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Bioengineering

न्यूनतम आक्रमण के साथ एक उपन्यास सेल इंजेक्शन विधि

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65260
Automatic Translation
1
1Innovative Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Kansai Medical University

Summary

यह विधि सेल निलंबन समाधान के कारण सेल इंजेक्शन के दौरान किसी भी बड़े आक्रमण को समाप्त करती है।

Abstract

कोशिकाओं को सीधे ऊतकों में इंजेक्ट करना सेल प्रशासन और / या प्रतिस्थापन चिकित्सा में एक आवश्यक प्रक्रिया है। कोशिका इंजेक्शन को कोशिकाओं को ऊतक में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त मात्रा में निलंबन समाधान की आवश्यकता होती है। निलंबन समाधान की मात्रा ऊतक को प्रभावित करती है, और इससे सेल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप बड़ी आक्रामक चोट लग सकती है। यह पेपर एक नई सेल इंजेक्शन विधि पर रिपोर्ट करता है, जिसे धीमा इंजेक्शन कहा जाता है, जिसका उद्देश्य इस चोट से बचना है। हालांकि, सुई की नोक से कोशिकाओं को बाहर धकेलने के लिए न्यूटन के कतरनी बल के नियम के अनुसार पर्याप्त रूप से उच्च इंजेक्शन गति की आवश्यकता होती है। उपरोक्त विरोधाभास को हल करने के लिए, एक गैर-न्यूटोनियन द्रव, जैसे जिलेटिन समाधान, इस काम में सेल निलंबन समाधान के रूप में उपयोग किया गया था। जिलेटिन समाधान में तापमान संवेदनशीलता होती है, क्योंकि उनका रूप लगभग 20 डिग्री सेल्सियस पर जेल से सोल में बदल जाता है। इसलिए, जेल के रूप में सेल निलंबन समाधान को बनाए रखने के लिए, सिरिंज को इस प्रोटोकॉल में ठंडा रखा गया था; हालांकि, एक बार जब घोल को शरीर में इंजेक्ट किया गया, तो शरीर का तापमान इसे सोल में परिवर्तित कर दिया। अंतरालीय ऊतक द्रव प्रवाह अतिरिक्त समाधान को अवशोषित कर सकता है। इस काम में, धीमी इंजेक्शन तकनीक ने कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों को मेजबान मायोकार्डियम में प्रवेश करने और आसपास के फाइब्रोसिस के बिना एनग्राफ्ट करने की अनुमति दी। इस अध्ययन ने वयस्क चूहे के दिल में मायोकार्डियल रोधगलन के एक दूरस्थ क्षेत्र में शुद्ध और बॉल-गठित नवजात चूहा कार्डियोमायोसाइट्स को इंजेक्ट करने के लिए एक धीमी इंजेक्शन विधि का उपयोग किया। इंजेक्शन के 2 महीने बाद, प्रत्यारोपित समूहों के दिल ने सिकुड़ा हुआ कार्य में काफी सुधार दिखाया। इसके अलावा, धीमी गति से इंजेक्शन वाले दिल के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने गैप जंक्शन कनेक्शन वाले इंटरकैलेटेड डिस्क के माध्यम से मेजबान और ग्राफ्ट कार्डियोमायोसाइट्स के बीच सहज कनेक्शन का खुलासा किया। यह विधि अगली पीढ़ी के सेल थेरेपी में योगदान कर सकती है, विशेष रूप से कार्डियक पुनर्योजी चिकित्सा में।

Introduction

सेल प्रशासन और प्रतिस्थापन भारी क्षतिग्रस्त अंगों के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों का वादा कर रहे हैं। इन नवीन चिकित्सीय रणनीतियों के बीच, कार्डियक पुनर्योजी चिकित्सा ने काफी ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, चोटों के कारण होने वाली सूजन कई अंगों में निशान गठन की मध्यस्थता करती है 1,2,3,4. मानव हृदय में लगभग 1010 कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं; इसलिए, सैद्धांतिक रूप से5,6, इसे 109 से अधिक कार्डियोमायोसाइट्स के साथ इलाज किया जाना चाहिए। पारंपरिक इंजेक्शन विधियों के माध्यम से बड़ी संख्या में कार्डियोमायोसाइट्स को प्रशासित करने से महत्वपूर्णऊतक चोटें हो सकती हैं। यह विधि न्यूनतम ऊतक आक्रमण के साथ एक नई सेल इंजेक्शन विधि प्रदान करती है।

अंग पैरेन्काइमा में कोशिका प्रशासन के लिए इंजेक्शन (ओं) की आवश्यकता होती है। हालांकि, एक विसंगति मौजूद है कि इंजेक्शन स्वयं ऊतक की चोट का कारण बन सकता है। ऊतक की चोट अंगों और ऊतकों में स्थानीय सूजन और लाइलाज निशान का कारण बनती है, साथ ही बिगड़ा हुआ पुनर्योजी क्षमता 8,9,10 है। स्तनधारी हृदय में पुन: उत्पन्न करने के बजाय निशान विकसित करने की एक अत्यंत उच्च प्रवृत्ति होती है क्योंकि इसके निरंतर पंपिंगफ़ंक्शन के कारण उच्च रक्तचाप को सहन करने के लिए तत्काल चोट की मरम्मत की आवश्यकता होती है। एब्लेशन थेरेपी निशान गठन की ओर इस उच्च प्रवृत्ति का उपयोग करती है और अतालता12 का उपयोग करके निशान गठन से गुजरने की संभावना वाले सर्किट को अवरुद्ध करती है। पिछले अध्ययन में, यह देखा गया था कि निशान ऊतक ने मेजबान मायोकार्डियम में इंजेक्ट कार्डियोमायोसाइट्स को अलग कर दिया था। इस प्रकार, यह अगले लक्ष्य मुद्दे का प्रतिनिधित्व करता है जिसे कार्डियक पुनर्योजी चिकित्सा में बेहतर चिकित्सीय प्रभावकारिता प्राप्त करने के लिए दूर करने की आवश्यकता है।

ऊतक अंतरालीय द्रव प्रवाह कोशिकाओं को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों को व्यक्त करने और कोशिकाओं से उत्सर्जित अपशिष्ट को हटाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। प्रत्येक ऊतक / अंग में अंतरालीय द्रव प्रवाह की शारीरिक गति अलग-अलग होती है (सीमा 0.01-10 μm / s) 13 है। लेखक के सर्वोत्तम ज्ञान के लिए, पैथोलॉजिकल एडिमा के बिना तरल पदार्थ की अतिरिक्त मात्रा का समर्थन करने के लिए व्यक्तिगत ऊतकों / अंगों की क्षमता के बारे में कोई डेटा नहीं है; हालांकि, यह प्रयोग संभवतः ऊतक की चोट को कम करने के लिए धीमी इंजेक्शन गति का उपयोग करने का प्रयास करता है, और परिणामों का उपयोग इस अवधारणा की व्यावहारिकता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

पशु प्रयोगों के लिए कंसाई-मेडिकल यूनिवर्सिटी नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार पशु प्रयोग आयोजित किए गए थे और नैतिक समितियों (अनुमोदन संख्या: 23-104) द्वारा अनुमोदित किए गए थे। सभी जानवरों को एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त वातावरण में एक निरंतर प्रकाश-अंधेरे चक्र के तहत उठाया गया था। सभी निष्फल शल्य चिकित्सा उपकरण, जैसे कैंची, फोर्स, और रिट्रैक्टर, आटोक्लेव और अच्छी तरह से सूख गए थे।

1. नवजात चूहे कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों की तैयारी

  1. नवजात चूहे के दिल का संग्रह।
    1. दिल के संग्रह के लिए, पिछली रिपोर्ट7 में वर्णित प्रक्रिया के समान एक प्रक्रिया का पालन करें।
    2. नवजात शिशु (जन्म के 0-2 दिन बाद) स्प्राग-डावले (एसडी) चूहों को पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल समाधानों में क्रमिक रूप से डुबोएं, और फिर उन्हें गहरे संज्ञाहरण के लिए वाष्पीकृत आइसोफ्लुरेन (एकाग्रता 10% वी / वी से अधिक होना चाहिए) से भरे एक एयर-टाइट केस में स्थानांतरित करें।
    3. लोकोमोटर गतिविधि के नुकसान से बेहोशी की पुष्टि के बाद, हाथ से शरीर को पीछे से पकड़ते हुए चूहे का सिर काट दें, और फिर 2-4 मिमी ऊतक को रिबकेज के ललाट केंद्र से पुच्छल तक और फिर तेज कैंची का उपयोग करके रोस्ट्राल दिशा में काट दें।
    4. कट को खोलने के लिए पीठ की त्वचा को पकड़ें और रिबकेज से दिल को बाहर निकालें। कैंची का उपयोग करके वेंट्रिकल को काटें और उन्हें कैल्शियम या मैग्नीशियम (पीबीएस (−)) के बिना फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में डुबोएं।
  2. नवजात चूहे कार्डियोमायोसाइट्स का फैलाव
    1. एकत्रित वेंट्रिकल्स को कम से कम मात्रा में विज्ञापन बफर (विज्ञापन बफर: 116 एमएम एनएसीएल, 20 एमएम एचईपीएस, 12.5 एमएम एनएएच2पीओ 4, 5.6 एमएम ग्लूकोज, 5.4 एमएम केसीएल, 0.8 एमएम एमजीएसओ4, पीएच 7.35) में घुमावदार कैंची का उपयोग करके एक आटोक्लेव अवतल ग्लासवेयर में छोटे टुकड़ों (1 मिमी x 1 मिमी) में विभाजित करें।
    2. कीमा ऊतकों और एक सूक्ष्म-चुंबकीय हलचल को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में स्थानांतरित करें, और ऊतकों को 0.1% कोलेजनेज़, 0.1% ट्रिप्सिन, 20 μg / mL DNase I, और 50 nM टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर के साथ एकल कोशिकाओं में 30 मिनट के लिए हिलाकर 37 डिग्री सेल्सियस पर विज्ञापन बफर में फैलाएं।
    3. प्राकृतिक अवसादन के माध्यम से समुच्चय और छितरी हुई कोशिकाओं को अलग करें, केवल बिखरी हुई कोशिकाओं को एक ट्यूब में इकट्ठा करें, और अवशिष्ट सेल समुच्चय को फिर से उसी पाचन माध्यम से पचाएं।
    4. इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक कि सभी कोशिकाएं पूरी तरह से अलग न हो जाएं। कोशिकाओं के पूर्ण फैलाव की पुष्टि करने के लिए, माइक्रोस्कोप (4x उद्देश्य लेंस) के तहत ट्यूबों का निरीक्षण करें।
    5. 5 मिनट के लिए 150 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके छितरी हुई कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें 1-2 एमएल विज्ञापन बफर में अलग करें।
  3. कार्डियोमायोसाइट्स की प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई।
    1. लाल प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने के लिए 556-601 एनएम बैंडपास फिल्टर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके कोशिकाओं का विश्लेषण करें।
    2. दोहरे अंशों को खत्मकरने के लिए सावधानीपूर्वक पूर्व-गेटिंग करें। डबल उन्मूलन के लिए गेट सेटिंग्स निर्माता के निर्देशों के अनुसार होनी चाहिए।
    3. एक्स-अक्ष पर आगे के स्कैटर और वाई-अक्ष पर लाल प्रतिदीप्ति संकेत सेट करें। तीन आबादी देखी गई: एरिथ्रोसाइट्स और मृत कोशिकाओं वाली सबसे कम आबादी, फाइब्रोब्लास्ट और एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित गैर-कार्डियोमायोसाइट्स युक्त एक मध्य आबादी, और शुद्ध वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स युक्त एक शीर्ष आबादी7।
  4. लाल प्रतिदीप्ति-लेबल कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों की तैयारी
    1. चुनिंदा कार्डियोमायोसाइट्स को क्रमबद्ध करें, और 150 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। अल्फा-संशोधित न्यूनतम आवश्यक माध्यम (अल्फा-एमईएम) के 1 एमएल में सेल छर्रों को पूरी तरह से भंग करें जिसमें 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) होता है।
    2. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता को मापें और अल्फा-एमईएम 10% एफबीएस के साथ सेल निलंबन समाधान को 3,000 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें।
    3. उन्हें सेल गैर-चिपकने वाली 96-वेल प्लेटों (100 μL प्रति कुएं), 100 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ सेल कल्चर इनक्यूबेटर में2-3 डी के लिए कल्चर करें।
    4. इंजेक्शन प्रयोगों से पहले, 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके संस्कृति माध्यम के साथ आकांक्षा के माध्यम से प्रत्येक कुएं से एक कार्डियोमायोसाइट गेंद की कटाई करें, और उन्हें 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें।
    5. एनग्राफमेंट के बाद ट्रैकिंग के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए पीकेएच 26 के साथ दाग लगाएं।

2. धीमी इंजेक्शन विधि के लिए तैयारी

  1. जिलेटिन स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. जिलेटिन का वजन करें, इसे 10% डब्ल्यू / वी समाधान का उत्पादन करने के लिए विज्ञापन बफर में घोलें, और इसे आटोक्लेव करें।
  2. एक सेल इंजेक्शन डिवाइस का उत्पादन
    1. समग्र डिवाइस डिजाइन: चित्रा 1 में दिखाए गए उपकरण तैयार करें। इस प्रणाली को एक सिरिंज शीतलन उपकरण और मुख्य इंजेक्शन उपकरण के साथ जोड़ा जाता है।
    2. नीचे वर्णित मुख्य इंजेक्शन उपकरण तैयार करें:
      1. नवजात कार्डियोमायोसाइट बॉल इंजेक्शन के लिए, सिरिंज से लैस 29 ग्राम, 50 मिमी लंबी सुई का उपयोग करें।
      2. सेल इंजेक्शन सिरिंज (चित्रा 1) का उपयोग करके पावर ट्रांसफर सिरिंज (18 जी, 1 एमएल) को बैक-टू-बैक कनेक्ट करें। पावर ट्रांसफर सिरिंज की सुई को कम लुमेन विस्तार क्षमता के साथ एक पतली पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब से कनेक्ट करें।
      3. फिर, पावर ट्रांसफर ट्यूब के दूसरे पक्ष को उसी सिरिंज (18 जी, 1 एमएल) की सुई से कनेक्ट करें, और इसे एक सिरिंज पंप में सेट करें। बिना किसी हवा के बुलबुले के पानी के साथ दो पावर ट्रांसफर सिरिंज और ट्यूब भरें।
        नोट: जब पावर ट्रांसफर सिरिंज के एक प्लंजर को अंदर धकेला जाता है, तो दबाव सीधे दूसरे सिरिंज में स्थानांतरित हो जाता है, और प्लंजर बाहर निकल जाता है।
    3. नीचे वर्णित इंजेक्शन सिरिंज कूलिंग सिस्टम सेट करें।
      1. सेल इंजेक्शन सिरिंज के सेल युक्त हिस्से के चारों ओर एक तांबे की ट्यूब (बाहरी व्यास = 1 मिमी; आंतरिक व्यास = 0.3 मिमी; मोटाई = 0.35 मिमी) को कसकर हवा दें, जिससे दोनों सिरों पर 10 मिमी अतिरिक्त पाइप बच जाए।
      2. कॉपर ट्यूब को लचीली प्लास्टिक टयूबिंग से कनेक्ट करें। इसके अलावा, प्लास्टिक टयूबिंग के अन्य सिरों को बाहरी पंप से कनेक्ट करें, लाइन को ठंडा पानी से भरें, और अतिरिक्त तांबे की ट्यूब को कुचल बर्फ में डुबोकर पानी को ठंडा करें (चित्रा 1)।
        नोट: यह शीतलन प्रणाली सिलेंडर में सेल निलंबन समाधान को लगभग 2 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखती है।

3. कोरोनरी धमनी रोड़ा द्वारा एक चूहे मायोकार्डियल रोधगलन मॉडल का विकास।

  1. 3% आइसोफ्लुरेन युक्त हवा के साथ पुरुष प्रतिरक्षा-कमी वाले नग्न चूहों (F344 / Njcl-rnu / rnu) को एनेस्थेटकरें। श्वासनली में एक प्रवेशनी डालें और इसे श्वासयंत्र से कनेक्ट करें।
  2. 3% आइसोफ्लुरेन एकाग्रता बनाए रखने के लिए एक नियंत्रक के साथ एक कैनुला को एक आइसोफ्लुरेन वेपोराइज़र से कनेक्ट करें और इस प्रकार, पर्याप्त संज्ञाहरण बनाए रखें। दर्द उत्तेजनाओं के लिए कोई प्रतिक्रिया की पुष्टि न करें। सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लगाएं।
  3. 40 डिग्री सेल्सियस गर्म सर्जिकल प्लेट पर कटे हुए सर्जिकल टेप के साथ अंगों को ठीक करें। चूहे के शरीर को शरीर की धुरी के दाईं ओर मोड़ें और बाएं बगल को सर्जिकल क्षेत्र के रूप में उपयोग करें।
  4. एक डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करके सर्जिकल क्षेत्र में बालों को हटा दें और पोविडोन-आयोडीन के साथ त्वचा को पोंछ दें। तेज कैंची का उपयोग करके, त्वचा और पेक्टोरलिस प्रमुख मांसपेशियों में 1.5 सेमी चीरा काट लें।
  5. तीसरे इंटरकोस्टल स्पेस की पुष्टि करें और कुंद युक्तियों के साथ माइक्रो फोर्सेस का उपयोग करके इंटरकोस्टल मांसपेशियों और कॉस्टल प्लूरा को चीरें। रिवर्टर का उपयोग करके छाती को खुला रखें। धीरे से पतली पेरिकार्डियम को बल के साथ हटा दें।
  6. हृदय की पार्श्व दीवार के रोधगलन मॉडल का निर्माण करने के लिए, बाएं आलिंद के सिरे पर 1 मिमी पुच्छल स्थिति का पता लगाएं ताकि कोरोनरी धमनी की पहचान की जा सके, 7-0 रेशम सीवन पास किया जा सके, पृष्ठीय से उदर तक 2.5 मिमी चौड़ा और 2.5 मिमी गहरा ऊतक निकाला जा सके, और ऊतक को कसकर लपेटें।
  7. लिग्चर से कमजोर संकुचन डिस्टल द्वारा सफल बंधाव की पुष्टि करें। धीरे से हटाने के बाद, दूसरे और चौथे इंटरकोस्टल रिक्त स्थान के बीच 5-0 रेशम सीवन रखें, और थोराकोटॉमी को बंद करें।
  8. आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 1% तक कम करें। 5-0 रेशम के साथ मांसपेशियों और त्वचा को धीरे से झुकाएं। आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 0% तक कम करें और सहज श्वास शुरू होने तक लगभग 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  9. शीर्ष रूप से चीरे पर नमकीन में 2 मिलीग्राम / एमएल लिडोकेन लागू करें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से 1 मिलीलीटर खारा का प्रशासन करें। संक्रमण को रोकने के लिए पशु चिकित्सा मरहम को शीर्ष पर लागू करें।
  10. इंटुबैशन ट्यूब से चूहे को हटा दें, और पशु पिंजरे में लौट आएं; फिर, चूहों को 1 सप्ताह के लिए अलग-अलग पिंजरों में उठाएं।
  11. इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करके कार्डियक सिस्टोलिक पंप फ़ंक्शन में परिवर्तन का विश्लेषण करें।
    नोट: पार्श्व मायोकार्डियल रोधगलन के कारण कार्डियक फ़ंक्शन कम हो जाएगा।

4. धीमी इंजेक्शन विधि का उपयोग करके इको-निर्देशित पर्क्यूटेनियस सेल प्रत्यारोपण

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% जिलेटिन स्टॉक को गर्म करें जब तक कि यह तरल न हो जाए।
  2. अंतिम इंजेक्शन योग्य 5% डब्ल्यू / वी जिलेटिन समाधान प्राप्त करने के लिए प्री-वार्म्ड विज्ञापन बफर के साथ 10% जिलेटिन स्टॉक को पतला करें (प्रति जानवर 100 μL की आवश्यकता होती है)।
  3. प्री-वार्मइंजेक्शन समाधान के 100 μL में 96 कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों (कुल: 28,800 कार्डियोमायोसाइट्स / पशु) को निलंबित करें।
  4. अतिरिक्त हवा की आकांक्षा से बचने के लिए, चरण 4.3 में तैयार निलंबन को सेल इंजेक्शन सिरिंज में लोड करें।
  5. सिरिंज में बुलबुले को खत्म करने के लिए, इसे सुई के साथ लंबवत रूप से पकड़ें, सिरिंज को टैप करें, और सिरिंज के ऊपरी रिज पर किसी भी बुलबुले को इकट्ठा करें।
    नोट: इस चरण के दौरान, कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों का निरीक्षण करें जो धीरे-धीरे प्लंजर की रबर सील पर बस जाते हैं।
  6. सिरिंज की ऊर्ध्वाधर स्थिति बनाए रखें, प्लंजर को धीरे-धीरे धक्का दें, और बुलबुले और अतिरिक्त सेल निलंबन समाधान को तब तक छोड़ दें जब तक कि सेल निलंबन का 20 μL सिरिंज में न रह जाए। प्लंजर को एक निरंतर गति से सावधानी पूर्वक धक्का दें ताकि कार्डियोमायोसाइट गेंद प्लंजर की रबर सील पर टिकी रहे।
  7. कैप्ड सिरिंज को सीधे 5 मिनट के लिए बर्फ स्नान में डुबोएं।
  8. इंजेक्शन उपकरण में एक ठंडा सिरिंज रखें। एक्स-वाई-जेड स्थिति-समायोज्य हस्तनिर्मित क्लैंप का उपयोग करके पशु मंच पर एक ठीक आंदोलन उपकरण पर स्थापित इंजेक्शन सिरिंज उपकरण को कसकर ठीक करें। फाइन मूवमेंट डिवाइस एक्स-डायरेक्शन 20 मिमी स्लाइड, वाई-डायरेक्शन स्विंग और जेड-डायरेक्शन झुकने वाले मूवमेंट्स का उपयोग करके सुई की स्थिति को स्थानांतरित कर सकता है।
  9. चूहों को 3% आइसोफ्लुरेन युक्त हवा से भरे एक सील बॉक्स में एनेस्थेटाइज करें। दर्द उत्तेजनाओं के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं करके संज्ञाहरण की पुष्टि करें। सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लगाएं।
  10. 40 डिग्री सेल्सियस गर्म इको प्लेट पर कटे हुए सर्जिकल टेप के साथ अंगों को ठीक करें। पर्याप्त संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए, सुनिश्चित करें कि साँस की हवा में आइसोफ्लुरेन की लगभग 3% सांद्रता होती है।
  11. इंजेक्शन क्षेत्र (व्यास में 2 सेमी) और छाती पर बालों को डिपिलेटरी क्रीम से हटा दें और पोविडोन-आयोडीन के साथ त्वचा को पोंछ लें।
  12. छाती और इको प्रोब पर इको-जेल लगाएं। इको प्रोब को कपाल और पुच्छल अक्षों के साथ छाती के करीब रखें और निर्माता के मैनुअल का पालन करते हुए बी-मोड इकोकार्डियोग्राफी प्राप्त करना शुरू करें।
  13. इंजेक्शन सुई की नोक को फ्रंटल व्यू (चित्रा 2 और पूरक वीडियो 1) पर मायोकार्डियम में आगे बढ़ाएं।
  14. मुख्य सिरिंज पंप को सक्रिय करने के लिए, स्टार्ट बटन दबाएं, और डायल को लगभग 0.02 μL / s की इंजेक्शन गति के लिए पूर्व निर्धारित संख्या में समायोजित करने के लिए घुमाएं। संक्रमण को रोकने के लिए आवश्यक स्थिति के आसपास पशु चिकित्सा मरहम लगाएं।
    नोट: इंजेक्शन समाधान का उपयोग करके इच्छित इंजेक्शन गति के लिए उपयुक्त डायल नंबर निर्धारित करना आवश्यक है। इंजेक्शन के बाद, एक अनुकरणीय आंदोलन प्रणाली का उपयोग करके इंजेक्शन सुई को हटा दें।
  15. आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 0% तक कम करें और लगभग 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जानवर उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।

5. कार्डियक फ़ंक्शन का मूल्यांकन

  1. चूहों को 3% आइसोफ्लुरेन युक्त हवा से भरे एक सील बॉक्स में एनेस्थेटाइज करें। दर्द उत्तेजनाओं के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं करके संज्ञाहरण की पुष्टि करें। सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लगाएं।
  2. अंग युक्तियों पर ईसीजी अधिग्रहण के लिए विद्युतीकरण क्रीम लागू करें। 40 डिग्री सेल्सियस गर्म इको प्लेट पर कटे हुए सर्जिकल टेप के साथ अंगों को ठीक करें। वास्तविक समय ईसीजी और हृदय गति का पता लगाने के लिए एक शारीरिक निगरानी प्रणाली का उपयोग करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, पहले बी-मोड इको इमेज का उपयोग करके लंबे-अक्ष कोण का निर्धारण करें जो बाएं वेंट्रिकुलर एपेक्स को बहिर्वाह पथ को दर्शाता है, और फिर इको-प्रोब को शॉर्ट-एक्सिस व्यू में बदलने के लिए 90 डिग्री घुमाएं।
  4. पशु चरण के केवल पुच्छल से रोस्ट्रल अक्ष ठीक आंदोलन प्रणाली का उपयोग करके, पैपिलरी मांसपेशी स्तर पर लघु-अक्ष दृश्य को समायोजित करें। फिर, एम-मोड बटन दबाकर छवि मोड को एम-मोड में बदलें, और सिने-लूप बटन दबाकर 5 सेकंड के लिए एक वीडियो रिकॉर्ड करें।
  5. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अंश शॉर्टिंग का विश्लेषण और गणना करने के लिए, एंड-सिस्टोलिक और एंड-डायस्टोलिक लेफ्ट वेंट्रिकुलर आंतरिक आयामों को परिभाषित करने के लिए माप बटन और एक ऊर्ध्वाधर लाइन टूल दबाएं। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रतिशत अंश शॉर्टनिंग (एफएस) की गणना करता है।
  6. आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को 0% तक कम करें और लगभग 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जानवर उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।

6. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. कटे हुए सर्जिकल टेप का उपयोग करके मेज पर इच्छामृत्यु (चरण 1.1.3 के रूप में इच्छामृत्यु करें) को ठीक करें, दिल को एक्साइज करें, पीबीएस से धोएं, और दिल को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड / पीबीएस में डुबोएं।
  2. दिल को तीन वर्गों में विभाजित करें, उन्हें क्रायोप्रोटेक्शन के लिए 40% सुक्रोज में डुबोएं, एक इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में एम्बेड करें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  3. क्रायोसेक्शन्ड ऊतकों (8 μm मोटाई) को एमिनोसिलन-लेपित ग्लास स्लाइड में संलग्न करें। एक सामान्य हेयर ड्रायर द्वारा उत्पन्न गैर-गर्म हवा का उपयोग करके पर्याप्त सुखाने के बाद, ग्लास स्लाइड को 0.2% ट्वीन -20 (टीबीएस-टी) युक्त ट्रिस-बफर्ड सेलाइन में डुबोएं।
  4. उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक अवरुद्ध समाधान में डुबोएं। स्लाइड पर प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त ब्लॉकिंग समाधान के 100 μL डालें, और ऊतक पर एंटीबॉडी समाधान फैलाने के लिए पैराफिन सीलिंग के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: एंटीबॉडी एकाग्रता सामग्री की तालिका में दिखाया गया है।
  5. वाष्पीकरण को रोकने के लिए गीले कागज से प्राकृतिक वाष्प का उपयोग करके एक हस्तनिर्मित उच्च-आर्द्रता बॉक्स में स्लाइड ्स को क्षैतिज रूप से रखें। टीबीएस-टी के साथ स्लाइड्स को तीन बार धोएं।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी के समान 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी युक्त ब्लॉकिंग एजेंट के साथ इलाज करें। तीन धोने के बाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रतिदीप्ति संकेतों का निरीक्षण करें।
    नोट: एंटीबॉडी एकाग्रता सामग्री की तालिका में दिखाया गया है।
  7. सांख्यिकीय विश्लेषण: सेल वॉल्यूम तुलना के लिए, जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, एक गैर-युग्मित टी-परीक्षण करें; धीमी इंजेक्शन विधि का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट्स प्रशासन के बाद कार्डियक कार्यात्मक वसूली का आकलन करने के लिए, जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, एक युग्मित टी-टेस्ट का उपयोग करें। इस काम में, पी < .01 पर मतभेदों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं.

Representative Results

सेल अस्तित्व और कोलेजन जमाव पर धीमी गति से इंजेक्शन के प्रभाव।
पीकेएच 26 के साथ लेबल किए गए नवजात चूहे कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों को सामान्य या धीमी इंजेक्शन विधि का उपयोग करके सामान्य नग्न चूहे मायोकार्डियम में इंजेक्ट किया गया था। परिणामों से पता चला है कि धीमी इंजेक्शन विधि ने एनग्राफ्टेड सेल वॉल्यूम (चित्रा 3 ए) में काफी वृद्धि की और साइट पर टाइप 1 कोलेजन जमाव (चित्रा 3 बी) में काफी कमी आई।

चूहे रोधगलन मॉडल में उपचार प्रभावकारिता पर धीमी इंजेक्शन के प्रभाव
इकोकार्डियोग्राफ-निर्देशित धीमी इंजेक्शन विधि का उपयोग नवजात चूहे कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों या पीबीएस (−) को मॉडल चूहों के इन्फ्रैक्टेड दिलों में इंजेक्ट करने के लिए किया गया था। अकेले सेल-इंजेक्शन समूह ने 2 महीने के बाद हृदय संकुचन समारोह में महत्वपूर्ण सुधार प्रदर्शित किया (चित्रा 4 ए)। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण ों ने अंतराल जंक्शनों (चित्रा 4 बी) वाले इंटरकैलेटेड डिस्क के माध्यम से एनग्राफ्टेड कोशिकाओं और मेजबान मायोसाइट्स के बीच एक सहज संबंध का खुलासा किया।

Figure 1
चित्र 1: पूरे इंजेक्शन प्रणाली का योजनाबद्ध । (ए) मुख्य इंजेक्शन उपकरण। (बी) इंजेक्शन सिरिंज कूलिंग सिस्टम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित पर्क्यूटेनियस स्लो इंजेक्शन । (ए) पशु की स्थापना, इको जांच, और इंजेक्शन उपकरण। (बी) इंजेक्शन सिरिंज और दिल का शानदार दृश्य। ध्यान दें कि बाएं और दाएं चित्र समान हैं, लेकिन सुई की स्थिति को इंगित करने के लिए एक पीली रेखा जोड़ी गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एन्ग्राफ्टेड सेल वॉल्यूम और कोलेजन जमाव पर धीमी इंजेक्शन विधि का प्रभाव। (ए) एनग्राफ्टेड सेल वॉल्यूम (एन = 3) की गणना सीरियल सेक्शन से की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. * एक गैर-युग्मित टी-टेस्ट में पी < 0.01। (बी) टाइप 1 कोलेजन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन। स्केल पट्टी 200 μm इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: धीमी इंजेक्शन विधि द्वारा कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों के साथ हृदय समारोह और हिस्टोलॉजिकल एकीकरण में सुधार । (ए) प्रतिनिधि इकोकार्डियोग्राफ एम-मोड दृश्य। ग्राफ कार्डियोमायोसाइट बॉल-ट्रांसप्लांट किए गए समूह (ठोस लाल रेखा) में अंश शॉर्टनिंग के संक्रमण को दर्शाता है; एन = 4) और वाहन (धीमी इंजेक्शन विधि के लिए सेल निलंबन समाधान) समूह (डॉटेड ब्लू लाइन; एन = 3)। संक्षेप: एमआई = मायोकार्डियल रोधगलन; सीएक्स 43 = कॉनेक्सिन 43; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल; PKH26 = लाल फ्लोरोसेंट सेल झिल्ली लेबल। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. * युग्मित टी-टेस्ट में पी < 0.01। (बी) एनग्राफ्टेड कार्डियोमायोसाइट्स गेंदों और मेजबान कार्डियोमायोसाइट्स के बीच संबंधों का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण। 2x ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके पारंपरिक लेजर माइक्रोस्कोपिक अवलोकन बाएं कॉलम में दिखाए गए हैं। बॉक्स में दिखाए गए दो क्षेत्रों के ज़ूम-इन संस्करण (20x उद्देश्य लेंस का उपयोग करके), * और # के साथ लेबल किए गए हैं, नीचे प्रस्तुत किए गए हैं। स्केल बार: शीर्ष छवि = 300 μm; * और # = 30 μm. 20x ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके कॉन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोपिक छवियों को कोमापेरिसन के लिए दिखाया गया है। तीन पदों को दिखाया गया है। विलय की गई छवियों में, तीर के निशान सीधे ग्राफ्ट और मेजबान कार्डियोमायोसाइट्स को जोड़ने वाले गैप जंक्शनों (सीएक्स 43) के अस्तित्व का संकेत देते हैं। स्केल पट्टी 30 μm इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: इको-निर्देशित धीमी इंजेक्शन विधि। फ्रंटल व्यू में बी-मोड इकोकार्डियोग्राम मायोकार्डियम में उन्नत इंजेक्शन सुई की नोक को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

धीमी इंजेक्शन विधि के सफल प्रदर्शन में महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक शक्तिशाली सिरिंज पंप और एक मजबूत दबाव हस्तांतरण ट्यूब का उपयोग करके एक प्रभावी इंजेक्शन प्रणाली की तैयारी है। एक महीन सुई की नोक से जेल को बाहर धकेलने के लिए एक उच्च दबाव प्रणाली की आवश्यकता होती है। दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु दिल का स्थिरीकरण है। मायोकार्डियम में उन्नत इंजेक्शन सुई के खिलाफ दिल की धड़कन ऊतक को घायल कर सकती है। इस अध्ययन में, दूसरी खुली छाती की चोट से गुजरने वाले जानवरों से बचने और फेफड़ों को फुलाए गए स्थिर हृदय में सेल इंजेक्शन देने के लिए एक इको-निर्देशित इंजेक्शन आयोजित किया गया था। इसके अलावा, बड़े जानवरों या मनुष्यों के लिए कुछ अनुप्रयोगों में, दिल पर जुड़े कुछ इंजेक्शन उपकरणों को आवेदन के रणनीतिक डिजाइन के हिस्से के रूप में माना जाना चाहिए। छोटे जानवरों के दिल में खुली छाती के इंजेक्शन के लिए, उनकी उच्च हृदय गति को देखते हुए एक लंबी, लचीली सुई के उपयोग की सिफारिश की जाती है।

इस काम में, धीमी इंजेक्शन विधि ने सामान्य इंजेक्शन विधि की तुलना में जीवित कार्डियोमायोसाइट्स की मात्रा में काफी वृद्धि की। सामान्य इंजेक्शन कतरनी तनाव15 के माध्यम से सेल क्षति का कारण बनता है। इसके विपरीत, धीमी इंजेक्शन विधि सैद्धांतिक रूप से इस तरह के तनाव का कारण नहीं बनती है क्योंकि यह धीमी इंजेक्शन के अलावा एक गैर-न्यूटोनियन समाधान का उपयोग करती है।

स्थानीय फाइब्रोसिस के संदर्भ में, सामान्य रूप से इंजेक्ट किए गए जीवित कार्डियोमायोसाइट्स के आसपास अंतरालीय स्थान ने मजबूत और व्यापक टाइप 1 कोलेजन जमाव दिखाया। इसके विपरीत, धीमी इंजेक्शन विधि का उपयोग करके ग्राफ्ट किए गए एनग्राफ्टेड कार्डियोमायोसाइट्स के आसपास टाइप 1 कोलेजन सिग्नल बहुत कमजोर और अधिक सीमित थे। इससे पता चलता है कि धीमी इंजेक्शन विधि ने काफी कम नुकसान पहुंचाया। वयस्क मायोकार्डियम में नवजात कार्डियोमायोसाइट्स के धीमे इंजेक्शन ने रोधगलित हृदय के संकुचन कार्य में काफी सुधार किया। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने सुझाव दिया कि धीमी इंजेक्शन विधि का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट्स को ग्राफ्टिंग करने के परिणामस्वरूप मेजबान कार्डियोमायोसाइट्स के साथ सीधे कनेक्शन और कार्यात्मक युग्मन हुआ। यह घटना मेजबान मायोकार्डियम की कार्यात्मक वसूली के तंत्र की व्याख्या करती है। हमारे ज्ञान के अनुसार, यह मेजबान वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स के लिए बड़े पैमाने पर सहज कनेक्शन के साथ एनग्राफ्टेड नवजात कार्डियोमायोसाइट्स की पहली रिपोर्ट है। विद्युत और यांत्रिक युग्मन के माध्यम से मेजबान मायोकार्डियम के साथ कार्यात्मक कनेक्शन एन्ग्राफ्टेड कार्डियोमायोसाइट्स को परिपक्व बना सकते हैं और उन्हें कार्यात्मक मायोसाइट्स के रूप में कार्य करने की अनुमति दे सकते हैं जो मेजबान हृदय समारोह में योगदान करते हैं। मेजबान और ग्राफ्ट कार्डियोमायोसाइट्स के बीच दीर्घकालिक शारीरिक बल बातचीत पूर्ण परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, इन्फ्रैक्टेड हार्ट की कार्यात्मक वसूली के लिए इंजेक्शन के बाद 2 महीने की आवश्यकता हो सकती है। रोगी के हृदय समारोह की समय-निर्भर वसूली चिकित्सीय अनुप्रयोगों में एक अपेक्षित घटना हो सकती है, और यह मेजबान और ग्राफ्टेड कार्डियोमायोसाइट्स के बीच डे नोवो कार्यात्मक युग्मन और एकीकरण की सफल स्थापना की पहचान हो सकती है।

धीमी इंजेक्शन विधि खुली छाती सर्जरी के दौरान किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि को चूहों पर लागू किया जा सकता है। मानव चिकित्सा में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, हमें अभी भी कई मुद्दों को हल करने की आवश्यकता है। इंजेक्शन की गति को प्रत्येक मानव लक्ष्य अंग में अंतरालीय द्रव प्रवाह की बफर क्षमता पर विचार करके अनुकूलित किया जाना चाहिए। क्सीन-मुक्त सामग्री, जैसे मानव जिलेटिन या बायोडिग्रेडेबल सिंथेटिक सामग्री, को लागू किया जाना चाहिए। नैदानिक जीएमपी-ग्रेड धीमी इंजेक्शन उपकरण, जैसे कि कॉम्पैक्ट अंग-विशिष्ट डिस्पोजेबल उपकरण या पुन: प्रयोज्य व्यापक-अंग लागू उपकरण, विकसित किया जाना चाहिए।

Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को जेएसपीएस केकेन्ही (अनुदान संख्या 23390072 और 19के07335) और एएमईडी (अनुदान संख्या ए -149) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18-gauge needle & tuberculin, 1 mL Terumo  NN1838R, SS-01T
29-gauge 50 mm-long needle Ito Corporation, Tokyo, Japan 14903 Type-A 
A copper tube General Suppliers outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm
Ads Buffer Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35
alpha-MEM Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan 051-07615
Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) Proteintech 14695-1-AP using dilution 1:100
Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) Sigma Aldrich C6219 using dilution 1:100
Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488  Thermo Scientific A21206 using dilution 1:300
blocking solution (Blocking One) Nacalai Tesque, Kyoto, Japan 03953-95 
collagenase Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan 034-22363
confocal laser microscope Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany LSM510 META
DNase I Sigma-Aldrich DN25
FACS Aria III Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA
fetal bovine serum BioWest, FL, USA S1820-500
fine movement device (Micromanipulator) Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan M-44
fluorescence microscope  Nikon Instruments, Tokyo, Japan Eclipse Ti2
gelatin from bovine skin Sigma-Aldrich G9382 dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it
Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan 0–2 d after birth
non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan MS-0096S
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound  Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA Tissue-Tek OCT compound
peristaltic pump (for cooling system) As One Co., Osaka, Japan SMP-23AS
PKH26 Sigma-Aldrich PKH26GL
Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 Chemglass life sciences LLC, NJ, USA CG-2003-120
syringe  Ito Corporation, Tokyo, Japan MS-N25
syringe pump with remote controller As One Co., Osaka, Japan MR-1, CT-10
tetramethylrhodamine methyl ester Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA T668
trypsin DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 215240
Tween-20 Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan 167-11515
veterinarian ointment  Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. Hibikusu ointment  #WAK-95832
Vevo 2100 Imaging System Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada Vevo 2100
Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada Vevo 2100
Weakly curved needle with ophthalmic thread Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan C7-70

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बायोइंजीनियरिंग अंक 194
न्यूनतम आक्रमण के साथ एक उपन्यास सेल इंजेक्शन विधि
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Hattori, F. A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion. J. Vis. Exp. (194), e65260, doi:10.3791/65260 (2023).

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