Summary
تقضي هذه الطريقة على أي غزو كبير أثناء حقن الخلايا الناجم عن محلول تعليق الخلية.
Abstract
حقن الخلايا مباشرة في الأنسجة هو عملية ضرورية في إدارة الخلايا و / أو العلاج البديل. يتطلب حقن الخلية كمية كافية من محلول التعليق للسماح للخلايا بدخول الأنسجة. يؤثر حجم محلول التعليق على الأنسجة ، وهذا يمكن أن يسبب إصابة غازية كبيرة نتيجة لحقن الخلية. تقدم هذه الورقة تقريرا عن طريقة جديدة لحقن الخلايا ، تسمى الحقن البطيء ، والتي تهدف إلى تجنب هذه الإصابة. ومع ذلك ، فإن دفع الخلايا من طرف الإبرة يتطلب سرعة حقن عالية بما فيه الكفاية وفقا لقانون نيوتن لقوة القص. لحل التناقض أعلاه ، تم استخدام سائل غير نيوتوني ، مثل محلول الجيلاتين ، كمحلول تعليق الخلية في هذا العمل. محلول الجيلاتين له حساسية لدرجة الحرارة ، حيث يتغير شكله من هلام إلى سول عند حوالي 20 درجة مئوية. لذلك ، للحفاظ على محلول تعليق الخلية في شكل هلام ، تم تبريد المحقنة في هذا البروتوكول ؛ ومع ذلك ، بمجرد حقن المحلول في الجسم ، حولته درجة حرارة الجسم إلى سول. يمكن أن يمتص تدفق سائل الأنسجة الخلالي المحلول الزائد. في هذا العمل ، سمحت تقنية الحقن البطيء لكرات عضلة القلب بدخول عضلة القلب المضيفة والنقش دون التليف المحيط. استخدمت هذه الدراسة طريقة حقن بطيئة لحقن خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة المنقاة والمشكلة على شكل كرة في منطقة نائية من احتشاء عضلة القلب في قلب الفئران البالغة. في 2 أشهر بعد الحقن ، أظهرت قلوب المجموعات المزروعة وظيفة انقباض محسنة بشكل ملحوظ. علاوة على ذلك ، كشفت التحليلات النسيجية للقلوب البطيئة الحقن عن روابط سلسة بين المضيف وخلايا عضلة القلب الطعم عبر أقراص مقحمة تحتوي على وصلات تقاطع الفجوة. يمكن أن تساهم هذه الطريقة في علاجات الخلايا من الجيل التالي ، لا سيما في الطب التجديدي للقلب.
Introduction
تعد إدارة الخلايا واستبدالها استراتيجيات علاجية جديدة واعدة للأعضاء التالفة بشدة. من بين هذه الاستراتيجيات العلاجية الجديدة ، اجتذب الطب التجديدي للقلب اهتماما كبيرا. ومع ذلك ، فإن الالتهاب الناجم عن الإصابات يتوسط في تكوين ندبة في العديد من الأعضاء1،2،3،4. يتكون قلب الإنسان من حوالي 1010 خلايا عضلية قلبية. لذلك ، من الناحية النظرية 5,6 ، يجب أن تعامل مع أكثر من 109 خلايا عضلية القلب. قد يؤدي إعطاء عدد كبير من خلايا عضلة القلب عن طريق طرق الحقن التقليدية إلى إصابات كبيرة في الأنسجة7. توفر هذه الطريقة طريقة جديدة لحقن الخلايا مع الحد الأدنى من غزو الأنسجة.
يتطلب إعطاء الخلايا في حمة العضو حقنة (حقن). ومع ذلك ، يوجد تناقض في أن الحقن نفسه قد يؤدي إلى إصابة الأنسجة. تسبب إصابة الأنسجة التهابا موضعيا وتندبا غير قابل للشفاء في الأعضاء والأنسجة ، فضلا عن ضعف القدرة على التجدد8،9،10. قلب الثدييات لديه ميل كبير للغاية لتطوير الندوب بدلا من التجدد لأنه يتطلب إصلاحا فوريا للإصابة من أجل تحمل ارتفاع ضغط الدم الناجم عن وظيفة الضخ المستمرة11. يستخدم العلاج بالاستئصال هذا الميل العالي نحو تكوين الندبة ويمنع الدائرة التي من المحتمل أن تخضع لتشكيل ندبة باستخدام عدم انتظام ضربات القلب12. في دراسة سابقة ، لوحظ أن النسيج الندبي عزل خلايا عضلة القلب المحقونة في عضلة القلب المضيفة. وبالتالي ، فإن هذا يمثل القضية المستهدفة التالية التي يجب التغلب عليها للحصول على فعالية علاجية محسنة في الطب التجديدي للقلب.
يلعب تدفق السائل الخلالي النسيجي دورا حيويا في نقل الأكسجين والمواد المغذية إلى الخلايا وإزالة الفضلات المفرزة من الخلايا. تختلف السرعة الفسيولوجية لتدفق السائل الخلالي في كل نسيج / عضو (النطاق هو 0.01-10 ميكرومتر / ثانية)13. على حد علم المؤلف ، لا توجد بيانات تتعلق بقدرة الأنسجة / الأعضاء الفردية على دعم كميات إضافية من السوائل دون وذمة مرضية. ومع ذلك ، تحاول هذه التجربة استخدام سرعة حقن بطيئة لتقليل إصابة الأنسجة ، ويمكن استخدام النتائج لتحديد التطبيق العملي لهذا المفهوم.
Protocol
أجريت التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لجامعة كانساي الطبية للتجارب على الحيوانات وتمت الموافقة عليها من قبل اللجان الأخلاقية (رقم الموافقة: 23-104). تم تربية جميع الحيوانات تحت دورة الضوء والظلام المستمرة في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض. تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية المعقمة ، مثل المقص والملقط والمبعدات ، وتجفيفها جيدا.
1. إعداد كرات عضلة القلب الفئران حديثي الولادة
- جمع قلب الفئران حديثي الولادة
- بالنسبة لجمع القلب ، اتبع إجراء مشابها لذلك الموضح في تقرير سابق7.
- اغمر فئران Sprague-Dawley (SD) حديثي الولادة (0-2 أيام بعد الولادة) في محاليل البوفيدون واليود و 70٪ من الإيثانول بالتتابع ، ثم قم بنقلها إلى علبة محكمة الغلق مملوءة بالإيزوفلوران المتبخر (يجب أن يكون التركيز أكثر من 10٪ v / v) للتخدير العميق.
- بعد تأكيد فقدان الوعي عن طريق فقدان النشاط الحركي ، قطع رأس الفئرانأثناء إمساك الجسم من الخلف باليد ، ثم قطع 2-4 مم من الأنسجة من المركز الأمامي للقفص الصدري إلى الذيلية ثم في اتجاه المنضدة باستخدام مقص حاد.
- امسك الجلد الخلفي لسحب الجرح مفتوحا ودفع القلب من القفص الصدري. قطع البطينين باستخدام مقص وغمرهم في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم (PBS (-)).
- تشتت خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة
- قم بفرم البطينين المجمعين المنتشرين في الحد الأدنى من المخزن المؤقت للإعلانات (مخزن الإعلانات المؤقت: 116 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 20 مللي مول HEPES ، 12.5 مللي متر NaH2PO 4 ، 5.6 مللي مول جلوكوز ، 5.4 مللي مول KCl ، 0.8 مللي مول MgSO4 ، درجة الحموضة 7.35) في أواني زجاجية مقعرة معقمة إلى قطع صغيرة (1 مم × 1 مم) باستخدام مقص منحني.
- انقل الأنسجة المفرومة ومحرك مغناطيسي دقيق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وقم بتفريق الأنسجة إلى خلايا مفردة تحتوي على 0.1٪ كولاجيناز ، و 0.1٪ تربسين ، و 20 ميكروغرام / مل DNase I ، و 50 نانومتر رباعي ميثيل رودامين إستر ميثيل في مخزن الإعلانات المؤقت عند 37 درجة مئوية عن طريق التقليب لمدة 30 دقيقة.
- افصل الركام والخلايا المشتتة من خلال الترسيب الطبيعي ، واجمع الخلايا المشتتة فقط في أنبوب ، وهضم مجاميع الخلايا المتبقية مرة أخرى بنفس وسط الهضم.
- استمر في هذا الإجراء حتى يتم فصل جميع الخلايا تماما. لتأكيد التشتت الكامل للخلايا ، راقب الأنابيب تحت المجهر (عدسة موضوعية 4x).
- اجمع الخلايا المشتتة باستخدام الطرد المركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق وافصلها في 1-2 مل من مخزن الإعلانات المؤقت.
- فرز الخلايا المنشطة بالتألق لخلايا عضلة القلب
- قم بتحليل الخلايا باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام مرشحات تمرير النطاق 556-601 نانومتر للكشف عن إشارات التألق الحمراء.
- أداء بعناية قبل البوابات للقضاء على الكسور المزدوجة14. يجب أن تكون إعدادات البوابة للتخلص المزدوج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- اضبط التشتت الأمامي على المحور السيني وإشارة التألق الحمراء على المحور ص. لوحظت ثلاث مجموعات سكانية: عدد أقل من السكان يحتوي على كريات الدم الحمراء والخلايا الميتة ، ومجموعة متوسطة تحتوي على خلايا عضلية غير قلبية ، بما في ذلك الخلايا الليفية والخلايا البطانية ، وأعلى عدد من السكان يحتوي على خلايا عضلة القلب البطينية النقية7.
- تحضير كرات عضلة القلب الحمراء الموسومة بالتألق
- فرز انتقائي للخلايا العضلية القلبية ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 150 × غرام. قم بإذابة كريات الخلايا تماما في 1 مل من الوسط الأساسي الأدنى المعدل ألفا (alpha-MEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS).
- قم بقياس تركيز الخلية باستخدام مقياس الدم وتخفيف محلول تعليق الخلية إلى 3000 خلية / مل باستخدام alpha-MEM 10٪ FBS.
- قم بتوزيعها على ألواح 96 بئرا غير لاصقة للخلايا (100 ميكرولتر لكل بئر) ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 100 × جم ، وثقافة لمدة 2-3 د في حاضنة زراعة الخلايا مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
- قبل تجارب الحقن ، قم بحصاد كرة عضلة القلب من كل بئر عن طريق الشفط باستخدام وسط الاستزراع باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، وجمعها في أنبوب سعة 15 مل.
- تلطيخ مع PKH26 باتباع تعليمات الشركة المصنعة للتتبع بعد النقش.
2. الاستعدادات لطريقة الحقن البطيئة
- تحضير محلول مخزون الجيلاتين
- قم بوزن الجيلاتين ، وقم بإذابته في مخزن الإعلانات المؤقت لإنتاج محلول وزن / فيديو بنسبة 10٪ ، وقم بتعقيمه.
- إنتاج جهاز حقن الخلايا
- التصميم العام للجهاز: قم بإعداد الجهاز الموضح في الشكل 1. يتم دمج هذا النظام مع جهاز تبريد حقنة وجهاز حقن رئيسي.
- قم بإعداد جهاز الحقن الرئيسي الموضح أدناه:
- لحقن كرة عضلة القلب الوليدية ، استخدم إبرة بطول 29 جم و 50 مم مزودة بحقنة.
- قم بتوصيل حقنة نقل الطاقة (18 جم ، 1 مل) متتالية باستخدام حقنة حقن الخلايا (الشكل 1). قم بتوصيل إبرة حقنة نقل الطاقة بأنبوب رفيع من مادة البولي بروبيلين مع قابلية توسيع منخفضة التجويف.
- بعد ذلك ، قم بتوصيل الجانب الآخر من أنبوب نقل الطاقة بإبرة نفس المحقنة (18 جم ، 1 مل) ، وضعها في مضخة حقنة. املأ حقنتي وأنابيب نقل الطاقة بالماء دون أي فقاعات هواء.
ملاحظة: عندما يتم دفع مكبس واحد من حقنة نقل الطاقة للداخل ، يتم نقل الضغط مباشرة إلى المحقنة الأخرى ، ويبرز المكبس.
- قم بإعداد نظام تبريد حقنة الحقن كما هو موضح أدناه.
- لف أنبوبا نحاسيا (القطر الخارجي = 1 مم ؛ القطر الداخلي = 0.3 مم ؛ السماكة = 0.35 مم) بإحكام حول الجزء المحتوي على الخلية من حقنة حقن الخلية ، تاركا 10 مم من الأنبوب الزائد في كلا الطرفين.
- قم بتوصيل الأنبوب النحاسي بأنابيب بلاستيكية مرنة. علاوة على ذلك ، قم بتوصيل الأطراف الأخرى من الأنبوب البلاستيكي بمضخة خارجية ، واملأ الخط بماء التبريد ، وقم بتبريد الماء عن طريق غمر الأنبوب النحاسي الزائد في الثلج المجروش (الشكل 1).
ملاحظة: يحافظ نظام التبريد هذا على محلول تعليق الخلية في الأسطوانة عند 2 درجة مئوية تقريبا.
3. تطوير نموذج احتشاء عضلة القلب الفئران عن طريق انسداد الشريان التاجي منفرج
- تخدير ذكور الفئران العارية التي تعاني من نقص المناعة (F344 / Njcl-rnu / rnu) بهواء يحتوي على 3٪ إيزوفلوران. أدخل قنية في القصبة الهوائية وقم بتوصيلها بجهاز التنفس الصناعي.
- قم بتوصيل قنية بمبخر isoflurane مع وحدة تحكم للحفاظ على تركيز 3٪ isoflurane ، وبالتالي الحفاظ على التخدير الكافي. تأكيد عدم الاستجابة لمحفزات الألم. تطبيق مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف.
- ثبت الأطراف بأشرطة جراحية مقطوعة على صفيحة جراحية دافئة بدرجة حرارة 40 درجة مئوية. تحريف جسم الجرذ إلى يمين محور الجسم واستخدام الإبط الأيسر كمجال جراحي.
- إزالة الشعر في المجال الجراحي باستخدام كريم مزيل الشعر ومسح الجلد مع البوفيدون اليود. باستخدام مقص حاد ، قم بقطع شق 1.5 سم في الجلد والعضلة الصدرية الرئيسية.
- تأكيد الفضاء الوربي الثالث وتمزيق العضلات الوربية وغشاء الجنب الضلعي باستخدام ملقط دقيق مع نصائح حادة. أبق الصدر مفتوحا باستخدام مبعدة . قم بإزالة التامور الرقيق برفق بالملقط.
- لبناء نموذج احتشاء للجدار الجانبي للقلب ، ابحث عن الموضع الذيلي 1 مم إلى طرف الأذين الأيسر لتحديد الشريان التاجي المنفرج ، وقم بتمرير خياطة حريرية 7-0 ، واغرف الأنسجة التي يبلغ عرضها 2.5 مم وعمقها 2.5 مم من الظهرية إلى البطنية ، وربط الأنسجة بإحكام.
- تأكيد الربط الناجح عن طريق الانكماش الضعيف البعيد من الرباط. بعد إزالة المبعثر برفق ، ضع خيطا حريريا 5-0 بين الفراغات الوربية الثانية والرابعة ، وأغلق بضع الصدر.
- تقليل تركيز الأيزوفلوران إلى 1٪. خياطة العضلات والجلد بلطف مع 5-0 الحرير. قلل تركيز الأيزوفلوران إلى 0٪ وانتظر لمدة 5 دقائق تقريبا حتى يبدأ التنفس التلقائي.
- موضعيا ضع 2 ملغ / مل ليدوكائين في محلول ملحي على الشق. تطبيق 1 مل من محلول ملحي عن طريق الحقن تحت الجلد. تطبيق مرهم الطبيب البيطري موضعيا لمنع الالتهابات.
- إزالة الفئران من أنبوب التنبيب ، والعودة إلى قفص الحيوان. ثم ، رفع الفئران في أقفاص فردية لمدة 1 أسبوع.
- تحليل التغيرات في وظيفة مضخة القلب الانقباضي باستخدام تخطيط صدى القلب.
ملاحظة: سيتم تقليل وظيفة القلب بسبب احتشاء عضلة القلب الجانبي.
4. زرع الخلايا عن طريق الجلد الموجهة بالصدى باستخدام طريقة الحقن البطيء
- قم بتسخين 10٪ من مرق الجيلاتين مسبقا عند 37 درجة مئوية حتى يصبح سائلا.
- قم بتخفيف مخزون الجيلاتين بنسبة 10٪ باستخدام مخزن الإعلانات المؤقت قبل التسخين للحصول على محلول الجيلاتين النهائي القابل للحقن بنسبة 5٪ وزن / فولت (مطلوب 100 ميكرولتر لكل).
- تعليق 96 كرة عضلة القلب (المجموع: 28800 خلية عضلية قلبية /) في 100 ميكرولتر من محلول الحقن المسخن مسبقا.
- قم بتحميل التعليق المحضر في الخطوة 4.3 في حقنة حقن الخلية ، وتجنب طموح الهواء الزائد.
- للتخلص من الفقاعات في المحقنة ، امسكها عموديا مع الإبرة لأعلى ، واضغط على المحقنة ، واجمع أي فقاعات في الحافة العلوية للمحقنة.
ملاحظة: خلال هذه الخطوة ، لاحظ أن كرات عضلة القلب تستقر تدريجيا على الختم المطاطي للمكبس. - حافظ على الوضع الرأسي للمحقنة ، وادفع المكبس لأعلى ببطء ، وتخلص من الفقاعات ومحلول تعليق الخلية الزائد حتى يبقى 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في المحقنة. ادفع المكبس بعناية بسرعة ثابتة حتى تظل كرة عضلة القلب مستريحة على الختم المطاطي للمكبس.
- اغمر المحقنة المغطاة مباشرة في حمام جليدي لمدة 5 دقائق.
- ضع حقنة مبردة في جهاز الحقن. ثبت بإحكام جهاز حقنة الحقن المستقر على جهاز حركة دقيقة على مسرح الحيوان باستخدام مشبك يدوي قابل للتعديل من X-Y-Z. يمكن لجهاز الحركة الدقيقة تحريك موضع الإبرة باستخدام الشريحة ذات الاتجاه x 20 مم ، والتأرجح في الاتجاه y ، وحركات الانحناء في اتجاه z.
- تخدير الفئران في صندوق مغلق مملوء بالهواء يحتوي على 3٪ إيزوفلوران. تأكيد التخدير من خلال عدم الاستجابة لمحفزات الألم. تطبيق مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف.
- ثبت الأطراف بأشرطة جراحية مقطوعة على لوحة صدى دافئة بدرجة حرارة 40 درجة مئوية. للحفاظ على التخدير الكافي ، تأكد من أن الهواء المستنشق يحتوي على تركيز 3٪ تقريبا من الأيزوفلوران.
- قم بإزالة الشعر في حقل الحقن (قطره 2 سم) والصدر باستخدام كريم مزيل الشعر وامسح الجلد باستخدام البوفيدون اليود.
- تطبيق هلام الصدى على الصدر ومسبار الصدى. ضع مسبار الصدى بالقرب من الصدر على طول المحاور القحفية والذيلية وابدأ في الحصول على تخطيط صدى القلب في الوضع B باتباع دليل الشركة المصنعة.
- دفع طرف إبرة الحقن إلى عضلة القلب عند المنظر الأمامي (الشكل 2 والفيديو التكميلي 1).
- لتنشيط مضخة المحقنة الرئيسية ، اضغط على زر البدء ، وقم بتدوير القرص للتكيف مع رقم محدد مسبقا لسرعة حقن تبلغ حوالي 0.02 ميكرولتر / ثانية. ضع مرهما بيطريا موضعيا حول موضع الوخز بالإبر لمنع الالتهابات.
ملاحظة: من الضروري تحديد رقم الاتصال المناسب لسرعة الحقن المقصودة باستخدام محلول الحقن. بعد الحقن ، قم بإزالة إبرة الحقن باستخدام نظام حركة مثالي. - قلل تركيز الأيزوفلوران إلى 0٪ وانتظر لمدة 5 دقائق تقريبا حتى يستعيد الحيوان وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
5. تقييم وظائف القلب
- تخدير الفئران في صندوق مغلق مملوء بالهواء يحتوي على 3٪ إيزوفلوران. تأكيد التخدير من خلال عدم الاستجابة لمحفزات الألم. تطبيق مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع الجفاف.
- ضع كريما مكهربا لاكتساب تخطيط القلب على أطراف الأطراف. ثبت الأطراف بأشرطة جراحية مقطوعة على لوحة صدى دافئة بدرجة حرارة 40 درجة مئوية. استخدم نظام مراقبة فسيولوجي للكشف عن تخطيط القلب ومعدل ضربات القلب في الوقت الفعلي.
- وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، حدد أولا زاوية المحور الطويل باستخدام صورة صدى الوضع B التي تظهر قمة البطين الأيسر إلى مجرى التدفق الخارجي ، ثم قم بتدوير مسبار الصدى 90 درجة للتغيير إلى عرض المحور القصير.
- باستخدام نظام الحركة الدقيقة للمحور الذيلي إلى المنبر فقط في المرحلة الحيوانية ، اضبط عرض المحور القصير على مستوى العضلات الحليمية. بعد ذلك ، قم بتغيير وضع الصورة إلى الوضع M بالضغط على زر M-mode ، وسجل مقطع فيديو لمدة 5 ثوان بالضغط على زر Cine-loop .
- لتحليل وحساب تقصير الكسر باستخدام البرنامج ، اضغط على زر القياس وأداة الخط العمودي لتحديد الأبعاد الداخلية للبطين الأيسر الانقباضي ونهاية الانبساطي. يقوم البرنامج تلقائيا بحساب النسبة المئوية لتقصير الكسر (FS).
- قلل تركيز الأيزوفلوران إلى 0٪ وانتظر لمدة 5 دقائق تقريبا حتى يستعيد الحيوان وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
6. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
- ثبت الجسم الرحيم (قم بإجراء القتل الرحيم كما في الخطوة 1.1.3) على الطاولة باستخدام الأشرطة الجراحية المقطوعة ، واستأصل القلوب ، واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ، واغمر القلب في 4٪ بارافورمالدهايد / برنامج تلفزيوني.
- قم بتشريح القلوب إلى ثلاثة أقسام ، واغمرها في 40٪ سكروز للحماية من التبريد ، وقم بتضمينها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، وقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية.
- قم بتوصيل الأنسجة المقطعة بالتبريد (سمك 8 ميكرومتر) بالشرائح الزجاجية المطلية بالأمينوسيلان. بعد التجفيف الكافي باستخدام الرياح غير الدافئة الناتجة عن مجفف الشعر العام ، اغمر الشرائح الزجاجية في محلول ملحي مخزن يحتوي على 0.2٪ Tween-20 (TBS-T).
- اغمرها في محلول مانع لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية. صب 100 ميكرولتر من محلول الحجب الأساسي المحتوي على الأجسام المضادة على الشريحة ، واحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع ختم البارافين للحفاظ على انتشار محلول الجسم المضاد على الأنسجة.
ملاحظة: يظهر تركيز الجسم المضاد في جدول المواد. - ضع الشرائح أفقيا في صندوق عالي الرطوبة مصنوع يدويا باستخدام البخار الطبيعي من الورق المبلل لمنع التبخر. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام TBS-T.
- تعامل مع عامل مانع ثانوي يحتوي على الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية بنفس طريقة الجسم المضاد الأساسي. بعد ثلاث غسلات ، راقب إشارات التألق باستخدام مجهر مضان ومجهر ليزر متحد البؤر.
ملاحظة: يظهر تركيز الجسم المضاد في جدول المواد. - التحليل الإحصائي: لمقارنة حجم الخلية ، كما هو موضح في الشكل 3 أ ، قم بإجراء اختبار t غير مقترن ؛ لتقييم التعافي الوظيفي للقلب بعد إعطاء خلايا عضلة القلب باستخدام طريقة الحقن البطيء ، كما هو موضح في الشكل 4 أ ، استخدم اختبار t المزدوج. في هذا العمل ، اعتبرت الاختلافات ذات دلالة إحصائية عند P < .01. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري.
Representative Results
آثار الحقن البطيء على بقاء الخلايا وترسب الكولاجين
تم حقن كرات عضلة القلب للفئران حديثي الولادة الموسومة ب PKH26 في عضلة القلب العادية للفئران العارية باستخدام طريقة الحقن العادية أو البطيئة. أظهرت النتائج أن طريقة الحقن البطيئة زادت بشكل كبير من حجم الخلايا المطعمة (الشكل 3 أ) وخفضت بشكل كبير ترسب الكولاجين من النوع الأول في الموقع (الشكل 3 ب).
آثار الحقن البطيء على فعالية العلاج في نموذج احتشاء الفئران
تم استخدام طريقة الحقن البطيء الموجه بتخطيط صدى القلب لحقن كرات خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة أو PBS (-) في القلوب المحتشدة للفئران النموذجية. أظهرت المجموعة المحقونة بالخلايا وحدها تحسنا كبيرا في وظيفة تقلص القلب بعد شهرين (الشكل 4 أ). كشفت التحليلات الكيميائية النسيجية المناعية عن وجود اتصال سلس بين الخلايا المطعمة والخلايا العضلية المضيفة عبر أقراص مقحمة تحتوي على تقاطعات فجوة (الشكل 4 ب).
الشكل 1: رسم تخطيطي لنظام الحقن بأكمله . (أ) جهاز الحقن الرئيسي. (ب) نظام تبريد المحاقن بالحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الحقن البطيء عن طريق الجلد الموجه بتخطيط صدى القلب . (أ) إعداد الحيوان ومسبار الصدى وجهاز الحقن. ب: تصوير صدى القلب للمحقنة المحقنة والقلب المحقون. لاحظ أن الصورتين اليسرى واليمنى متماثلتان ، ولكن تمت إضافة خط أصفر للإشارة إلى موضع الإبرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تأثير طريقة الحقن البطيء على حجم الخلية المطعمة وترسب الكولاجين. (أ) حسبت أحجام الخلايا المطعمة (N = 3) من مقاطع تسلسلية. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية. * P < 0.01 في اختبار t غير المقترن. ب: التلوين المناعي الكيميائي للكولاجين من النوع الأول. يشير شريط المقياس إلى 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحسينات في وظائف القلب والتكامل النسيجي مع كرات الخلايا العضلية القلبية المطعمة بطريقة الحقن البطيء . (أ) طرق عرض تمثيلية لمخطط صدى القلب M. يوضح الرسم البياني انتقال تقصير الكسور في المجموعة المزروعة بالكرة القلبية (خط أحمر متصل; N = 4) ومجموعة السيارة (محلول تعليق الخلية لطريقة الحقن البطيء) (الخط الأزرق المنقط ؛ ن = 3). الاختصارات: MI = احتشاء عضلة القلب. Cx43 = كونيكسين 43 ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ PKH26 = ملصق غشاء الخلية الفلورية الأحمر. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية. * P < 0.01 في اختبار t المقترن. ب: التحليلات الكيميائية الهيستولوجية المناعية للعلاقة بين كرات الخلايا العضلية القلبية المطعمة والخلايا العضلية القلبية المضيفة. يتم عرض الملاحظات المجهرية الليزرية التقليدية باستخدام عدسة موضوعية 2x في العمود الأيسر. يتم عرض الإصدارات المكبرة (باستخدام عدسة موضوعية 20x) لمنطقتين موضتين في المربع ، معنونة ب * و # ، أدناه. أشرطة المقياس: الصورة العلوية = 300 ميكرومتر ؛ * و # = 30 ميكرومتر. يتم عرض الصور المجهرية بالليزر متحدة البؤر باستخدام عدسة موضوعية 20x جنبا إلى جنب مع comaparison. يتم عرض ثلاثة مواضع. في الصور المدمجة ، تشير رؤوس الأسهم إلى وجود تقاطعات فجوة (Cx43) تربط مباشرة بين الكسب غير المشروع وخلايا عضلة القلب المضيفة. يشير شريط المقياس إلى 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيديو التكميلي 1: طريقة الحقن البطيء الموجه بالصدى. يظهر مخطط صدى القلب في الوضع B في المنظر الأمامي طرف إبرة الحقن متقدما في عضلة القلب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
تتمثل إحدى النقاط الحرجة في الأداء الناجح لطريقة الحقن البطيء في إعداد نظام حقن فعال باستخدام مضخة حقنة قوية وأنبوب نقل ضغط قوي. مطلوب نظام ضغط عالي لدفع الجل من طرف إبرة دقيقة. النقطة الحرجة الثانية هي استقرار القلب. يمكن أن يؤدي نبض القلب ضد إبرة الحقن المتقدمة في عضلة القلب إلى إصابة الأنسجة. في هذه الدراسة ، تم إجراء حقن موجه بالصدى لتجنب تعرض الحيوانات لإصابة ثانية في الصدر المفتوح ولإدارة حقن الخلايا في قلب مستقر مع تضخم الرئتين. علاوة على ذلك ، في بعض التطبيقات للحيوانات الكبيرة أو البشر ، يجب اعتبار بعض أجهزة الحقن المتصلة بالقلب جزءا من التصميم الاستراتيجي للتطبيق. لحقن الصدر المفتوح في قلوب الحيوانات الصغيرة ، يوصى باستخدام إبرة طويلة ومرنة نظرا لارتفاع معدل ضربات القلب.
في هذا العمل ، زادت طريقة الحقن البطيئة بشكل كبير من حجم خلايا عضلة القلب الباقية مقارنة بطريقة الحقن العادية. الحقن الطبيعي يسبب تلف الخلايا عن طريق إجهاد القص15. في المقابل ، لا تسبب طريقة الحقن البطيء مثل هذا الإجهاد نظريا لأنها تستخدم محلولا غير نيوتوني بالإضافة إلى الحقن البطيء.
من حيث التليف الموضعي ، أظهر الفضاء الخلالي حول خلايا عضلة القلب الباقية على قيد الحياة التي يتم حقنها بشكل طبيعي ترسبا قويا وواسع النطاق للكولاجين من النوع الأول. في المقابل ، كانت إشارات الكولاجين من النوع الأول حول خلايا عضلة القلب المطعمة باستخدام طريقة الحقن البطيء أضعف بكثير وأكثر محدودية. هذا يشير إلى أن طريقة الحقن البطيئة تسببت في ضرر أقل بكثير. أدى الحقن البطيء لخلايا عضلة القلب الوليدية في عضلة القلب البالغة إلى تحسن كبير في وظيفة انقباض القلب المحتشى. أشارت التحليلات النسيجية إلى أن تطعيم الخلايا العضلية القلبية باستخدام طريقة الحقن البطيء أدى إلى اتصالات مباشرة واقتران وظيفي مع خلايا عضلة القلب المضيفة. تشرح هذه الظاهرة آلية الانتعاش الوظيفي لعضلة القلب المضيفة. على حد علمنا ، هذا هو التقرير الأول لخلايا عضلة القلب لحديثي الولادة المطعمة مع اتصالات سلسة واسعة النطاق بخلايا عضلة القلب البالغة المضيفة. قد تؤدي الوصلات الوظيفية مع عضلة القلب المضيفة عبر الاقتران الكهربائي والميكانيكي إلى نضج خلايا عضلة القلب المطعمة والسماح لها بالعمل كخلايا عضلية وظيفية تساهم في وظيفة القلب المضيف. تعد تفاعلات القوة البدنية طويلة المدى بين المضيف وخلايا عضلة القلب الكسب غير المشروع ضرورية للنضج الكامل. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى 2 أشهر بعد الحقن لاستعادة وظيفية للقلب احتشاء. قد يكون التعافي المعتمد على الوقت لوظيفة قلب المريض ظاهرة متوقعة في التطبيقات العلاجية ، ويمكن أن يكون هذا سمة مميزة للنجاح في إنشاء اقتران وظيفي جديد والتكامل بين المضيف وخلايا عضلة القلب المطعمة.
يمكن إجراء طريقة الحقن البطيء أثناء جراحة الصدر المفتوح. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الفئران. بالنسبة للتطبيقات المستقبلية في العلاج البشري ، ما زلنا بحاجة إلى حل العديد من المشكلات. يجب تحسين سرعة الحقن من خلال النظر في سعة المخزن المؤقت لتدفق السائل الخلالي في كل عضو مستهدف بشري. يجب استخدام مواد خالية من Xeno ، مثل الجيلاتين البشري أو المواد الاصطناعية القابلة للتحلل. يجب تطوير جهاز الحقن البطيء من الدرجة السريرية GMP ، مثل الأدوات المدمجة التي يمكن التخلص منها الخاصة بالأعضاء أو جهاز قابل لإعادة الاستخدام قابل لإعادة الاستخدام.
Disclosures
ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة بمنحة من JSPS KAKENHI (المنحة رقم 23390072 و 19K07335) و AMED (المنحة رقم A-149).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
| 29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
| A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
| Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
| alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
| Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
| Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
| blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
| collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
| confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
| fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
| fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
| fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
| gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
| Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
| non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
| peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
| syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
| syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
| tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
| trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
| Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
| veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
| Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |
References
- Chavkin, N. W., et al. The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation. Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904 (2021).
- Li, H., et al. The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-κB signaling to control kidney fibrosis. Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).
- Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. The role of monocytes in optic nerve injury. Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).
- Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473 (2023).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Hattori, F., Fukuda, K. Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols. Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).
- Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).
- Fernandes, S., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Wendel, J. S., et al. Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model. Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).
- Hattori, F. Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).
- Tao, S., et al. Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance. JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).
- Hattori, F. How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes. Cardiac Regeneration using Stem Cells. Fukuda, K., Yuasa, S. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).
