Summary
이 방법은 세포 현탁액에 의해 야기된 세포 주입 도중 어떤 중요한 침습도 삭제한다.
Abstract
세포를 조직에 직접 주입하는 것은 세포 투여 및/또는 대체 요법에 필요한 과정입니다. 세포 주입은 세포가 조직에 들어갈 수 있도록 충분한 양의 현탁액이 필요합니다. 현탁액의 부피는 조직에 영향을 미치며, 이는 세포 주입의 결과로 심각한 침습성 부상을 유발할 수 있습니다. 이 논문은 이러한 손상을 피하는 것을 목표로 하는 느린 주입이라고 하는 새로운 세포 주입 방법에 대해 보고합니다. 그러나 바늘 끝에서 세포를 밀어내려면 뉴턴의 전단력 법칙에 따라 충분히 높은 주입 속도가 필요합니다. 위의 모순을 해결하기 위해, 젤라틴 용액과 같은 비뉴턴 유체가 이 연구에서 세포 현탁액으로 사용되었습니다. 젤라틴 용액은 약 20°C에서 겔에서 졸로 형태가 변하기 때문에 온도에 민감합니다. 그러므로, 세포 현탁액을 겔 형태로 유지하기 위해, 주사기는 이 프로토콜에서 냉각된 상태로 유지되었다; 그러나 용액이 몸에 주입되면 체온이 졸로 변환되었습니다. 간질 조직액 흐름은 과도한 용액을 흡수할 수 있습니다. 이 연구에서 느린 주입 기술을 통해 심근 구슬이 숙주 심근으로 들어가 주변 섬유화 없이 생착할 수 있었습니다. 이 연구는 성인 쥐 심장의 심근 경색의 원격 영역에 정제되고 공 모양의 신생아 쥐 심근 세포를 주입하기 위해 느린 주입 방법을 사용했습니다. 주사 후 2개월이 지났을 때, 이식된 그룹의 심장은 수축 기능이 현저하게 개선되었습니다. 또한, 천천히 주입된 심장의 조직학적 분석은 간극 연접 연결을 포함하는 삽입 디스크를 통해 숙주와 이식편 심근세포 사이의 원활한 연결을 보여주었습니다. 이 방법은 특히 심장 재생 의학에서 차세대 세포 치료에 기여할 수 있습니다.
Introduction
세포 투여 및 교체는 심하게 손상된 장기에 대한 유망한 새로운 치료 전략입니다. 이러한 새로운 치료 전략 중 심장 재생 의학은 상당한 관심을 끌고 있습니다. 그러나 부상으로 인한 염증은 여러 장기에 흉터 형성을 매개한다 1,2,3,4. 인간의 심장은 약 1010 개의 심근 세포로 구성되어 있습니다. 그러므로, 이론적으로5,6, 그것은 109 심근 세포로 치료되어야한다. 전통적인 주사 방법을 통해 많은 수의 심근세포를 투여하면 심각한 조직 손상이 발생할 수 있다7. 이 방법은 조직 침습을 최소화한 새로운 세포 주입 방법을 제공합니다.
장기 실질에 세포를 투여하려면 주사가 필요합니다. 그러나 주사 자체가 조직 손상으로 이어질 수 있다는 점에서 불일치가 존재합니다. 조직 손상은 장기와 조직에 국소 염증과 불치의 흉터를 유발하고 재생 능력을 손상시킵니다 8,9,10. 포유류의 심장은 재생되지 않고 흉터가 생기는 경향이 매우 높은데, 이는 지속적인 펌핑 기능으로 인한 고혈압을 견디기 위해서는 즉각적인 부상 복구가 필요하기 때문이다11. 절제요법은 이러한 높은 흉터 형성 경향을 이용하여 부정맥을 이용하여 흉터 형성이 일어날 수 있는 회로를 차단한다12. 이전 연구에서는 흉터 조직이 숙주 심근에서 주입된 심근세포를 분리하는 것이 관찰되었습니다. 따라서 이는 심장 재생 의학에서 향상된 치료 효능을 얻기 위해 극복해야 할 다음 표적 문제를 나타냅니다.
조직 간질액 흐름은 세포에 산소와 영양분을 전달하고 세포에서 배설된 노폐물을 제거하는 데 중요한 역할을 합니다. 각 조직/장기에서 간질액 흐름의 생리학적 속도는 다릅니다(범위는 0.01-10μm/s)13. 저자가 아는 한, 병리학적 부종 없이 여분의 체액을 지탱할 수 있는 개별 조직/기관의 능력에 관한 데이터는 없습니다. 그러나 이 실험은 조직 손상을 줄이기 위해 느린 주입 속도를 사용하려고 시도하며 결과는 이 개념의 실용성을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
동물실험은 간사이의과대학의 동물실험 윤리 가이드라인에 따라 실시되어 윤리위원회의 승인을 받았다(승인번호 23-104). 모든 동물은 병원균이 없는 특정 환경에서 일정한 명암 주기로 사육되었습니다. 가위, 집게, 견인기 등 멸균된 수술 도구는 모두 고압멸균 처리하여 완전히 건조시켰습니다.
1. 신생아 쥐 심근 세포 공의 준비
- 신생아 쥐 심장 수집
- 심장 채취의 경우, 이전 보고서7에서 설명한 것과 유사한 절차를 따른다.
- 신생아(생후 0-2일) Sprague-Dawley(SD) 쥐를 포비돈-요오드와 70% 에탄올 용액에 순차적으로 담근 다음 심층 마취를 위해 기화된 이소플루란(농도가 10% v/v 이상이어야 함)으로 채워진 밀폐 케이스에 옮깁니다.
- 운동 활동 상실로 의식 불명을 확인한 후 손으로 등을 잡고 있는 쥐의 목을 베고 흉곽 전방 중앙에서 꼬리까지 2-4mm의 조직을 자른 다음 날카로운 가위를 사용하여 방향으로 자릅니다.
- 뒤쪽 피부를 잡고 상처를 당겨 열고 흉곽에서 심장을 밀어냅니다. 가위를 사용하여 심실을 자르고 칼슘이나 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수(PBS)(PBS(-))에 담그십시오.
- 신생아 쥐 심근세포의 분산
- 소량의 Ads 완충액(Ads 완충액: 116mM NaCl, 20mM HEPES, 12.5mM NaH2PO4, 5.6mM 포도당, 5.4mM KCl, 0.8mM MgSO4, pH 7.35)에 분산된 수집된 심실을 곡선형 가위를 사용하여 작은 조각(1mm x 1mm)으로 자동 멸균한 오목한 유리 용기에 다집니다.
- 다진 조직과 미세자성 교반기를 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 조직을 30분 동안 교반하여 37°C의 광고 완충액에 0.1% 콜라겐분해효소, 0.1% 트립신, 20μg/mL DNase I 및 50nM 테트라메틸로다민 메틸 에스테르가 있는 단일 세포로 분산시킵니다.
- 자연 침전을 통해 응집체와 분산된 세포를 분리하고, 분산된 세포만 튜브에 모으고, 잔류 세포 응집체를 동일한 분해 배지로 다시 분해합니다.
- 모든 셀이 완전히 분리될 때까지 이 절차를 계속합니다. 세포의 완전한 분산을 확인하려면 현미경(4x 대물 렌즈)으로 튜브를 관찰합니다.
- 150 x g 에서 5분 동안 원심분리를 사용하여 분산된 세포를 수집하고 1-2mL의 Ads 완충액에서 해리합니다.
- 심근세포의 형광 활성화 세포 분류
- 적색 형광 신호를 검출하기 위해 556-601nm 대역통과 필터를 사용하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 세포를 분석합니다.
- 이중항 분수를 제거하기 위해 사전 게이팅을 신중하게 수행한다14. 이중선 제거를 위한 게이트 설정은 제조업체의 지침에 따라야 합니다.
- x축에 전방 산란을 설정하고 y축에 빨간색 형광 신호를 설정합니다. 3개의 집단이 관찰되었는데, 적혈구와 죽은 세포를 포함하는 최하위 집단, 섬유아세포와 내피세포를 포함한 비심근세포를 포함하는 중간 집단, 순수 심실심근세포를 포함하는 상위 집단이 관찰되었다7.
- 적색 형광 표지 심근 세포 볼의 준비
- 심근세포를 선택적으로 분류하고 150 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 알파 변형 최소 필수 배지(alpha-MEM) 1mL에 세포 펠릿을 완전히 용해시킵니다.
- 혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정하고 alpha-MEM 10% FBS를 사용하여 세포 현탁액을 3,000세포/mL로 희석합니다.
- 세포 비접착성 96웰 플레이트(웰당 100μL)에 분배하고, 100 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 37°C에서 5%CO2 가 있는 세포 배양 인큐베이터에서 2-3 d로 배양합니다.
- 주입 실험 전에 1,000μL 피펫을 사용하여 배양 배지로 흡인을 통해 각 웰에서 심근 세포 볼을 수확하고 15mL 튜브에 수집합니다.
- 생착 후 추적에 대한 제조업체의 지침에 따라 PKH26으로 염색합니다.
2. 느린 주입 방법의 준비
- 젤라틴 원액의 제조
- 젤라틴의 무게를 측정하고 Ads 버퍼에 용해시켜 10% w/v 용액을 생성하고 고압멸균합니다.
- 세포 주입 장치 생산
- 전체 장치 설계: 그림 1에 표시된 장치를 준비합니다. 이 시스템은 주사기 냉각 장치 및 주 주입 장치와 결합됩니다.
- 아래에 설명된 주 주입 장치를 준비합니다.
- 신생아 심근 세포 볼 주사는 주사기가 장착된 29G, 50mm 길이의 바늘을 사용합니다.
- 세포 주입 주사기를 사용하여 동력 전달 주사기(18G, 1mL)를 연달아 연결합니다(그림 1). 동력 전달 주사기의 바늘을 루멘 팽창성이 낮은 얇은 폴리프로필렌 튜브에 연결합니다.
- 그런 다음 동력 전달 튜브의 다른 쪽을 동일한 주사기 (18G, 1mL)의 바늘에 연결하고 주사기 펌프에 넣습니다. 두 개의 동력 전달 주사기와 튜브에 기포가 없는 물을 채웁니다.
알림: 동력 전달 주사기의 한 플런저를 밀어 넣으면 압력이 다른 주사기로 직접 전달되고 플런저가 돌출됩니다.
- 아래 설명에 따라 주입 주사기 냉각 시스템을 설정합니다.
- 구리 튜브(외경 = 1mm, 내경 = 0.3mm, 두께 = 0.35mm)를 셀 주입 주사기의 셀 함유 부분에 단단히 감고 양쪽 끝에 10mm의 여분의 파이프를 남깁니다.
- 구리 튜브를 유연한 플라스틱 튜브에 연결합니다. 또한 플라스틱 튜브의 다른 쪽 끝을 외부 펌프에 연결하고, 냉각수로 라인을 채우고, 여분의 구리 튜브를 분쇄된 얼음에 담가 물을 냉각합니다(그림 1).
알림: 이 냉각 시스템은 실린더의 셀 현탁액을 약 2°C로 유지합니다.
3. 둔한 관상동맥 폐색에 의한 쥐 심근경색 모델 개발
- 수컷 면역 결핍 누드 쥐(F344/Njcl-rnu/rnu)를 3% 이소플루란이 포함된 공기로 마취합니다. 캐뉼라를 기관에 삽입하고 호흡기에 연결합니다.
- 캐뉼라를 컨트롤러가 있는 이소플루란 기화기에 연결하여 3% 이소플루란 농도를 유지하여 충분한 마취를 유지합니다. 통증 자극에 반응이 없는지 확인합니다. 건조함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
- 40°C로 데운 수술용 플레이트에 절단된 수술용 테이프로 팔다리를 고정합니다. 쥐의 몸을 몸축의 오른쪽으로 비틀어 왼쪽 겨드랑이를 수술 부위로 사용합니다.
- 제모 크림을 사용하여 수술 부위의 머리카락을 제거하고 포비돈 요오드로 피부를 닦습니다. 날카로운 가위를 사용하여 피부와 대흉근을 1.5cm 절개합니다.
- 세 번째 늑간 공간을 확인하고 끝이 뭉툭한 마이크로 집게를 사용하여 늑간 근육과 늑골 흉막을 찢습니다. 견인기를 사용하여 가슴을 열어 두십시오. 집게로 얇은 심낭을 부드럽게 제거합니다.
- 심장 측벽의 경색 모형을 구성하기 위해서는 좌심방 끝에서 꼬리 1mm의 위치를 찾아 둔한 관상동맥을 식별하고, 7-0 실크 봉합사를 통과시키고, 등쪽에서 복부까지 폭 2.5mm, 깊이 2.5mm의 조직을 퍼내고 조직을 단단히 결찰합니다.
- 합자에서 원위부의 약한 수축으로 성공적인 결찰을 확인합니다. 견인기를 부드럽게 제거한 후 두 번째와 네 번째 늑간 공간 사이에 5-0 실크 봉합사를 놓고 개흉술을 닫습니다.
- 이소플루란 농도를 1%로 낮춥니다. 근육과 피부를 5-0 실크로 부드럽게 봉합합니다. 이소플루란 농도를 0%로 낮추고 자발적 호흡이 시작될 때까지 약 5분 동안 기다립니다.
- 식염수에 리도카인 2mg/mL를 절개 부위에 국소적으로 바릅니다. 피하 주사를 통해 식염수 1mL를 투여합니다. 감염을 예방하기 위해 수의사 연고를 국소적으로 바르십시오.
- 삽관 튜브에서 쥐를 제거하고 동물 케이지로 돌아갑니다. 그런 다음 쥐를 1주일 동안 개별 케이지에서 키웁니다.
- 심장 초음파를 사용하여 심장 수축기 펌프 기능의 변화를 분석합니다.
알림: 외측 심근 경색으로 인해 심장 기능이 저하됩니다.
4. 느린 주입 방법을 이용한 에코 유도 경피적 세포 이식
- 10% 젤라틴 스톡을 액체가 될 때까지 37°C에서 예열합니다.
- 10% 젤라틴 스톡을 미리 데워진 Ads 버퍼로 희석하여 최종 주사 가능한 5% w/v 젤라틴 용액을 얻습니다(동물당 100μL 필요).
- 96개의 심근구 볼(총 28,800마리/동물)을 100μL의 예열된 주사액에 매달습니다.
- 4.3단계에서 준비한 현탁액을 셀 주입 주사기에 로드하여 과도한 공기의 흡입을 피합니다.
- 주사기의 기포를 제거하려면 바늘을 위로 향하게 하여 주사기를 수직으로 잡고 주사기를 두드린 다음 주사기의 위쪽 융기에 기포를 모으십시오.
알림: 이 단계에서 심근 세포 볼이 플런저의 고무 씰에 점차적으로 가라앉는 것을 관찰하십시오. - 주사기의 수직 위치를 유지하고 플런저를 천천히 밀어 올린 다음 세포 현탁액의 20μL가 주사기에 남을 때까지 기포와 초과 세포 현탁액을 버립니다. 심근 세포 볼이 플런저의 고무 씰에 놓이도록 플런저를 일정한 속도로 조심스럽게 밉니다.
- 뚜껑이 있는 주사기를 얼음 욕조에 직접 5분 동안 담그십시오.
- 냉각된 주사기를 주입 장치에 넣습니다. X-Y-Z 위치 조절 가능한 수제 클램프를 사용하여 동물 단계의 미세한 이동 장치에 정착 된 주입 주사기 장치를 단단히 고정합니다. 미세 이동 장치는 x 방향 20mm 슬라이드, y 방향 스윙 및 z 방향 휨 동작을 사용하여 바늘 위치를 이동할 수 있습니다.
- 3% 이소플루란이 포함된 공기로 채워진 밀봉된 상자에 쥐를 마취합니다. 통증 자극에 대한 반응 없음으로 마취를 확인합니다. 건조함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
- 40°C로 데워진 에코 플레이트에 절단된 수술용 테이프로 팔다리를 고정합니다. 충분한 마취를 유지하려면 흡입된 공기에 약 3%의 이소플루란 농도가 포함되어 있는지 확인하십시오.
- 주입 부위 (직경 2cm)와 가슴의 털을 제모 크림으로 제거하고 포비돈 요오드로 피부를 닦습니다.
- 가슴과 에코 프로브에 에코 젤을 바릅니다. 두개골과 꼬리 축을 따라 에코 프로브를 흉부 가까이에 놓고 제조업체 설명서에 따라 B 모드 심초음파를 얻기 시작합니다.
- 주사 바늘의 끝을 정면에서 심근으로 전진시킵니다(그림 2 및 보충 비디오 1).
- 메인 시린지 펌프를 작동시키려면 시작 버튼을 누르고 다이얼을 돌려 약 0.02μL/s의 주입 속도에 대해 미리 결정된 숫자로 조정합니다. 감염을 예방하기 위해 침을 꿰뚫는 자세 주위에 수의사 연고를 국소적으로 바르십시오.
알림: 주입 용액을 사용하여 의도한 주입 속도에 적합한 다이얼 번호를 결정해야 합니다. 주입 후, 예시적인 운동 시스템을 사용하여 주사 바늘을 제거합니다. - 이소플루란 농도를 0%로 낮추고 동물이 흉골 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 약 5분 동안 기다립니다.
5. 심장 기능 평가
- 3% 이소플루란이 포함된 공기로 채워진 밀봉된 상자에 쥐를 마취합니다. 통증 자극에 대한 반응 없음으로 마취를 확인합니다. 건조함을 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 바르십시오.
- 팔다리 끝에 ECG 획득을 위해 짜릿 크림을 바릅니다. 40°C로 데워진 에코 플레이트에 절단된 수술용 테이프로 팔다리를 고정합니다. 생리학적 모니터링 시스템을 사용하여 실시간 ECG 및 심박수를 감지합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 먼저 유출관에 대한 좌심실 정점을 보여주는 B 모드 에코 이미지를 사용하여 장축 각도를 결정한 다음 에코 프로브를 90° 회전하여 단축 보기로 변경합니다.
- 동물 단계의 꼬리에서 주축으로의 미세 운동 시스템만 사용하여 단축 보기를 유두근 수준으로 조정합니다. 그런 다음 M 모드 버튼을 눌러 이미지 모드를 M 모드로 변경하고 Cine-loop 버튼을 눌러 5초 동안 비디오를 녹화합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 분획 단축을 분석하고 계산하려면 측정 버튼과 수직선 도구를 눌러 수축기 말기 및 이완기 말기 좌심실 내부 치수를 정의합니다. 소프트웨어는 FS(Percent Fraction Shortening)를 자동으로 계산합니다.
- 이소플루란 농도를 0%로 낮추고 동물이 흉골 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 약 5분 동안 기다립니다.
6. 면역조직화학
- 절단된 수술용 테이프를 사용하여 안락사된 시신을 테이블 위에 고정하고(1.1.3단계와 같이 안락사 수행) 심장을 절제하고 PBS로 세척하고 심장을 4% 파라포름알데히드/PBS에 담그십시오.
- 심장을 세 부분으로 나누어 동결 방지를 위해 40% 자당에 담그고 최적의 절단 온도(OCT) 화합물에 담근 다음 -80°C에서 동결합니다.
- 동결 절개 조직(8μm 두께)을 아미노실란이 코팅된 유리 슬라이드에 부착합니다. 일반 헤어 드라이어에서 발생하는 비온풍을 사용하여 충분히 건조시킨 후 0.2% Tween-20(TBS-T)이 함유된 트리스 완충 식염수에 유리 슬라이드를 담그십시오.
- 25°C에서 30분 동안 차단 용액에 담그십시오. 1차 항체 함유 차단 용액 100μL를 슬라이드에 붓고 파라핀 밀봉으로 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 항체 용액이 조직에 퍼지도록 합니다.
참고: 항체 농도는 재료 표에 나와 있습니다. - 증발을 방지하기 위해 젖은 종이의 자연 증기를 사용하여 수제 고습도 상자에 슬라이드를 수평으로 놓습니다. TBS-T로 슬라이드를 세 번 세척합니다.
- 2차 항체 함유 차단제를 1차 항체와 동일한 방법으로 25°C에서 1시간 동안 치료합니다. 세 번 세척한 후 형광 현미경과 컨포칼 레이저 현미경을 사용하여 형광 신호를 관찰합니다.
참고: 항체 농도는 재료 표에 나와 있습니다. - 통계 분석: 그림 3A와 같이 세포 부피 비교를 위해 비쌍 t-검정을 수행합니다. 그림 4A와 같이 느린 주입 방법을 사용하여 심근세포 투여 후 심장 기능 회복을 평가하려면 쌍체 t-검정을 사용합니다. 이 연구에서 차이는 P < .01에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.
Representative Results
느린 주입이 세포 생존과 콜라겐 침착에 미치는 영향
PKH26으로 표지된 신생아 쥐 심근세포 볼을 정상 또는 느린 주입 방법을 사용하여 정상 누드 쥐 심근에 주입했습니다. 그 결과, 느린 주입 방법은 생착된 세포의 부피를 현저히 증가시키고(그림 3A), 현장 I형 콜라겐 침착을 현저히 감소시키는 것으로 나타났습니다(그림 3B).
쥐 경색 모델에서 느린 주입이 치료 효능에 미치는 영향
심초음파 유도 슬로우 주입 방법을 사용하여 신생아 쥐 심근 세포 볼 또는 PBS(-)를 모델 쥐의 경색 심장에 주입했습니다. 세포 주입 단독군은 2개월 후 심장 수축 기능이 크게 개선되었습니다(그림 4A). 면역조직화학적 분석은 간극 연접을 포함하는 삽입된 디스크를 통해 생착된 세포와 숙주 근세포 사이의 원활한 연결을 보여주었습니다(그림 4B).
그림 1: 전체 주입 시스템의 개략 도. (A) 주 주입 장치. (B) 주입 주사기 냉각 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 심장 초음파 유도 경피적 느린 주사 . (A) 동물, 에코 프로브 및 주입 장치의 설정. (B) 주사 주사기와 심장의 심장 초음파 보기. 왼쪽과 오른쪽 그림은 동일하지만 바늘 위치를 나타내기 위해 노란색 선이 추가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 느린 주입 방법이 생착된 세포 부피 및 콜라겐 침착에 미치는 영향. (A) 생착된 세포 부피(N=3)는 연속 절편으로부터 계산하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. *P< 비쌍체 t-검정에서 0.01입니다. (B) I형 콜라겐에 대한 면역조직화학적 염색. 눈금 막대는 200μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 심장 기능 개선 및 느린 주입 방법으로 생착된 심근세포 볼과의 조직학적 통합. (A) 대표적인 심초음파 M 모드 보기. 그래프는 심근세포 볼 이식 그룹에서 분획 단축의 전이를 보여줍니다(빨간색 실선; N=4) 및 비히클(저속주입법용 셀 현탁액) 그룹(청색 점선; N = 3)입니다. 약어: MI = 심근 경색; Cx43 = 커넥신 43; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; PKH26 = 적색 형광 세포막 라벨. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. *쌍 체 t-검정에서 P< 0.01입니다. (B) 생착된 심근세포 볼과 숙주 심근세포 사이의 관계에 대한 면역조직화학적 분석. 2x 대물 렌즈를 사용한 기존의 레이저 현미경 관찰은 왼쪽 열에 표시됩니다. 상자에 표시된 두 영역의 확대 버전(20x 대물 렌즈 사용)은 * 및 #으로 표시되어 있습니다. 축척 막대: 상단 이미지 = 300 μm; * 및 # = 30μm. 20x 대물 렌즈를 사용한 컨포칼 레이저 현미경 이미지가 comaparison을 위해 표시됩니다. 세 가지 위치가 표시됩니다. 병합된 이미지에서 화살촉은 이식편과 숙주 심근세포를 직접 연결하는 간극연접(Cx43)의 존재를 나타냅니다. 눈금 막대는 30μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1: 에코 유도 느린 주입 방법. 정면도의 B-모드 심초음파는 주사 바늘 끝이 심근으로 전진한 것을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
저속 주입 방법의 성공적인 수행을 위한 중요한 점 중 하나는 강력한 주사기 펌프와 강력한 압력 전달 튜브를 사용하여 효과적인 주입 시스템을 준비하는 것입니다. 가는 바늘 끝에서 젤을 밀어내려면 고압 시스템이 필요합니다. 두 번째 임계점은 심장의 안정화입니다. 심근으로 들어간 주사 바늘에 심장이 박동하면 조직이 손상될 수 있습니다. 이 연구에서는 동물이 두 번째 열린 흉부 손상을 입는 것을 피하고 폐가 팽창된 안정된 심장에 세포 주사를 투여하기 위해 에코 유도 주사를 수행했습니다. 더욱이, 더 큰 동물이나 인간을 위한 일부 응용 분야에서는 심장에 부착된 일부 주입 장치가 응용 프로그램의 전략적 설계의 일부로 고려되어야 합니다. 작은 동물의 심장에 흉부 주사를 놓으려면 심장 박동수가 높기 때문에 길고 유연한 바늘을 사용하는 것이 좋습니다.
본 연구에서 느린 주입 방식은 일반 주입 방법에 비해 생존 심근 세포의 부피를 크게 증가시켰다. 정상적인 주입은 전단 응력15를 통해 세포 손상을 일으킨다. 이에 반해, 느린 주입 방법은 느린 주입 외에 비뉴턴 해를 사용하기 때문에 이론적으로 이러한 응력을 유발하지 않습니다.
국소 섬유증의 관점에서, 정상적으로 주입된 생존 심근세포 주변의 간질 공간은 강하고 광범위한 I형 콜라겐 침착을 보여주었습니다. 대조적으로, 느린 주입 방법을 사용하여 이식된 생착된 심근세포 주변의 I형 콜라겐 신호는 훨씬 약하고 제한적이었습니다. 이것은 느린 주입 방법이 손상을 훨씬 적게 일으켰다는 것을 시사합니다. 신생아 심근세포를 성인 심근에 천천히 주입하면 경색된 심장의 수축 기능이 크게 개선되었습니다. 조직학적 분석 결과, 느린 주입 방법을 사용하여 심근세포를 이식하면 숙주 심근세포와 직접 연결되고 기능적으로 결합되는 것으로 나타났습니다. 이 현상은 숙주 심근의 기능적 회복 메커니즘을 설명합니다. 우리가 아는 한, 이것은 숙주 성인 심근세포에 대규모로 이음새가 없는 연결을 가진 생착된 신생아 심근세포에 대한 첫 번째 보고입니다. 전기적 및 기계적 결합을 통한 숙주 심근과의 기능적 연결은 생착된 심근세포를 성숙하게 만들고 숙주 심장 기능에 기여하는 기능적 근세포로 작용할 수 있도록 합니다. 숙주와 이식편 심근세포 사이의 장기적인 물리적 힘 상호 작용은 완전한 성숙에 매우 중요합니다. 따라서 주사 후 경색된 심장의 기능적 회복을 위해 2개월이 필요할 수 있습니다. 환자의 심장 기능의 시간 의존적 회복은 치료 응용 분야에서 예상되는 현상일 수 있으며, 이는 숙주와 이식된 심근세포 간의 새로운 기능 결합 및 통합의 성공적인 확립의 특징이 될 수 있습니다.
느린 주입 방법은 개흉 수술 중에 시행 할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 마우스에도 적용될 수 있다. 인간 치료에 대한 향후 적용을 위해서는 여전히 몇 가지 문제를 해결해야 합니다. 주입 속도는 각 인간 표적 장기에서 간질액 흐름의 완충 용량을 고려하여 최적화되어야 합니다. 인간 젤라틴이나 생분해성 합성 물질과 같은 Xeno-free 물질을 적용해야 합니다. 소형 장기 특이적 일회용 도구 또는 재사용 가능한 광역 장기 적용 장치와 같은 임상 GMP 등급의 느린 주사 장치를 개발해야 합니다.
Disclosures
저자는 밝힐 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 JSPS KAKENHI(보조금 번호 23390072 및 19K07335) 및 AMED(보조금 번호 A-149)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
| 29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
| A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
| Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
| alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
| Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
| Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
| blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
| collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
| confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
| fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
| fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
| fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
| gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
| Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
| non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
| peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
| syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
| syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
| tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
| trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
| Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
| veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
| Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |
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