को समझने और हेपेटिक स्टीटोसिस 29,34,35,36 को चिह्नित करने के लिए प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययनों में "संदर्भ मानक" के रूप में नियोजित किया जाता है।

यकृत बायोप्सी, एचएस के निदान और ग्रेडिंग के लिए स्वर्ण मानक, नियमित रूप से हिस्टोलॉजिकल हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, जहां लिपिड बूंदों का मूल्यांकन एच एंड ई-दाग वाले यकृत खंड37 में बिना दाग वाले रिक्तिका के रूप में किया जाता है। जबकि मैक्रोवेसिकुलर स्टीटोसिस मूल्यांकन के लिए स्वीकार्य है, इस प्रकार का धुंधलापन आम तौर पर माइक्रोवेसिकुलर स्टीटोसिस38 के मूल्यांकन को संकीर्ण करता है। लिपिड घुलनशील डायजो रंजक, जैसे कि ऑयल रेड ओ (ओआरओ), इंट्रासेल्युलर लिपिड स्टोर का विश्लेषण करने के लिए ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ शास्त्रीय रूप से संयुक्त होते हैं, लेकिन इनके अभी भी कई नुकसान हैं: (i) धुंधला प्रक्रिया में इथेनॉल या आइसोप्रोपेनोल का उपयोग, जो अक्सर कोशिकाओंको तय करने के बावजूद देशी एलडी और कभी-कभी संलयन के विघटन का कारण बनता है।; (ii) समय लेने वाली प्रकृति, क्योंकि ओआरओ समाधान को सीमित शेल्फ जीवन के कारण ताजा पाउडर घुलने और छानने की आवश्यकता होती है, इस प्रकार कम सुसंगत परिणामों में योगदान होता है; (iii) और तथ्य यह है कि ओआरओ केवल लिपिड बूंदों से अधिक दाग लगाता है और अक्सर हेपेटिक स्टीटोसिस38 को अधिक महत्व देता है।

नतीजतन, सेल-पारगम्य लिपोफिलिक फ्लोरोफोरेस, जैसे कि नील रेड, का उपयोग उपरोक्त सीमाओं में से कुछ को दूर करने के लिए जीवित या निश्चित नमूनों में किया गया है। हालांकि, सेलुलर लिपिड ऑर्गेनेल लेबलिंग की गैर-विशिष्ट प्रकृति बार-बार एलडी आकलनको संकीर्ण करती है। इसके अलावा, नील लाल के वर्णक्रमीय गुण पर्यावरण की ध्रुवीयता के अनुसार भिन्न होते हैं, जिससे अक्सर वर्णक्रमीय बदलावहो सकते हैं।

लिपोफिलिक फ्लोरोसेंट जांच 1,3,5,7,8-पेंटामिथाइल-4-बोरा-3 ए, 4डियाज़ा-एस-इंडेसीन (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 480 एनएम; उत्सर्जन अधिकतम: 515 एनएम; बीओडीआईपीवाई 493/503) हाइड्रोफोबिसिटी विशेषताओं को प्रदर्शित करता है जो इंट्रासेल्युलर एलडी द्वारा इसके तेजी से उत्थान की अनुमति देता है, लिपिड ड्रॉपलेट कोर में जमा होता है, और बाद में, उज्ज्वल हरे रंग की प्रतिदीप्ति12 का उत्सर्जन करता है। नील रेड के विपरीत, बीओडीआईपीवाई 493/503 पर्यावरण ध्रुवीयता के प्रति असंवेदनशील है और इसे अधिक चयनात्मक दिखाया गया है, क्योंकि यह एलडी इमेजिंग के लिए उच्च चमक प्रदर्शित करता है। तटस्थ एलडी को दागने के लिए, इस डाई का उपयोग जीवित या निश्चित कोशिकाओं में किया जा सकता है और सफलतापूर्वक अन्य धुंधला और / या लेबलिंग विधियोंके साथ युग्मित किया जा सकता है। डाई का एक और लाभ यह है कि इसे समाधान में रखने के लिए बहुत कम प्रयास की आवश्यकता होती है और यह स्थिर होता है, इस प्रकार प्रत्येक प्रयोगके लिए इसे ताजा तैयार करने की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। भले ही बीओडीआईपीवाई 493/503 जांच को सेल संस्कृतियों में एलडी के स्थानीयकरण और गतिशीलता की कल्पना करने के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है, कुछ रिपोर्टों ने मानव विशाल पार्श्विक मांसपेशी43, चूहे के तलवे की मांसपेशी42, और माउस आंत44 सहित ऊतकों में एलडी इमेजिंग उपकरण के रूप में इस डाई के विश्वसनीय उपयोग का भी प्रदर्शन किया है।

यहां, हम हेपेटिक स्टीटोसिस के पशु मॉडल से यकृत नमूनों में एलडी संख्या, क्षेत्र और व्यास के मूल्यांकन के लिए एक वैकल्पिक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण के रूप में एक अनुकूलित बीओडीआईपीवाई 493/503-आधारित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। इस प्रक्रिया में यकृत नमूना तैयारी, ऊतक अनुभागन, धुंधला स्थिति, छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण शामिल हैं।

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Protocol

इस अध्ययन में किए गए सभी पशु प्रक्रियाओं को कोइम्ब्रा इंस्टीट्यूट फॉर क्लिनिकल एंड बायोमेडिकल रिसर्च (आईसीबीआर) पशु कल्याण निकाय (ओआरबीईए, # 9/2018) द्वारा अनुमोदित किया गया था और पशु देखभाल राष्ट्रीय और यूरोपीय निर्देशों और आगमन दिशानिर्देशों का अनुपालन किया गया था।

1. प्रायोगिक डिजाइन

  1. तापमान (22 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस), आर्द्रता (50% -60%), और प्रकाश (12 घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र) की नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों में हवादार पिंजरों में 13 सप्ताह के नर विस्टार चूहों को रखा जाता है।
  2. अनुकूलन की 2 सप्ताह की अवधि के बाद, मनमाने ढंग से चूहों को दो समूहों में असाइन करें।
  3. नियंत्रण (CTRL, n = 6) और उच्च वसा वाले आहार समूहों (HFD, n = 6) को क्रमशः मानक चाउ और उच्च वसा वाले आहार (45% किलो कैलोरी / वसा) के साथ 24 सप्ताह के लिए खिलाएं।
  4. साप्ताहिक रूप से शरीर के वजन (बीडब्ल्यू) की निगरानी करें। प्रति पिंजरे में दैनिक भोजन और पेय की खपत रिकॉर्ड करें।

2. यकृत नमूना तैयारी

  1. यकृत विच्छेदन।
    1. पेरिस्टालिक पंप तैयार करें: टयूबिंग के माध्यम से 70% इथेनॉल चलाएं, टयूबिंग के आउटलेट छोर पर 27 ग्राम सुई कनेक्ट करें, और ट्यूबिंग को बर्फ-ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) 1 एक्स फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस, पीएच ~ 7.4) (उदाहरण के लिए, 1.6 मिमी आईडी सिलिकॉन टयूबिंग, आईवी मिनी ड्रिप सेट के साथ पेरिस्टालिक पंप पर 200 आरपीएम के साथ प्राइम करें)। शरीर के वजन के लिए समायोजित करें (उदाहरण के लिए, 100-150 ग्राम चूहे के लिए, लगभग 10-12 एमएल / मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करें)।
    2. एनेस्थीसिया प्रोटोकॉल का उपयोग करके इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा चूहे को एनेस्थेटाइज करें (केटामाइन की अंतिम एकाग्रता = 75 मिलीग्राम / किग्रा, और मेडेटोमिडीन की अंतिम एकाग्रता = 1 मिलीग्राम / किग्रा)।
      नोट: सुनिश्चित करें कि चूहे को पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया विधि का उपयोग करके पूरी तरह से एनेस्थेटाइज किया गया है।
    3. चूहे को विच्छेदन ट्रे पर रखें।
    4. फर को 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से साफ करें, और इसे पेपर टॉवल से सुखाएं।
    5. कैंची का उपयोग करके, त्वचा के माध्यम से "यू" के आकार का चीरा बनाएं, और डायाफ्राम के नीचे काट लें। फिर, दिल को उजागर करने के लिए किनारों पर रिब केज रोस्टरैली को काटें।
    6. जब 1x PBS चल रहा हो, तो सुई को बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से आरोही महाधमनी में पारित करें, और क्लैंप करें। फिर, छिड़काव शुरू होने के बाद जल निकासी की अनुमति देने के लिए दाहिने आलिंद को काट दिया जाता है।
      नोट: यकृत को ब्लैंच करना शुरू करना चाहिए क्योंकि रक्त को पीबीएस के साथ बदल दिया जाता है।
    7. कैंची और ड्यूमोंट फोर्सप्स का उपयोग करके, यकृत को सावधानी से हटा दें, और 1x पीबीएस से कुल्ला करें।
    8. जिगर को पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें, और इसे तौलें।
    9. एक स्केलपेल का उपयोग करके, एम्बेडिंग प्रक्रिया के लिए यकृत के बाएं लोब के पार्श्व पक्ष (किनारे से 1 सेमी) से 5 मिमी मोटाई के यकृत ऊतक के नमूने एकत्र करें।
      नोट शेष ऊतक को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. यकृत ऊतक एम्बेडिंग
    1. एक सूखी बर्फ कंटेनर तैयार करें, और नमूना आईडी और अभिविन्यास के साथ क्रायोमोल्ड्स को ठीक से लेबल करें।
    2. इष्टतम काटने का तापमान (ओसीटी) बनाने के लिए क्रायोमोल्ड के केंद्र पर क्रायो एम्बेडिंग मैट्रिक्स की कुछ बूंदें रखें।
    3. सुनिश्चित करें कि ऊतक का नमूना एक अनुप्रस्थ खंड के लिए ठीक से उन्मुख है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि क्रायोमोल्ड के निचले हिस्से को छूने वाला पक्ष वह पक्ष है जिसे पहले वर्गीकृत किया जाएगा।
    4. क्रायोमोल्ड पर अधिक ओसीटी को ध्यान से गिराएं जब तक कि यह पूरी तरह से कवर न हो जाए। हवा के बुलबुले के गठन से बचने की कोशिश करें। यदि आवश्यक हो, तो सादे बल के साथ, ओसीटी के अंदर किसी भी बुलबुले को हटा दें।
    5. ओसीटी से ढके नमूने के साथ क्रायोमोल्ड को तेजी से सूखे बर्फ के कंटेनर में रखें।
      नोट: ऊतकों को 3 साल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. जमे हुए ऊतक सेक्शनिंग

  1. क्रायोस्टेट तापमान (कक्ष: -21 डिग्री सेल्सियस; नमूना: -18 डिग्री सेल्सियस) समायोजित करें, और एक नया बाँझ ब्लेड डालें।
  2. तापमान को बराबर करने की अनुमति देने से पहले नमूने को क्रायोस्टेट में 30 मिनट के लिए रखें।
  3. नमूना आसंजन की अनुमति देने के लिए नमूना डिस्क पर ओसीटी की एक एकल परत बनाएं। ओसीटी को फ्रीज करने दें, और वांछित अभिविन्यास में ऊतक के नमूने को माउंट करें।
    नोट: काटने की सतह ब्लेड के समानांतर होनी चाहिए। अच्छे आसंजन को बनाए रखने के लिए, नमूने के शीर्ष पर हीट एक्सट्रैक्टर रखें। पिछले चरणों को सूखी बर्फ के साथ सूखे बर्फ के कंटेनर में भी किया जा सकता है।
  4. नमूना सिर में नमूना रखें, और ऊतक की सतह (कुछ 30 μm ऊतक नमूना खंड) को ट्रिम करें।
  5. एक बार जब रुचि का क्षेत्र सेक्शनिंग के लिए सुलभ हो जाता है, तो 12 μm मोटे खंडों को काट लें, और उन्हें कमरे के तापमान (RT) पर रखे लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें।
    नोट: अनुभाग को इकट्ठा करने के लिए, धीरे-धीरे स्लाइड को ऊतक अनुभाग की ओर ले जाएं। प्रत्येक स्लाइड दो यकृत वर्गों को एकत्र कर सकती है।
  6. आरटी पर स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए सूखने दें।
    नोट: स्लाइड को 6-12 महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या 3 साल तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. बीओडीआईपीवाई धुंधला

  1. 30 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइड स्टेनिंग सिस्टम में स्लाइड को पिघलाएं।
  2. 1x PBS (प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x) से धोएं।
  3. एक बैरियर पेन का उपयोग करके हाइड्रोफोबिक परत के साथ अनुभाग को घेरें।
  4. 500 μg /mL BODIPY 493/503 स्टॉक समाधान तैयार करें: 1 मिलीग्राम BODIPY 493/503 को 2 मिलीलीटर विलायक (90% DMSO; 10% 1x PBS) में घोलें। प्रकाश से बचाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे (9.5-10 डब्ल्यू) के लिए अल्ट्रासोनिक स्नान में सोनिकेट करें।
    नोट: समाधान को कम से कम 30 दिनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. 2 μL BODIPY 493/503 स्टॉक समाधान और 0.1 μL DAPI स्टॉक समाधान (5 mg/mL) को 1x PBS के 997.9 μL में जोड़कर BODIPY धुंधला समाधान (1 μg/mL) तैयार करें।
  6. 40 मिनट के लिए RT पर BODIPY 493/503 (1 μg/mL) और DAPI (0.1 μg/mL) के साथ स्लाइड्स (75 μL/स्लाइड) इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस कदम से स्लाइड ्स को अंधेरे में रखें।
  7. स्लाइड्स को 1x PBS (प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x) से धोएं।
  8. फ्लोरेसेंस माउंटिंग माध्यम का उपयोग करके कवरलिप्स के साथ स्लाइड ्स को माउंट करें, उन्हें 30 मिनट तक सूखने दें, और उन्हें नेल पॉलिश से सील करें।
    नोट: स्लाइड ्स को इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. लिपिड परिमाणीकरण

  1. एक स्वचालित, मान्य विधि और उपकरण का उपयोग करके सीरम कुल कोलेस्ट्रॉल और टीजी स्तर को मापें।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ट्राइग्लिसराइड्स कलरिमेट्रिक परख किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके यकृत टीजी के स्तर को मापें।

6. छवि अधिग्रहण

  1. स्लाइड को लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप स्लाइड होल्डर पर रखें।
  2. छवि विज़ुअलाइज़ेशन और अधिग्रहण के लिए, 20x उद्देश्य लेंस (प्लान-एपोक्रोमैट: 20x / 0.8) के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  3. BODIPY 493/503 और DAPI के बीच क्रॉस-टॉक से बचने के लिए, कॉन्फोकल सॉफ़्टवेयर पर अनुक्रमिक (सर्वश्रेष्ठ सिग्नल) स्कैन मोड का उपयोग करें।
  4. 488 एनएम आर्गन लेजर लाइन और 405 एनएम लेजर लाइन का उपयोग करके डीएपीआई का उपयोग करके बीओडीआईपीवाई 593/503 को उत्तेजित करें। BODIPY 493/503 के लिए 493-589 nm और DAPI के लिए 410-464 nm पर उत्सर्जन सीमा सेट करें।
  5. निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: पिनहोल: 1 AU, रिज़ॉल्यूशन: 1,024 पिक्सेल x 1,024 पिक्सेल, बिट गहराई: 12, पिक्सेल आकार: 0.415 μm, द्विदिश मोड, स्कैन गति: 7 (~ 1.58 μs/पिक्सेल 20x उद्देश्य के लिए), लाइन औसत: 2x, और डिजिटल ज़ूम: 1.
    नोट: उपर्युक्त स्कैनिंग पैरामीटर प्रत्येक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और उपयोग किए गए उद्देश्य के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  6. लाभ और डिजिटल लाभ को उचित रूप से सेट करें ताकि रेंज इंडिकेटर पर कोई संतृप्त पिक्सेल का पता न चले।
    नोट: ऑफसेट समायोजित करके पृष्ठभूमि संकेत को सही करें।
  7. एक बार जब एलडी की सही पहचान हो जाती है, तो बीओडीआईपीवाई और डीएपीआई चैनलों के साथ छवि प्राप्त करें।
    नोट: सभी चित्रों को प्रत्येक रंग चैनल के लिए समान स्थितियों (एक्सपोज़र और सामान्य सेटिंग्स) में प्राप्त किया जाना चाहिए।
  8. वाइड-एरिया छवियां (चित्रा 2) बनाने के लिए, उद्देश्य को 10x उद्देश्य लेंस (प्लान-नियोफ्लुअर: 10x/0.3) में बदलें।
  9. टाइल स्कैन मोड का चयन करें, और 5 प्रति 5 छवियों के मोज़ेक बनाएं।
    नोट: इस काम में, विश्लेषण के लिए टाइलों को उचित रूप से विलय करने के लिए प्रत्येक टाइल में 10% का ओवरलैप था।
  10. 3 डी और ऑर्थोगोनल दृश्य (चित्रा 3 ए) बनाने के लिए, कवर ग्लास के शीर्ष पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें, और उद्देश्य को 40x उद्देश्य लेंस (प्लान-नियोफ्लुअर: 40x / 1.30 तेल) में बदलें।
  11. जेड-स्टैक मोड का चयन करें, और जेड प्लेन को समायोजित करके, एक इष्टतम मोटाई (~ 0.5 μm) पर ऑप्टिकल स्लाइस के साथ अधिग्रहण के लिए पहली और अंतिम स्थिति को परिभाषित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सभी बूंदों को कैप्चर किया गया है।
    नोट: छवि अधिग्रहण को गति देने और ब्लीचिंग से बचने के लिए, ऑप्टिकल स्लाइस को एक उप-मानक आकार में समायोजित किया जा सकता है, जिससे एक अच्छे 3 डी पुनर्निर्माण के लिए कम से कम 30% ओवरसैंपलिंग सुनिश्चित होती है।
  12. ऑर्थो मॉड्यूल का चयन करें, और ऑर्थोगोनल दृश्य बनाएं।
  13. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के साथ पारदर्शिता प्रतिपादन मोड के बाद 3 डी मॉड्यूल का चयन करके 3 डी छवियां प्राप्त करें।

7. छवियों का विश्लेषण

  1. सेलप्रोफाइलर (संस्करण 4.2.5) के साथ एकल-विमान छवियों (20x आवर्धन) की प्रक्रिया और विश्लेषण करें।
    नोट: इस काम में उपयोग की जाने वाली पाइपलाइन को एडोमसिक एट अल से अनुकूलित किया गया था।45.
  2. सेलप्रोफाइलर विंडो के ऊपरी-बाएं कोने में चित्र मॉड्यूल पर क्लिक करें, और छवियों को .tiff फ़ाइलों के रूप में अपलोड करें।
  3. फ़ाइल नामों के आधार पर BODIPY- (ड्रॉपलेट) और DAPI- (नाभिक) दाग वाली छवियों के बीच सॉर्ट करने के लिए Names AndTypes मॉड्यूल का उपयोग करें। एलडी विश्लेषण केवल BODIPY-दाग वाली छवियों के साथ करें।
  4. पाइपलाइन निर्माण शुरू करने के लिए, मॉड्यूल समायोजित करें पर क्लिक करें, और छवियों को ग्रेस्केल छवियों में बदलने के लिए मॉड्यूल कलरटूग्रे का चयन करें।
    नोट: वस्तुओं की पहचान करने के लिए, ग्रेस्केल छवियों की आवश्यकता होती है।
  5. ग्रेस्केल छवि का उपयोग करके पहचानप्राथमिक ऑब्जेक्ट्स मॉड्यूल को नियोजित करके बूंदों की पहचान करें।
    नोट: इस मॉड्यूल में पैरामीटर अच्छी एलडी पहचान को पूरा करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इस काम में, 6 पिक्सेल और 300 पिक्सेल के बीच के आकार और 1.0 के थ्रेशोल्ड सुधार कारक के साथ एलडी को परिभाषित करने से सबसे सटीक पहचान हुई।
  6. पहचाने गए लिपिड बूंदों की पिक्सेल तीव्रता को मापने के लिए, एक मापऑब्जेक्टइंटेंसिटी मॉड्यूल जोड़ें।
  7. यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त फ़िल्टरऑब्जेक्ट्स मॉड्यूल जोड़ें कि केवल सबसे मजबूत संकेतों की मात्रा निर्धारित की जाती है, जबकि कम तीव्र संकेतों को अंतिम लिपिड बूंद विश्लेषण (न्यूनतम तीव्रता: 0.15; अधिकतम तीव्रता: 1 मनमानी इकाई) से बाहर रखा जाता है।
  8. आउटपुट डेटा से संबंधित LDs को मापने के लिए, MeasureObjectSizeShape मॉड्यूल जोड़ें।
  9. मूल छवि पर पहचाने गए बूंद को ओवरले करने के लिए इस बिंदु पर एक ओवरलेआउटलाइनमॉड्यूल जोड़ें और इस प्रकार, यह सुनिश्चित करें कि विभाजन असंसाधित छवि पर भी सटीक दिखता है।
    नोट: यह एक वैकल्पिक (गुणवत्ता नियंत्रण) चरण है।
  10. अंत में एक ExportToTस्प्रेडशीट मॉड्यूल जोड़ें, और नीचे-बाएं कोने पर छवियों का विश्लेषण करें बटन पर क्लिक करें।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. परिणामों को किसी भी सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन का उपयोग करके माध्य (एसईएम) की औसत ± मानक त्रुटि के रूप में व्यक्त करें।
    नोट: इस अध्ययन में, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ग्राफपैड सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था।
  2. सामान्यता से महत्वपूर्ण विचलन का आकलन करने के लिए कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव परीक्षण का उपयोग करके मूल्यों के वितरण का विश्लेषण करें। छात्र के अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग करके पैरामीट्रिक डेटा का विश्लेषण करें।
    नोट: पी < 0.05 के मूल्यों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

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Representative Results

इस तकनीक के सफल निष्पादन के परिणामस्वरूप एलडी आकृति विज्ञान (3 डी पुनर्निर्माण के आधार पर आकार और लिपिड कोर घनत्व) के एक साथ लक्षण वर्णन के लिए स्पष्ट लिपिड बूंद धुंधला होना चाहिए, साथ ही उनके स्थानिक वितरण, कुल क्षेत्रफल की संख्या और औसत आकार (ऊपर वर्णित पाइपलाइन के साथ मूल्यांकन किया गया है, चित्रा 1)।

Figure 1
चित्र 1: सेलप्रोफाइलर का उपयोग कर नमूना छवि प्रसंस्करण । (ए) सीटीएल समूह में बीओडीआईपीवाई 493/503 (हरे) और डीएपीआई (नीले) से सना हुआ नाभिक के साथ सना हुआ एलडी की मूल छवि। (बी) सीटीएल समूह के विभेदित एलडी (मैजेंटा) को ओवरलेआउटलाइन्स मॉड्यूल का उपयोग करके ओवरलेआउटलाइन ्स मॉड्यूल का उपयोग करके ओवरलेग्राफ किया गया था। (सी) एचएफडी समूह में बीओडीआईपीवाई 493/503 (हरे) और डीएपीआई (नीले) से सना हुआ नाभिक के साथ सना हुआ एलडी की मूल छवि। (घ) एचएफडी समूह के विभेदित एलडी (मैजेंटा) को ओवरलेआउटलाइन्स मॉड्यूल का उपयोग करके तैयार किया गया था। लेजर पॉइंट स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को 20x आवर्धन पर लिया गया था। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षेप: सीटीएल = नियंत्रण समूह; एचएफडी = उच्च वसा वाले आहार समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सीरम टीजी, कुल कोलेस्ट्रॉल, एलडीएल-सी, एचडीएल-सी, साथ ही यकृत टीजी सामग्री का मूल्यांकन किया गया (तालिका 1)। एचएफडी-पोषित जानवरों ने एक स्पष्ट डिस्लिपिडेमिक प्रोफाइल प्रस्तुत किया, जिसमें यकृत टीजी (सीटीएल, पी < 0.001 की तुलना में 345%) के संचय की विशेषता है , साथ ही परिसंचारी टीजी स्तरों में सूक्ष्म वृद्धि (सीटीएल, पी > 0.05 की तुलना में 129%)।

प्राचल सीटीएल HFD
सीरम
कुल कोलेस्ट्रॉल (mg/dL) 56.67 ± 9.35 80.40 ± 7.45
LDL (mg/dL) 7.66 ± 0.84 7.40 ± 1.03
HDL (mg/dL) 17.83 ± 2.93 28.40 ± 2.40 *
ट्राइग्लिसराइड्स (मिलीग्राम / 154.8 ± 40.17 201.2 ± 38.12
यकृत
ट्राइग्लिसराइड्स (मिलीग्राम / 15.29 ± 1.31 52.83 ± 6.73 ***

तालिका 1: सीरम टीजी, कुल कोलेस्ट्रॉल, एलडीएल-सी, एचडीएल-सी, और यकृत टीजी सामग्री। डेटा को एसईएम (एन = 5-6 प्रति समूह) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। पी < 0.001 बनाम सीटीएल। सांख्यिकीय विश्लेषण एक छात्र के अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप: सीटीएल = नियंत्रण समूह; एचएफडी = उच्च वसा वाले आहार समूह।

चित्र 2 यकृत वर्गों के प्रतिनिधि वाइड-एरिया छवियों (10x उद्देश्य के साथ टाइल स्कैन) दिखाता है जिसमें LD BODIPY 493/503 (हरे) से सना होता है और नाभिक DAPI (नीले) से सना होता है। विभिन्न आकारों के अलग-अलग एलडी को बीओडीआईपीवाई 493/503 धुंधला होने के साथ सफलतापूर्वक देखा गया, जिसने एचएफडी-पोषित जानवरों में एक व्यापक वितरण पैटर्न दिखाया।

Figure 2
चित्रा 2: यकृत ऊतक में एलडी संचय की प्रतिनिधि छवियां। बीओडीआईपीवाई 493/503 (हरे) से सना हुआ एलडी, और डीएपीआई (नीला) से सना नाभिक। लेजर पॉइंट स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को 10x आवर्धन पर लिया गया था। स्केल बार = 200 μm। संक्षेप: सीटीएल = नियंत्रण समूह; एचएफडी = उच्च वसा वाले आहार समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3A हेपेटिक LDs के 40x उद्देश्य के साथ 20x उद्देश्य और 3D छवियों के साथ प्रतिनिधि ऑर्थोगोनल अनुमानों को दर्शाता है। एकल-विमान छवियों को सेलप्रोफाइलर (संस्करण 4.2.5) द्वारा संसाधित और विश्लेषण किया गया था ताकि एलसी की प्रतिदीप्ति तीव्रता, संख्या, क्षेत्र और व्यास का आकलन किया जा सके (चित्रा 3B-E)। यह पुष्टि करना संभव था कि एचएफडी-पोषित जानवरों ने यकृत एलडी (151% बनाम सीटीएल, चित्रा 3 बी) की बढ़ी हुई संख्या प्रदर्शित की, और यह संवर्धित बीओडीआईपीवाई 493/503 प्रतिदीप्ति तीव्रता (182% बनाम सीटीएल, पी < 0.001, चित्रा 3 सी) द्वारा पुष्टि की गई थी। इसके अलावा, एलडी का क्षेत्र अनुपात लगभग तीन गुना हो गया (360% बनाम सीटीएल, पी < 0.0001, चित्रा 3 डी) क्योंकि उन्होंने एचएफडी-पोषित जानवरों में बड़े व्यास (182% बनाम सीटीएल, चित्रा 3 ई) प्रस्तुत किए। आकार वितरण का आकलन करने के लिए, एलडी को व्यास श्रेणियों के अनुसार तीन समूहों में वर्गीकृत किया गया था: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm, और d > 9 μm (चित्रा 3F)। एचएफडी खिलाए गए जानवरों ने सुपरसाइज़्ड, मैक्रोवेसिकुलर हेपेटिक एलडी (डी > 9 μm, p < 0.0001) की संख्या में 20% से अधिक की वृद्धि दिखाई, साथ ही व्यास में 3 μm (1 μm < d ≤ 3 μm, p < 0.0001) से छोटे माइक्रोवेसिकल्स की संख्या में लगभग तीन गुना कमी आई।

Figure 3
चित्रा 3: एलडी और डेटा विश्लेषण के ऑर्थोगोनल / 3 डी दृश्य। (ए) प्रतिनिधि ऑर्थोगोनल अनुमानों और 3 डी ने सामान्य या एचएफडी आहार खिलाए गए चूहों के यकृत में यकृत लिपिड बूंदों (हरे, बीओडीआईपीवाई 493/503) और नाभिक (नीले, डीएपीआई) की छवियों को प्रस्तुत किया। लेजर पॉइंट स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 20x (बाएं) और 40x (दाएं) आवर्धन पर चित्र लिए गए थे। स्केल बार = 20 μm. (B) हेपेटिक LDs की संख्या. (C) हेपेटिक LDs की प्रतिदीप्ति तीव्रता. (D) हेपेटिक LDs का क्षेत्रफल अनुपात. (E) लिपिड बूंद व्यास. (एफ) विभिन्न व्यास के साथ यकृत लिपिड बूंदों के समूहों के आंशिक अनुपात: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm, और d > 9 μm। डेटा को एसईएम ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। एन = 5-6 चूहे / समूह; * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, **** पी < 0.0001। सांख्यिकीय विश्लेषण एक छात्र के अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। संक्षेप: सीटीएल = नियंत्रण समूह; एचएफडी = उच्च वसा वाले आहार समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एलडी मूल्यांकन के लिए इस बीओडीआईपीवाई 493/503 प्रतिदीप्ति-आधारित प्रोटोकॉल का उद्देश्य यकृत स्टीटोसिस के मूल्यांकन के लिए एक नया इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित करना है। मोटापे और फैटी यकृत रोग के बीच मजबूत सहसंबंध को देखते हुए, पश्चिमी शैली के उच्च वसा वाले आहार का उपयोग हेपेटिक स्टीटोसिस26 के पशु मॉडल को स्थापित करने के लिए किया गया था। हेपेटिक टीजी सामग्री में एक मजबूत वृद्धि की पुष्टि एक मात्रात्मक ट्राइग्लिसराइड्स कलरिमेट्रिक परख किट द्वारा की गई थी, जिसने एचएफडी-खिलाए गए जानवरों में एक बढ़े हुए यकृत लिपिडोसिस परिदृश्य का सुझाव दिया था। इसके बाद, कम आवर्धन के तहत फ्लोरोसेंट प्रोब बीओडीआईपीवाई 493/503 द्वारा एलडी संचय की डिग्री की कल्पना की गई थी। जैसा कि अपेक्षित था, बीओडीआईपीवाई 493/503 धुंधला ने एचएफडी समूह में यकृत ऊतक में वेसिकुलर संरचनाओं के व्यापक वितरण का खुलासा किया। ऑर्थोगोनल अनुमानों और 3 डी पुनर्निर्माण का सहारा लेते हुए, यह देखना संभव था कि एलडी कोर ने तटस्थ लिपिड की एक पूर्ण सामग्री प्रस्तुत की, जो लगभग गोलाकार बूंदों के रूप में दिखाई दी। इसके अलावा, कुल क्षेत्र में एलडी क्षेत्र में मजबूत वृद्धि स्पष्ट रूप से स्पष्ट थी (360% बनाम सीटीएल समूह), और यह क्षेत्र एचएफडी समूह में उनके मात्रात्मक स्कोर (52.83 मिलीग्राम / ग्राम ± 6.73 मिलीग्राम / जी; 346% बनाम सीटीएल समूह) को देखते हुए तटस्थ टीजी से भरा था। एचएफडी फीडिंग पर एलडी गतिशीलता को और चिह्नित करने के लिए, हेपेटिक स्टीटोसिस की सूक्ष्म या मैक्रोवेसिकुलर प्रकृति का विश्लेषण किया गया था। साहित्य 4,46,47 में पहले वर्णित एलडी व्यास श्रेणियों का उपयोग करते हुए, माइक्रोवेसिकुलर एलडी गिनती (1 μm < d ≤ 3 μm) में एक महत्वपूर्ण गिरावट को भेदभाव करना संभव था, जिसने LD मैक्रोवेसिकल्स (d > 9 μm) में आनुपातिक वृद्धि को समानांतर किया। कई अध्ययनों ने बताया है कि हेपेटोसाइट्स में एलडी सुपरसाइज्ड एलडी (व्यास में दसियों माइक्रोन तक) 4,46,47 बना सकते हैं, जो वर्तमान परिणामों के अनुरूप है।

हाल के वर्षों में, शास्त्रीय लिपिड रंगों को धीरे-धीरे फ्लोरोसेंट लिपोफिलिक जांच की एक नई सरणी के साथ प्रतिस्थापित किया गया है, जैसे कि बीओडीआईपीवाई, उनकी तटस्थ और प्लानर संरचना को एक डिफ्लोरोबोरोन कॉम्प्लेक्स48 द्वारा स्थिर किया गया है; इन जांचों को जीवित कोशिकाओं और कुछ निश्चित ऊतकोंमें उनकी आकृति विज्ञान, गतिशीलता और अन्य जीवों के साथ बातचीत का अध्ययन करने के लिए एलडी को टैग करने में बहुत प्रभावी दिखाया गया है। हेपेटिक स्टीटोसिस मूल्यांकन के लिए यहां प्रस्तुत फ्लोरोसेंट-दाग वाले लिपिड ड्रॉपलेट्स प्रोटोकॉल के भीतर, तकनीक की सफलता के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जो ज्यादातर ऊतक तैयारी और छवि अधिग्रहण पर निर्भर करते हैं। चूंकि बीओडीआईपीवाई सिग्नल को यूवी लाइट51 द्वारा ब्लीच किया जा सकता है, इसलिए एलडी इमेजिंग अधिग्रहण अन्य फ्लोरोसेंट रंगों की इमेजिंग से पहले होना चाहिए जो यूवी प्रकाश से उत्तेजित होते हैं, जैसे कि आमतौर पर ज्ञात डीएनए फ्लोरोसेंट रंजक। इसके अलावा, इमेजिंग से पहले बीओडीआईपीवाई फ्लोरेसेंस शमन को रोकने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड को प्रकाश जोखिम से बचाने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। भले ही एलडी का 3 डी पुनर्निर्माण उनकी आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी है, यह बेहद समय लेने वाला है, क्योंकि 3 डी-पुनर्निर्मित छवियां कई स्वतंत्र 2 डी छवियों से बनी हैं। इसलिए, शोधकर्ताओं को इस कदम से बचने पर विचार करना चाहिए जब प्रयोग का प्राथमिक लक्ष्य केवल सूक्ष्म और मैक्रोवेसिकुलर हेपेटिक स्टीटोसिस का आकलन है। पूर्वाग्रह से बचने के लिए, उपचार समूह में अंधे दो स्वतंत्र पर्यवेक्षकों को डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण करना चाहिए। अर्ध-स्वचालित छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (सेल प्रोफाइलर पाइपलाइन) आगे अर्ध-अंधा परिमाणीकरण में योगदान देता है और मैन्युअल विश्लेषण में लगातार देखे गए बढ़े हुए प्रसंस्करण समय को दूर करता है।

इस तकनीक को अन्य ऊतकों और प्रजातियों के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होने के साथ संयोजन में व्यापक अनुप्रयोगों तक बढ़ाया जा सकता है, जब तक कि सिग्नल / पृष्ठभूमि अनुपात को अधिकतम करने के लिए इष्टतम बीओडीआईपीवाई सांद्रता और छवि अधिग्रहण सेटिंग्स निर्धारित की गई हैं। इस तरह की प्रयोगात्मक सेटिंग्स अन्य एंटीजन का एक साथ पता लगाने की अनुमति दे सकती हैं, बशर्ते कि उपयोग किया जाने वाला दूसरा फ्लोरोफोर बीओडीआईपीवाई उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ ओवरलैप न हो।

कुल मिलाकर, यहां प्रस्तुत अनुकूलित बीओडीआईपीवाई 493/503 प्रतिदीप्ति-आधारित प्रोटोकॉल एलडी लक्षण वर्णन के लिए एक विश्वसनीय और सरल उपकरण है और अक्सर हेपेटिक स्टीटोसिस की पुष्टि और ग्रेड करने के लिए नियोजित शास्त्रीय हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल के लिए एक पूरक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को पुर्तगाली विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन (एफसीटी), यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (फेडर), और प्रोग्राम ा ओपेराशनल फैक्टर्स डी कॉम्पेटिविडे (कॉम्पिटिविडे) के माध्यम से राष्ट्रीय और यूरोपीय फंडों द्वारा वित्त पोषित किया गया था: 2020.09481.BD, यूआईडीपी / 04539/2020 (सीआईबीबी), और पीओसीआई-01-0145-फेडर-007440। लेखक iLAB - माइक्रोस्कोपी और बायोइमेजिंग लैब के समर्थन को धन्यवाद देना चाहते हैं, जो कोइम्ब्रा विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय की एक सुविधा है और बायोइमेजिंग के राष्ट्रीय बुनियादी ढांचे PPBI-पुर्तगाली प्लेटफ़ॉर्म (POCI-01-0145-FEDER-022122) के सदस्य हैं, साथ ही FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142 से समर्थन भी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) Sigma-Aldrich, Lyon, France D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR D1306
70% ethanol Honeywell 10191455
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717 Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany 8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) Daido Sangyo Co., Ltd, Japon _
Blade Leica 221052145 Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5 https://cellprofiler.org/releases/ Used to analyse the acquired images
Coverslips Menzel-Glaser, Germany _
Cryomolds Tissue-Tek _
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S Leica Biosystems _
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich, Lyon, France D-8418 Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic
and flammable. Vapors may cause
irritation. Manipulate in a fume
hood. Avoid direct contact with skin.
Wear rubber gloves, protective eye
goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler) Novolab A26742
Dumont forceps Fine Science Tools, Germany 11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø
150 mm)		 Thermo Scientific 150318 Used to weigh the liver after dissection
Glycergel DAKO Omnis S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet Envigo, Barcelona, Spain MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL) Dechra 791/01/14DFVPT Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; ) Carl Zeiss, germany LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) Dechra 1838 ESP / 020/01/07RFVPT Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle BD microlance 300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel
Blade		 Swann-Morton 205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)  Carl Zeiss, Germany
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3) Gilson 1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) Sigma-Aldrich, Lyon, France P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 Swann-Morton 0208
Slide staining system StainTray Simport Scientific M920
Standard diet  Mucedola 4RF21
Superfrost Plus microscope slides Menzel-Glaser, Germany J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media VWR CHEMICALS 361603E
Triglycerides colorimetric assay kit Cayman Chemical 10010303
Ultrasonic bath Bandelin Sonorex  TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm
cutting edge		 Fine Science Tools, Germany 15000-00
ZEN Black software Zeiss

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Garcia, K., Alves, A., Ribeiro-Rodrigues, T. M., Reis, F., Viana, S. Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment. J. Vis. Exp. (196), e65206, doi:10.3791/65206 (2023).

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