Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Analyse af fluorescerende farvede lipiddråber med 3D-rekonstruktion til vurdering af hepatisk steatose

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65206
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4
1Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 3Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 4Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

Summary

Heri demonstrerer vi en optimeret BODIPY 493/503 fluorescensbaseret protokol til lipiddråbekarakterisering i levervæv. Gennem brug af ortogonale projektioner og 3D-rekonstruktioner muliggør fluoroforen en vellykket skelnen mellem mikrovesikulær og makrovesikulær steatose og kan repræsentere en komplementær tilgang til de klassiske histologiske protokoller til vurdering af hepatisk steatose.

Abstract

Lipiddråber (LD'er) er specialiserede organeller, der formidler lipidopbevaring og spiller en meget vigtig rolle i undertrykkelse af lipotoksicitet og forebyggelse af dysfunktion forårsaget af frie fedtsyrer (FA'er). Leveren, givet sin kritiske rolle i kroppens fedtstofskifte, er vedvarende truet af den intracellulære akkumulering af LD'er i form af både mikrovesikulær og makrovesikulær hepatisk steatose. Den histologiske karakterisering af LD'er er typisk baseret på lipidopløselige diazofarvestoffer, såsom Oil Red O (ORO) farvning, men en række ulemper hæmmer konsekvent brugen af denne analyse med leverprøver. For nylig er lipofile fluoroforer 493/503 blevet populære til visualisering og lokalisering af LD'er på grund af deres hurtige optagelse og ophobning i den neutrale lipiddråbekerne. Selvom de fleste anvendelser er velbeskrevne i cellekulturer, er der mindre beviser, der viser pålidelig anvendelse af lipofile fluoroforprober som et LD-billeddannelsesværktøj i vævsprøver. Heri foreslår vi en optimeret bordipyrromethen (BODIPY) 493/503-baseret protokol til evaluering af LD'er i leverprøver fra en dyremodel af fedtfattig diæt (HFD)-induceret hepatisk steatose. Denne protokol dækker forberedelse af leverprøver, vævssektionering, BODIPY 493/503-farvning, billedoptagelse og dataanalyse. Vi demonstrerer et øget antal, intensitet, arealforhold og diameter af hepatiske LD'er ved HFD-fodring. Ved hjælp af ortogonale projektioner og 3D-rekonstruktioner var det muligt at observere det fulde indhold af neutrale lipider i LD-kernen, der fremstod som næsten sfæriske dråber. Desuden var vi med fluoroforen BODIPY 493/503 i stand til at skelne mikrovesikler (1 μm < d ≤ 3 μm), mellemliggende vesikler (3 μm < d ≤ 9 μm) og makrovesikler (d > 9 μm), hvilket muliggjorde en vellykket diskrimination af mikrovesikulær og makrovesikulær steatose. Samlet set er denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserede protokol et pålideligt og simpelt værktøj til hepatisk LD-karakterisering og kan repræsentere en komplementær tilgang til de klassiske histologiske protokoller.

Introduction

Lipiddråber (LD'er), der klassisk betragtes som energidepoter, er specialiserede cellulære organeller, der formidler lipidlagring, og de omfatter en hydrofob neutral lipidkerne, som hovedsageligt indeholder kolesterolestere og triglycerider (TG'er), indkapslet af et phospholipidmonolag 1,2,3.

LD-biogenese forekommer i det endoplasmatiske retikulum (ER), begyndende med syntesen af triacylglycerol (TAG) og sterolestere. Neutrale lipider diffunderes mellem folderne i ER-dobbeltlaget ved lave koncentrationer, men samles i olielinser, der vokser og knopper i næsten sfæriske dråber fra ER-membranen, når deres intracellulære koncentration stiger4. Derefter translokerer proteiner fra ER-dobbeltlaget og cytosolen, især perilipin (PLIN) proteinfamilien, til overfladerne af LD'erne for at lette spirende 5,6,7,8,9.

Gennem ny fedtsyresyntese og LD-fusion eller sammensmeltning vokser LD'er i forskellige størrelser. Derfor varierer størrelsen og antallet af LD'er betydeligt på tværs af forskellige celletyper. Små dråber (300-800 nm diameter), der er kendt som indledende LD'er (iLD'er), kan dannes af næsten alle celler4. Senere i LD-dannelsen er de fleste celler i stand til at konvertere nogle iLD'er til større dem-ekspanderende LD'er (eLD'er >1 μm i diameter). Alligevel har kun specifikke celletyper, såsom adipocytter og hepatocytter, kapacitet til at danne gigantiske eller overdimensionerede LD'er (op til snesevis af mikrometer i diameter)4,10.

LD'er spiller en meget vigtig rolle i reguleringen af cellulær lipidmetabolisme, undertrykker lipotoksicitet og forhindrer ER-stress, mitokondriel dysfunktion og i sidste ende celledød forårsaget af frie fedtsyrer (FA'er)11,12,13,14. Desuden har LD'er også været impliceret i reguleringen af genekspression, viral replikationsproteinbinding og membranhandel og signalering15,16,17. Derfor er fejlregulering af LD-biogenese et kendetegn ved kroniske sygdomme forbundet med metabolisk syndrom, fedme, type 2-diabetes mellitus (T2DM) og / eller arteriosklerose, for blot at nævne nogle få18,19,20.

Leveren, som et metabolisk knudepunkt, er for det meste ansvarlig for lipidmetabolisme ved opbevaring og behandling af lipider, og derfor trues den konstant af lipotoksicitet21. Hepatisk steatose (HS) er et fælles træk ved en række progressive leversygdomme og er karakteriseret ved overdreven intracellulær lipidakkumulering i form af cytosoliske LD'er, der i sidste ende kan føre til levermetabolisk dysfunktion, inflammation og avancerede former for ikke-alkoholisk fedtleversygdom22,23,24,25. HS opstår, når hastigheden af fedtsyreoxidation og eksport som triglycerider inden for lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL'er) er lavere end hastigheden af hepatisk fedtsyreoptagelse fra plasma- og de novo-fedtsyresyntesen 26. Den hepatiske akkumulering af lipider forekommer ofte i to former - mikrovesikulær og makrovesikulær steatose - og disse viser forskellige cytoarkitektoniske egenskaber27. Typisk er mikrovesikulær steatose karakteriseret ved tilstedeværelsen af små LD'er spredt gennem hepatocytten med kernen placeret centralt, mens makrovesikulær steatose er karakteriseret ved tilstedeværelsen af en enkelt stor LD, der optager størstedelen af hepatocytten og skubber kernen til periferien28,29. Især findes disse to typer steatose ofte sammen, og det er stadig uklart, hvordan disse to LD-mønstre påvirker sygdomspatogenese, da beviser stadig er inkonsekvente31,32,33,34. Alligevel anvendes en sådan type analyse ofte som en "referencestandard" i prækliniske og kliniske undersøgelser for at forstå LD's dynamiske opførsel og karakterisere hepatisk steatose 29,34,35,36.

Leverbiopsier, guldstandarden til diagnosticering og klassificering af HS, vurderes rutinemæssigt ved histologisk hæmatoxylin og eosin (H&E) analyse, hvor lipiddråber evalueres som ufarvede vakuoler i H&E-farvet lever afsnit37. Selvom det er acceptabelt til evaluering af makrovesikulær steatose, indsnævrer denne type farvning generelt vurderingen af mikrovesikulær steatose38. Lipidopløselige diazofarvestoffer, såsom Oil Red O (ORO), kombineres klassisk med brightfieldmikroskopi for at analysere intracellulære lipidlagre, men disse har stadig en række ulemper: (i) brugen af ethanol eller isopropanol i farvningsprocessen, hvilket ofte forårsager forstyrrelse af de indfødte LD'er og lejlighedsvis fusion på trods af, at cellerne er fikseret39; ii) den tidskrævende karakter, da ORO-opløsning kræver opløsning og filtrering af frisk pulver på grund af den begrænsede holdbarhed, hvilket bidrager til mindre ensartede resultater (iii) og det faktum, at ORO pletter mere end blot lipiddråber og ofte overvurderer hepatisk steatose38.

Derfor er cellegennemtrængelige lipofile fluoroforer, såsom Nile Red, blevet anvendt i enten levende eller faste prøver for at overvinde nogle af de ovennævnte begrænsninger. Imidlertid indsnævrer den ikke-specifikke karakter af cellulær lipidorganelmærkning gentagne gange LD-vurderinger40. Desuden varierer Nilens røde spektrale egenskaber alt efter miljøets polaritet, hvilket ofte kan føre til spektralforskydninger41.

Den lipofile fluorescerende sonde 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitationsbølgelængde: 480 nm; emissionsmaksimum: 515 nm; BODIPY 493/503) udviser hydrofobiske egenskaber, der tillader hurtig optagelse af intracellulære LD'er, akkumuleres i lipiddråbekernen og udsender derefter lysegrøn fluorescens12. I modsætning til Nile Red er BODIPY 493/503 ufølsom over for miljøets polaritet og har vist sig at være mere selektiv, da den viser høj lysstyrke for LD-billeddannelse. For at plette neutrale LD'er kan dette farvestof anvendes i levende eller faste celler og med succes kombineres med andre farvnings- og / eller mærkningsmetoder42. En anden fordel ved farvestoffet er, at det kræver lidt indsats at placere i en opløsning og er stabilt, hvilket eliminerer behovet for frisk at forberede det til hvert eksperiment42. Selvom BODIPY 493/503-sonden med succes er blevet anvendt til at visualisere lokalisering og dynamik af LD'er i cellekulturer, har nogle rapporter også vist den pålidelige anvendelse af dette farvestof som et LD-billeddannelsesværktøj i væv, herunder den humane vastus lateralis-muskel43, rottesoleus-muskelen42 og musetarmen44.

Heri foreslår vi en optimeret BODIPY 493/503-baseret protokol som en alternativ analytisk tilgang til evaluering af LD-antal, areal og diameter i leverprøver fra en dyremodel af hepatisk steatose. Denne procedure dækker forberedelse af leverprøver, vævssektionering, farvningsbetingelser, billedoptagelse og dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) og overholdt Animal Care National og European Directive og ARRIVE-retningslinjerne.

1. Eksperimentelt design

  1. Parvis 13 uger gamle Wistar-hanrotter i ventilerede bure under kontrollerede miljøforhold med temperatur (22 °C ± 1 °C), fugtighed (50%-60%) og lys (12 timers lys-mørk cyklus) og med ad libitum adgang til postevand og standard gnaverchow.
  2. Efter en 2 ugers periode med akklimatisering tildeler rotterne vilkårligt i to grupper.
  3. Foder kontrolgrupperne (CTRL, n = 6) og fedtfattige diætgrupper (HFD, n = 6) med henholdsvis standard chow og en fedtrig diæt (45% kcal / fedt) i 24 uger.
  4. Overvåg kropsvægten (BW) ugentligt. Registrer forbruget af mad og drikke dagligt pr. bur.

2. Forberedelse af leverprøver

  1. Lever dissektion
    1. Forbered den peristaltiske pumpe: Kør 70% ethanol gennem slangen, tilslut en 27 G nål til slangens udløbsende, og prim slangen med iskold (4 °C) 1x fosfatbufret saltvand (PBS, pH ~ 7,4) (f.eks. 200 o / min på en peristaltisk pumpe med 1,6 mm I.D. siliciumslange, IV mini drypsæt). Juster for kropsvægten (f.eks. for en rotte på 100-150 g skal du bruge en strømningshastighed på ca. 10-12 ml / min).
    2. Bedøv rotten ved en intraperitoneal injektion ved hjælp af en anæstesiprotokol (den endelige koncentration af ketamin = 75 mg / kg og den endelige koncentration af medetomidin = 1 mg / kg).
      BEMÆRK: Sørg for, at rotten er fuldstændig bedøvet ved hjælp af tåklemmeresponsmetoden.
    3. Placer rotten på dissektionsbakken.
    4. Desinficer pelsen grundigt med 70% ethanol, og tør den med et køkkenrulle.
    5. Brug en saks til at lave et "U" -formet snit gennem huden og skær åben under membranen. Skær derefter ribbenburet rostralt på kanterne for at udsætte hjertet.
    6. Mens 1x PBS kører, før nålen gennem venstre ventrikel ind i den stigende aorta og klemme. Derefter skæres det højre atrium for at tillade dræning, når perfusionen er begyndt.
      BEMÆRK: Leveren skal begynde at blanchere, da blod erstattes med PBS.
    7. Brug saks og Dumont-tang til at fjerne leveren forsigtigt og skylle med 1x PBS.
    8. Overfør leveren til en petriskål, og vej den.
    9. Brug en skalpel til at indsamle levervævsprøver på 5 mm i tykkelse fra sidesiden (1 cm fra kanten) af leverens venstre lap til indlejringsprocessen.
      BEMÆRK: Det resterende væv kan opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring.
  2. Indlejring af levervæv
    1. Forbered en tørisbeholder, og mærk kryomolder korrekt med prøve-id og retning.
    2. Placer et par dråber kryoindlejringsmatrix på midten af kryomolen for at opnå den optimale skæretemperatur (OCT).
    3. Sørg for, at vævsprøven er korrekt orienteret til et tværsnit.
      BEMÆRK: Sørg for, at den side, der rører bunden af cryomolden, er den side, der først skal sektioneres.
    4. Slip forsigtigt mere OCT på cryomolden, indtil den er helt dækket. Prøv at undgå dannelse af luftbobler. Fjern om nødvendigt eventuelle bobler inde i OLT med almindelig tang.
    5. Kryomolen anbringes hurtigt sammen med den OCT-dækkede prøve i en tørisbeholder.
      BEMÆRK: Vævene kan opbevares ved -80 °C i 3 år.

3. Sektionering af frosset væv

  1. Kryostattemperaturen justeres (kammer: -21 °C; prøve: -18 °C), og der indsættes et nyt sterilt blad.
  2. Anbring prøverne i kryostaten i 30 minutter, før temperaturen bringes i ligevægt.
  3. Der laves et enkelt lag OCT på prøveskiven for at tillade prøvevedhæftning. Lad OLT fryse, og monter vævsprøven i den ønskede retning.
    BEMÆRK: Skærefladen skal være parallel med klingen. For at opretholde god vedhæftning skal du placere varmeudsugningen oven på prøven. De foregående trin kan også udføres i en tørisbeholder med tøris.
  4. Prøven anbringes i prøvehovedet, og vævets overflade trimmes (nogle få vævsprøvesektioner på nogle få 30 μm).
  5. Når interesseområdet er tilgængeligt for sektionering, skal du skære 12 μm tykke sektioner og placere dem på mærkede mikroskopglas, der holdes ved stuetemperatur (RT).
    BEMÆRK: For at samle sektionen skal du langsomt flytte diaset mod vævssektionen. Hvert dias kan samle to leversektioner.
  6. Lad rutsjebanerne tørre i 10 minutter ved RT.
    BEMÆRK: Objektglassene kan opbevares ved -20 °C i 6-12 måneder eller ved -80 °C i op til 3 år.

4. BODIPY farvning

  1. Optø rutsjebanerne i et diasfarvningssystem på RT i 30 min.
  2. Vask med 1x PBS (3x i 5 min hver).
  3. Sæt en cirkel om sektionen med et hydrofob lag ved hjælp af en barrierepen.
  4. Forbered 500 μg/ml BODIPY 493/503 stamopløsning: Opløs 1 mg BODIPY 493/503 i 2 ml solvens (90% DMSO; 10% 1x PBS). Beskyt mod lys. Sonikere i et ultralydbad i 1 time (9,5-10 W) ved 37 °C.
    BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares ved -20 °C i mindst 30 dage.
  5. Forbered BODIPY-farvningsopløsningen (1 μg/ml) ved at tilsætte 2 μL BODIPY 493/503 stamopløsning og 0,1 μL DAPI-stamopløsning (5 mg/ml) til 997,9 μL 1x PBS.
  6. Inkuber objektglassene (75 μL/dias) med BODIPY 493/503 (1 μg/ml) og DAPI (0,1 μg/ml) ved RT i 40 min.
    BEMÆRK: Hold lysbillederne i mørke fra dette trin og fremefter.
  7. Vask diasene med 1x PBS (3x i 5 min hver).
  8. Monter gliderne med dæksler ved hjælp af et fluorescensmonteringsmedium, lad dem tørre i 30 min, og forsegl dem med neglelak.
    BEMÆRK: Objektglassene kan opbevares ved 4 °C indtil billeddannelse.

5. Lipid kvantificering

  1. Mål serum total cholesterol og TG niveauer ved hjælp af en automatisk, valideret metode og udstyr.
  2. Mål hepatiske TG-niveauer ved hjælp af et triglycerider kolorimetrisk assaysæt (materialetabel) i henhold til producentens protokol.

6. Optagelse af billeder

  1. Placer diaset på laserscanningens konfokale mikroskop-diasholder.
  2. Til billedvisualisering og erhvervelse skal du bruge et konfokalmikroskop med en 20x objektiv linse (plan-apochromat: 20x / 0,8).
  3. For at undgå krydstale mellem BODIPY 493/503 og DAPI, brug den sekventielle (bedste signal) scanningstilstand på den konfokale software.
  4. Excite BODIPY 593/503 ved hjælp af 488 nm argon laserlinjen og DAPI ved hjælp af 405 nm laserlinjen. Indstil emissionsintervallerne til 493-589 nm for BODIPY 493/503 og til 410-464 nm for DAPI.
  5. Brug følgende indstillinger: pinhole: 1 AU, opløsning: 1.024 pixels x 1.024 pixels, bitdybde: 12, pixelstørrelse: 0,415 μm, tovejstilstand, scanningshastighed: 7 (~1,58 μs/pixel for et 20x mål), linjegennemsnit: 2x og digital zoom: 1.
    BEMÆRK: Ovennævnte scanningsparametre skal optimeres for hvert konfokalmikroskop og mål, der anvendes.
  6. Indstil forstærkningen og den digitale forstærkning korrekt, så der ikke registreres mættede pixel på områdeindikatoren.
    BEMÆRK: Korriger baggrundssignalet ved at justere forskydningen.
  7. Når LD'erne er korrekt identificeret, skal du erhverve billedet med BODIPY- og DAPI-kanalerne.
    BEMÆRK: Alle billederne skal erhverves under de samme betingelser (eksponering og generelle indstillinger) for hver farvekanal.
  8. Hvis du vil oprette billeder med bredt område (figur 2), skal du ændre målet til a10x objektivobjektiv (plan-neofluar: 10x/0.3).
  9. Vælg flisescanningstilstand , og lav mosaikker på 5 pr. 5 billeder.
    BEMÆRK: I dette arbejde havde hver flise en overlapning på 10% for korrekt at flette fliserne til analyse.
  10. For at skabe 3D- og ortogonale visninger (figur 3A) skal du placere en dråbe nedsænkningsolie oven på dækglasset og ændre målet til et 40x objektivobjektiv (plan-neofluar: 40x/1,30 olie).
  11. Vælg Z-Stack-tilstand, og ved at justere Z-planet skal du definere den første og sidste position til erhvervelse med en optisk skive med en optimal tykkelse (~ 0,5 μm) for at sikre, at alle dråberne fanges.
    BEMÆRK: For at fremskynde billedoptagelsen og undgå blegning kan den optiske skive justeres til en suboptimal størrelse, hvilket sikrer mindst 30% oversampling for en god 3D-rekonstruktion.
  12. Vælg ortomodulet , og opret ortogonale visninger.
  13. Hent 3D-billeder ved at vælge 3D-modulet efter Transparency Rendering Mode med konfokalmikroskopsoftwaren.

7. Analyse af billeder

  1. Behandl og analyser enkeltplanbillederne (20x forstørrelse) med CellProfiler (version 4.2.5).
    BEMÆRK: Rørledningen, der blev brugt i dette arbejde, blev tilpasset fra Adomshick et al.45.
  2. Klik på modulet Billeder i øverste venstre hjørne af CellProfiler-vinduet, og upload billederne som .tiff filer.
  3. Brug modulet NamesAndTypes til at sortere mellem farvede billeder af typen BODIPY- (droplet) og DAPI- (nuclei) baseret på filnavnene. Udfør kun LD-analysen med BODIPY-farvede billeder.
  4. For at starte pipelinekonstruktionen skal du klikke på Juster moduler og vælge modulet ColorToGray for at konvertere billederne til gråtonebilleder.
    BEMÆRK: For at identificere objekter kræves gråtonebilleder.
  5. Identificer slipværktøjer ved at anvende modulet IdentifyPrimaryObjects ved hjælp af gråtonebilledet.
    BEMÆRK: Parametrene i dette modul skal justeres for at opnå god LD-identifikation. I dette arbejde førte definition af LD'er med en størrelse mellem 6 pixels og 300 pixels og en tærskelkorrektionsfaktor på 1,0 til den mest nøjagtige identifikation.
  6. For at måle pixelintensiteten af de identificerede lipiddråber skal du tilføje et MeasureObjectIntensity modul.
  7. Tilføj et ekstra FilterObjects-modul for at sikre, at kun de stærkeste signaler kvantificeres, mens mindre intense signaler udelukkes fra den endelige lipiddråbeanalyse (minimumsintensitet: 0,15; maksimal intensitet: 1 vilkårlig enhed).
  8. Hvis du vil måle LD'erne, der er relateret til outputdataene, skal du tilføje modulet MeasureObjectSizeShape .
  9. Tilføj et OverlayOutlines-modul på dette tidspunkt for at overlejre den identificerede dråbe på det originale billede og dermed sikre, at segmenteringen også ser nøjagtig ud på det ubehandlede billede.
    BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin (kvalitetskontrol).
  10. Tilføj et ExportToSpreadsheet-modul i slutningen, og klik på knappen Analysér billeder i nederste venstre hjørne.

8. Statistisk analyse

  1. Resultaterne udtrykkes som middelværdi ± standardfejl for middelværdien (S.E.M.) ved hjælp af et hvilket som helst statistisk analyseprogram.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev GraphPad-software brugt til statistisk analyse.
  2. Analyser fordelingen af værdier ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov-testen for at vurdere signifikante afvigelser fra normalitet. Analyser parametriske data ved hjælp af elevens uparrede t-test.
    BEMÆRK: Værdier på p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den vellykkede udførelse af denne teknik bør resultere i klar lipiddråbefarvning til samtidig karakterisering af LD-morfologien (form og lipidkernetæthed baseret på 3D-rekonstruktionen) sammen med deres rumlige fordeling, antal pr. Samlet areal og gennemsnitlig størrelse (vurderet med rørledningen ovenfor beskrevet, figur 1).

Figure 1
Figur 1: Eksempel på billedbehandling ved hjælp af CellProfiler . (A) Originalt billede af LD'er farvet med BODIPY 493/503 (grøn) og kerner farvet med DAPI (blå) i CTL-gruppen. (B) CTL-gruppens differentierede LD'er (magenta) blev overlejret ved hjælp af modulet OverlayOutlines . (C) Originalt billede af LD'er farvet med BODIPY 493/503 (grøn) og kerner farvet med DAPI (blå) i HFD-gruppen. (D) HFD-gruppens differentierede LD'er (magenta) blev overlejret ved hjælp af modulet OverlayOutlines . Billeder blev taget ved 20x forstørrelse ved hjælp af et laserpunktscanningskonfokalmikroskop. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: CTL = kontrolgruppe; HFD = fedtfattig diætgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Serum-TG'er, total kolesterol, LDL-c, HDL-c samt lever-TG-indholdet blev evalueret (tabel 1). HFD-fodrede dyr præsenterede en udtalt dyslipidemisk profil, karakteriseret ved en accentueret ophobning af hepatiske TG'er (345% sammenlignet med CTL , p < 0,001) sammen med en subtil stigning i cirkulerende TG-niveauer (129% sammenlignet med CTL, p > 0,05).

Parameter CTL HFD
Serum
Total kolesterol (mg / dl) 56,67 ± 9,35 80.40 ± 7.45
LDL (mg / dl) 7,66 ± 0,84 7.40 ± 1.03
HDL (mg/dl) 17,83 ± 2,93 28.40 ± 2.40 *
Triglycerider (mg / dl) 154,8 ± 40,17 201,2 ± 38,12
Lever
Triglycerider (mg/g) 15.29 ± 1.31 52,83 ± 6,73 ***

Tabel 1: Serum-TG'er, total kolesterol, LDL-c, HDL-c og lever-TG-indholdet. Data udtrykkes som gennemsnit ± SEM (n = 5-6 pr. gruppe). p < 0,001 versus CTL. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en studerendes uparrede t-test. Forkortelser: CTL = kontrolgruppe; HFD = fedtfattig diætgruppe.

Figur 2 viser repræsentative billeder i bredområdet (flisescanninger med et 10x mål) af leversektioner, hvor LD'er er farvet med BODIPY 493/503 (grøn) og kerner er farvet med DAPI (blå). Individuelle LD'er i forskellige størrelser blev med succes visualiseret med BODIPY 493/503-farvning, som viste et udbredt fordelingsmønster hos de HFD-fodrede dyr.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder af LD-akkumulering i levervæv. LD'er farvet med BODIPY 493/503 (grøn) og kerner farvet med DAPI (blå). Billeder blev taget ved 10x forstørrelse ved hjælp af et laserpunktscanningskonfokalmikroskop. Skalastænger = 200 μm. Forkortelser: CTL = kontrolgruppe; HFD = fedtfattig diætgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3A viser repræsentative ortogonale projektioner med et 20x mål og 3D-billeder med et 40x mål for hepatiske LD'er. Enkeltplanbilleder blev behandlet og analyseret af CellProfiler (version 4.2.5) for at vurdere fluorescensintensiteten, antallet, arealet og diameteren af LC'erne (figur 3B-E). Det var muligt at bekræfte, at de HFD-fodrede dyr udviste et øget antal hepatiske LD'er (151% vs. CTL, figur 3B), og dette blev bekræftet af den forstærkede BODIPY 493/503 fluorescensintensitet (182% vs. CTL, p < 0,001, figur 3C). Desuden blev arealforholdet mellem LD'er næsten tredoblet (360% vs. CTL, p < 0,0001, figur 3D), da de præsenterede større diametre (182% vs. CTL, figur 3E) hos HFD-fodrede dyr. For at vurdere størrelsesfordelingen blev LD'erne kategoriseret i tre grupper i henhold til diameterområderne: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm og d > 9 μm (figur 3F). De dyr, der blev fodret med HFD, viste en stigning på mere end 20% i antallet af overdimensionerede, makrovesikulære lever-LD'er (d > 9 μm, p < 0,0001) sammen med en næsten tredobling i antallet af mikrovesikler mindre end 3 μm i diameter (1 μm < d ≤ 3 μm, p < 0,0001).

Figure 3
Figur 3: Ortogonale/3D-visninger af LD'er og dataanalyse. (A) Repræsentative ortogonale projektioner og 3D-gengivne billeder af hepatiske lipiddråber (grøn, BODIPY 493/503) og kerner (blå, DAPI) i leveren hos mus, der fodres med en normal diæt eller HFD-diæt. Billeder blev taget ved 20x (venstre) og 40x (højre) forstørrelse ved hjælp af et laserpunktscanningskonfokalmikroskop. Skalastænger = 20 μm. (B) Antal hepatiske LD'er. (C) Fluorescensintensitet af de hepatiske LD'er. (D) Arealforhold mellem de hepatiske LD'er. (E) Lipiddråbediametre. F) Brøkdele af grupper af hepatiske lipiddråber med forskellige diametre: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm og d > 9 μm. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. n = 5-6 mus/gruppe * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en studerendes uparrede t-test. Forkortelser: CTL = kontrolgruppe; HFD = fedtfattig diætgruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserede protokol til LD-vurdering havde til formål at udvikle en ny billeddannelsesmetode til evaluering af hepatisk steatose. I betragtning af den stærke sammenhæng mellem fedme og fedtleversygdom blev den vestlige diæt med højt fedtindhold brugt til at etablere en dyremodel for hepatisk steatose26. En robust stigning i hepatisk TG-indhold blev bekræftet af et kvantitativt triglycerider kolorimetrisk assaykit, som foreslog et forhøjet hepatisk lipidosescenarie hos HFD-fodrede dyr. Derefter blev graden af LD-akkumulering visualiseret af den fluorescerende sonde BODIPY 493/503 under lav forstørrelse. Som forventet afslørede BODIPY 493/503-farvningen en udbredt fordeling af vesikulære strukturer på tværs af levervævet i HFD-gruppen. Ved at ty til ortogonale fremskrivninger og 3D-rekonstruktioner var det muligt at observere, at LD-kernen præsenterede et fuldt indhold af neutrale lipider, der fremstod som næsten sfæriske dråber. Desuden var den robuste stigning i LD-arealet pr. samlet areal tydeligt (360% vs. CTL-gruppen), og dette område var sandsynligvis fyldt med neutrale TG'er givet deres kvantitative score i HFD-gruppen (52,83 mg / g ± 6,73 mg / g; 346% vs. CTL-gruppen). For yderligere at karakterisere LD-dynamikken ved HFD-fodring blev den mikro- eller makrovesikulære karakter af hepatisk steatose analyseret. Ved hjælp af LD-diameterintervallerne, der tidligere er beskrevet i litteratur 4,46,47, var det muligt at skelne et signifikant fald i det mikrovesikulære LD-tal (1 μm < d ≤ 3 μm), hvilket var parallelt med en proportional stigning i LD-makrovesikler (d > 9 μm). Flere undersøgelser har rapporteret, at LD'er i hepatocytter kan danne overdimensionerede LD'er (op til titalls mikron i diameter)4,46,47, hvilket er i overensstemmelse med de nuværende resultater.

I de senere år er klassiske lipidfarvestoffer gradvist blevet erstattet med et nyt udvalg af fluorescerende lipofile sonder, såsom BODIPY, givet deres neutrale og plane struktur stabiliseret af et difluorborkompleks48; disse sonder har vist sig at være meget effektive til at mærke LD'er for at studere deres morfologi, dynamik og interaktion med andre organeller i levende celler og nogle faste væv 49,50. Inden for den fluorescerende farvede lipiddråberprotokol, der præsenteres heri til vurdering af hepatisk steatose, er der nogle kritiske trin for succesen med teknikken, der hovedsagelig er afhængige af vævsforberedelse og billedoptagelse. Da BODIPY-signalet kan bleges af UV-lys51, skal LD-billeddannelse finde sted, før der afbildes andre fluorescerende farvestoffer, der er ophidset af UV-lys, såsom de almindeligt kendte DNA-fluorescerende farvestoffer. Desuden anbefales det stærkt at beskytte mikroskopets dias mod lyseksponering for at forhindre BODIPY fluorescens slukning før billeddannelse. Selvom 3D-rekonstruktionen af LD'er er meget nyttig til studiet af deres morfologi, er det ekstremt tidskrævende, da 3D-rekonstruerede billeder består af flere uafhængige 2D-billeder. Derfor bør forskere overveje at undgå dette trin, når det primære mål med forsøget udelukkende er vurdering af mikro- og makrovesikulær hepatisk steatose. For at undgå bias bør to uafhængige observatører, der er blinde for behandlingsgruppen, udføre dataindsamlingen og analysen. Den halvautomatiske billedbehandlingssoftware (Cell Profiler-pipeline) bidrager yderligere til en halvblind kvantificering og overvinder den øgede behandlingstid, der konsekvent observeres i manuel analyse.

Denne teknik kan udvides til bredere anvendelser i kombination med immunhistokemisk farvning af andre væv og arter, så længe de optimale BODIPY-koncentrationer og billedoptagelsesindstillinger er bestemt for at maksimere signal/baggrundsforholdet. Sådanne forsøgsindstillinger kan muliggøre samtidig påvisning af andre antigener, forudsat at den anden anvendte fluorofor ikke overlapper BODIPY-excitations-/emissionsspektrene.

Samlet set er den optimerede BODIPY 493/503 fluorescensbaserede protokol, der præsenteres heri, et pålideligt og simpelt værktøj til LD-karakterisering og kan repræsentere en komplementær tilgang til de klassiske histologiske protokoller, der ofte anvendes til at bekræfte og klassificere hepatisk steatose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev finansieret af nationale og europæiske fonde via den portugisiske videnskabs- og teknologifond (FCT), Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (FEDER) og Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) og POCI-01-0145-FEDER-007440. Forfatterne vil gerne takke støtten fra iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, en facilitet ved Det Medicinske Fakultet ved University of Coimbra og medlem af den nationale infrastruktur PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122) samt støtte fra FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) Sigma-Aldrich, Lyon, France D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR D1306
70% ethanol Honeywell 10191455
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717 Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany 8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) Daido Sangyo Co., Ltd, Japon _
Blade Leica 221052145 Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5 https://cellprofiler.org/releases/ Used to analyse the acquired images
Coverslips Menzel-Glaser, Germany _
Cryomolds Tissue-Tek _
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S Leica Biosystems _
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich, Lyon, France D-8418 Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic
and flammable. Vapors may cause
irritation. Manipulate in a fume
hood. Avoid direct contact with skin.
Wear rubber gloves, protective eye
goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler) Novolab A26742
Dumont forceps Fine Science Tools, Germany 11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø
150 mm)		 Thermo Scientific 150318 Used to weigh the liver after dissection
Glycergel DAKO Omnis S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet Envigo, Barcelona, Spain MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL) Dechra 791/01/14DFVPT Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; ) Carl Zeiss, germany LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) Dechra 1838 ESP / 020/01/07RFVPT Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle BD microlance 300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel
Blade		 Swann-Morton 205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)  Carl Zeiss, Germany
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3) Gilson 1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) Sigma-Aldrich, Lyon, France P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 Swann-Morton 0208
Slide staining system StainTray Simport Scientific M920
Standard diet  Mucedola 4RF21
Superfrost Plus microscope slides Menzel-Glaser, Germany J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media VWR CHEMICALS 361603E
Triglycerides colorimetric assay kit Cayman Chemical 10010303
Ultrasonic bath Bandelin Sonorex  TK 52
Vannas spring scissors - 3 mm
cutting edge		 Fine Science Tools, Germany 15000-00
ZEN Black software Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
  2. Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
  3. Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
  4. Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
  5. Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
  6. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  7. Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
  8. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  9. Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
  10. Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
  11. Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
  12. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
  13. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
  14. Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
  15. Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
  16. Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
  17. Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
  18. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
  21. Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
  22. Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
  23. Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
  24. Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
  25. Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
  26. Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
  27. Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
  28. Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
  29. Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
  30. Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
  31. Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
  32. Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
  33. Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
  34. Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
  35. Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
  36. de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
  37. Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What's new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
  38. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
  39. Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
  40. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
  41. Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
  42. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
  43. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
  44. Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
  45. Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
  46. Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
  47. Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
  48. Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
  49. Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
  50. Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
  51. Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).

Tags

Biokemi udgave 196 Lipiddråber BODIPY 493/503 fluorofor neutrale lipider laserscanning konfokal analyse mikrovesikulær makrovesikulær hepatisk steatose
Analyse af fluorescerende farvede lipiddråber med 3D-rekonstruktion til vurdering af hepatisk steatose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia, K., Alves, A.,… More

Garcia, K., Alves, A., Ribeiro-Rodrigues, T. M., Reis, F., Viana, S. Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment. J. Vis. Exp. (196), e65206, doi:10.3791/65206 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter