이 방법은 세포 현탁액에 의해 야기된 세포 주입 도중 어떤 중요한 침습도 삭제한다.
세포를 조직에 직접 주입하는 것은 세포 투여 및/또는 대체 요법에 필요한 과정입니다. 세포 주입은 세포가 조직에 들어갈 수 있도록 충분한 양의 현탁액이 필요합니다. 현탁액의 부피는 조직에 영향을 미치며, 이는 세포 주입의 결과로 심각한 침습성 부상을 유발할 수 있습니다. 이 논문은 이러한 손상을 피하는 것을 목표로 하는 느린 주입이라고 하는 새로운 세포 주입 방법에 대해 보고합니다. 그러나 바늘 끝에서 세포를 밀어내려면 뉴턴의 전단력 법칙에 따라 충분히 높은 주입 속도가 필요합니다. 위의 모순을 해결하기 위해, 젤라틴 용액과 같은 비뉴턴 유체가 이 연구에서 세포 현탁액으로 사용되었습니다. 젤라틴 용액은 약 20°C에서 겔에서 졸로 형태가 변하기 때문에 온도에 민감합니다. 그러므로, 세포 현탁액을 겔 형태로 유지하기 위해, 주사기는 이 프로토콜에서 냉각된 상태로 유지되었다; 그러나 용액이 몸에 주입되면 체온이 졸로 변환되었습니다. 간질 조직액 흐름은 과도한 용액을 흡수할 수 있습니다. 이 연구에서 느린 주입 기술을 통해 심근 구슬이 숙주 심근으로 들어가 주변 섬유화 없이 생착할 수 있었습니다. 이 연구는 성인 쥐 심장의 심근 경색의 원격 영역에 정제되고 공 모양의 신생아 쥐 심근 세포를 주입하기 위해 느린 주입 방법을 사용했습니다. 주사 후 2개월이 지났을 때, 이식된 그룹의 심장은 수축 기능이 현저하게 개선되었습니다. 또한, 천천히 주입된 심장의 조직학적 분석은 간극 연접 연결을 포함하는 삽입 디스크를 통해 숙주와 이식편 심근세포 사이의 원활한 연결을 보여주었습니다. 이 방법은 특히 심장 재생 의학에서 차세대 세포 치료에 기여할 수 있습니다.
세포 투여 및 교체는 심하게 손상된 장기에 대한 유망한 새로운 치료 전략입니다. 이러한 새로운 치료 전략 중 심장 재생 의학은 상당한 관심을 끌고 있습니다. 그러나 부상으로 인한 염증은 여러 장기에 흉터 형성을 매개한다 1,2,3,4. 인간의 심장은 약 1010 개의 심근 세포로 구성되어 있습니다. 그러므로, 이론적으로5,6, 그것은 109 심근 세포로 치료되어야한다. 전통적인 주사 방법을 통해 많은 수의 심근세포를 투여하면 심각한 조직 손상이 발생할 수 있다7. 이 방법은 조직 침습을 최소화한 새로운 세포 주입 방법을 제공합니다.
장기 실질에 세포를 투여하려면 주사가 필요합니다. 그러나 주사 자체가 조직 손상으로 이어질 수 있다는 점에서 불일치가 존재합니다. 조직 손상은 장기와 조직에 국소 염증과 불치의 흉터를 유발하고 재생 능력을 손상시킵니다 8,9,10. 포유류의 심장은 재생되지 않고 흉터가 생기는 경향이 매우 높은데, 이는 지속적인 펌핑 기능으로 인한 고혈압을 견디기 위해서는 즉각적인 부상 복구가 필요하기 때문이다11. 절제요법은 이러한 높은 흉터 형성 경향을 이용하여 부정맥을 이용하여 흉터 형성이 일어날 수 있는 회로를 차단한다12. 이전 연구에서는 흉터 조직이 숙주 심근에서 주입된 심근세포를 분리하는 것이 관찰되었습니다. 따라서 이는 심장 재생 의학에서 향상된 치료 효능을 얻기 위해 극복해야 할 다음 표적 문제를 나타냅니다.
조직 간질액 흐름은 세포에 산소와 영양분을 전달하고 세포에서 배설된 노폐물을 제거하는 데 중요한 역할을 합니다. 각 조직/장기에서 간질액 흐름의 생리학적 속도는 다릅니다(범위는 0.01-10μm/s)13. 저자가 아는 한, 병리학적 부종 없이 여분의 체액을 지탱할 수 있는 개별 조직/기관의 능력에 관한 데이터는 없습니다. 그러나 이 실험은 조직 손상을 줄이기 위해 느린 주입 속도를 사용하려고 시도하며 결과는 이 개념의 실용성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
저속 주입 방법의 성공적인 수행을 위한 중요한 점 중 하나는 강력한 주사기 펌프와 강력한 압력 전달 튜브를 사용하여 효과적인 주입 시스템을 준비하는 것입니다. 가는 바늘 끝에서 젤을 밀어내려면 고압 시스템이 필요합니다. 두 번째 임계점은 심장의 안정화입니다. 심근으로 들어간 주사 바늘에 심장이 박동하면 조직이 손상될 수 있습니다. 이 연구에서는 동물이 두 번째 열린 흉부 손상을 입는 것을 피하고 폐가 팽창된 안정된 심장에 세포 주사를 투여하기 위해 에코 유도 주사를 수행했습니다. 더욱이, 더 큰 동물이나 인간을 위한 일부 응용 분야에서는 심장에 부착된 일부 주입 장치가 응용 프로그램의 전략적 설계의 일부로 고려되어야 합니다. 작은 동물의 심장에 흉부 주사를 놓으려면 심장 박동수가 높기 때문에 길고 유연한 바늘을 사용하는 것이 좋습니다.
본 연구에서 느린 주입 방식은 일반 주입 방법에 비해 생존 심근 세포의 부피를 크게 증가시켰다. 정상적인 주입은 전단 응력15를 통해 세포 손상을 일으킨다. 이에 반해, 느린 주입 방법은 느린 주입 외에 비뉴턴 해를 사용하기 때문에 이론적으로 이러한 응력을 유발하지 않습니다.
국소 섬유증의 관점에서, 정상적으로 주입된 생존 심근세포 주변의 간질 공간은 강하고 광범위한 I형 콜라겐 침착을 보여주었습니다. 대조적으로, 느린 주입 방법을 사용하여 이식된 생착된 심근세포 주변의 I형 콜라겐 신호는 훨씬 약하고 제한적이었습니다. 이것은 느린 주입 방법이 손상을 훨씬 적게 일으켰다는 것을 시사합니다. 신생아 심근세포를 성인 심근에 천천히 주입하면 경색된 심장의 수축 기능이 크게 개선되었습니다. 조직학적 분석 결과, 느린 주입 방법을 사용하여 심근세포를 이식하면 숙주 심근세포와 직접 연결되고 기능적으로 결합되는 것으로 나타났습니다. 이 현상은 숙주 심근의 기능적 회복 메커니즘을 설명합니다. 우리가 아는 한, 이것은 숙주 성인 심근세포에 대규모로 이음새가 없는 연결을 가진 생착된 신생아 심근세포에 대한 첫 번째 보고입니다. 전기적 및 기계적 결합을 통한 숙주 심근과의 기능적 연결은 생착된 심근세포를 성숙하게 만들고 숙주 심장 기능에 기여하는 기능적 근세포로 작용할 수 있도록 합니다. 숙주와 이식편 심근세포 사이의 장기적인 물리적 힘 상호 작용은 완전한 성숙에 매우 중요합니다. 따라서 주사 후 경색된 심장의 기능적 회복을 위해 2개월이 필요할 수 있습니다. 환자의 심장 기능의 시간 의존적 회복은 치료 응용 분야에서 예상되는 현상일 수 있으며, 이는 숙주와 이식된 심근세포 간의 새로운 기능 결합 및 통합의 성공적인 확립의 특징이 될 수 있습니다.
느린 주입 방법은 개흉 수술 중에 시행 할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 마우스에도 적용될 수 있다. 인간 치료에 대한 향후 적용을 위해서는 여전히 몇 가지 문제를 해결해야 합니다. 주입 속도는 각 인간 표적 장기에서 간질액 흐름의 완충 용량을 고려하여 최적화되어야 합니다. 인간 젤라틴이나 생분해성 합성 물질과 같은 Xeno-free 물질을 적용해야 합니다. 소형 장기 특이적 일회용 도구 또는 재사용 가능한 광역 장기 적용 장치와 같은 임상 GMP 등급의 느린 주사 장치를 개발해야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 JSPS KAKENHI(보조금 번호 23390072 및 19K07335) 및 AMED(보조금 번호 A-149)의 보조금으로 지원되었습니다.
18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |