Summary
Denna metod eliminerar alla större invasioner under cellinjektioner orsakade av cellsuspensionslösningen.
Abstract
Att injicera celler direkt i vävnader är en nödvändig process vid celladministrering och/eller substitutionsterapi. Cellinjektionen kräver en tillräcklig mängd suspensionslösning för att cellerna ska kunna tränga in i vävnaden. Suspensionslösningens volym påverkar vävnaden, och detta kan orsaka stor invasiv skada till följd av cellinjektionen. Denna artikel rapporterar om en ny cellinjektionsmetod, kallad långsam injektion, som syftar till att undvika denna skada. Att trycka ut cellerna från nålspetsen kräver dock en tillräckligt hög injektionshastighet enligt Newtons lag om skjuvkraft. För att lösa ovanstående motsägelse användes en icke-newtonsk vätska, såsom gelatinlösning, som cellsuspensionslösning i detta arbete. Gelatinlösning har temperaturkänslighet, eftersom deras form ändras från gel till sol vid cirka 20 °C. För att hålla cellsuspensionslösningen i gelform hölls sprutan därför kyld i detta protokoll. Men när lösningen injicerades i kroppen omvandlade kroppstemperaturen den till en sol. Det interstitiella vävnadsvätskeflödet kan absorbera överflödig lösning. I detta arbete tillät den långsamma injektionstekniken kardiomyocytbollar att komma in i värdens myokardium och transplantera utan omgivande fibros. I denna studie användes en långsam injektionsmetod för att injicera renade och bollformade kardiomyocyter från nyfödda råttor i ett avlägset område med hjärtinfarkt i det vuxna råtthjärtat. 2 månader efter injektionen uppvisade hjärtan hos de transplanterade grupperna signifikant förbättrad kontraktil funktion. Dessutom avslöjade histologiska analyser av de långsamt injicerade hjärtana sömlösa kopplingar mellan värden och transplantatkardiomyocyterna via interkalerade skivor som innehöll gap junction-anslutningar. Denna metod kan bidra till nästa generations cellterapier, särskilt inom hjärtregenerativ medicin.
Introduction
Administrering och ersättning av celler är lovande nya terapeutiska strategier för kraftigt skadade organ. Bland dessa nya terapeutiska strategier har hjärtregenerativ medicin väckt stor uppmärksamhet. Inflammationen som orsakas av skador förmedlar dock ärrbildning i flera organ 1,2,3,4. Det mänskliga hjärtat består av cirka 1010 kardiomyocyter; Därför, teoretiskt5,6, måste den behandlas med mer än 109 kardiomyocyter. Administrering av ett stort antal kardiomyocyter via traditionella injektionsmetoder kan leda till betydande vävnadsskador7. Denna metod ger en ny cellinjektionsmetod med minimal vävnadsinvasion.
Celladministrering i organparenkymet kräver injektion(er). Det finns dock en diskrepans i och med att injektionen i sig kan leda till vävnadsskada. Vävnadsskada orsakar lokal inflammation och obotlig ärrbildning i organ och vävnader, samt nedsatt regenerativ förmåga 8,9,10. Däggdjurshjärtat har en extremt hög benägenhet att utveckla ärr istället för att regenerera eftersom det kräver omedelbar skadereparation för att uthärda det höga blodtrycket som orsakas av dess kontinuerligapumpfunktion. Ablationsterapi utnyttjar denna höga benägenhet för ärrbildning och blockerar kretsen som sannolikt kommer att genomgå ärrbildning med hjälp av arytmi12. I en tidigare studie observerades att ärrvävnaden isolerade de injicerade kardiomyocyterna i värdens hjärtmuskel. Således representerar detta nästa målfråga som måste övervinnas för att uppnå förbättrad terapeutisk effekt inom hjärtregenerativ medicin.
Interstitiellt vätskeflöde i vävnad spelar en viktig roll för att transportera syre och näringsämnen till cellerna och ta bort det utsöndrade avfallet från cellerna. Den fysiologiska hastigheten för interstitiellt vätskeflöde i varje vävnad/organ är olika (intervallet är 0,01-10 μm/s)13. Så vitt författaren vet finns det inga data om enskilda vävnaders/organs förmåga att stödja extra mängder vätska utan patologiskt ödem; Detta experiment försöker dock använda en långsam injektionshastighet för att eventuellt minska vävnadsskadan, och resultaten kan användas för att bestämma det praktiska i detta koncept.
Protocol
Djurförsöken utfördes i enlighet med Kansai-Medical Universitys etiska riktlinjer för djurförsök och godkändes av de etiska kommittéerna (godkännandenummer: 23-104). Alla djuren föddes upp under en konstant ljus-mörkercykel i en specifik patogenfri miljö. Alla steriliserade kirurgiska verktyg, såsom saxar, pincetter och upprullningsdon, autoklaverades och torkades noggrant.
1. Beredning av de neonatala kardiomyocytbollarna hos råttor
- Neonatal råtta hjärta samling
- För hjärtinsamlingen, följ en procedur som liknar den som beskrivs i en tidigare rapport7.
- Sänk ner neonatala (0-2 dagar efter födseln) Sprague-Dawley (SD) råttor i povidon-jod och 70 % etanollösningar sekventiellt och överför dem sedan till ett lufttätt hölje fyllt med förångat isofluran (koncentrationen bör vara över 10 % v/v) för djup anestesi.
- Efter att ha bekräftat medvetslöshet genom förlust av rörelseaktivitet, halshugg råttan medan du håller kroppen från ryggen med handen och skär sedan 2-4 mm vävnad från bröstkorgens främre centrum till svansen och sedan i rostral riktning med en vass sax.
- Ta tag i rygghuden för att dra upp snittet och tryck ut hjärtat från bröstkorgen. Klipp av kamrarna med en sax och sänk ner dem i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) utan kalcium eller magnesium (PBS(−)).
- Dispersion av de neonatala kardiomyocyterna hos råtta
- Finhacka de uppsamlade kamrarna dispergerade i en minimal mängd Ads-buffert (Ads-buffert: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO 4, 5,6 mM glukos, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35) i en autoklaverad konkav glasvara i små bitar (1 mm x 1 mm) med böjd sax.
- Överför de malda vävnaderna och en mikromagnetisk omrörare till ett 50 ml centrifugeringsrör och dispergera vävnaderna i enskilda celler med 0,1 % kollagenas, 0,1 % trypsin, 20 μg/ml DNas I och 50 nM tetrametylrodaminmetylester i Ads-buffert vid 37 °C under omrörning i 30 minuter.
- Separera aggregaten och de dispergerade cellerna genom naturlig sedimentering, samla endast de dispergerade cellerna i ett rör och smält de kvarvarande cellaggregaten igen med samma matsmältningsmedium.
- Fortsätt denna procedur tills alla celler är helt dissocierade. För att bekräfta den fullständiga spridningen av cellerna, observera rören under ett mikroskop (4x objektivlins).
- Samla upp de dispergerade cellerna med centrifugering vid 150 x g i 5 minuter och dissociera dem i 1-2 ml Ads-buffert.
- Fluorescensaktiverad cellsortering av kardiomyocyter
- Analysera cellerna med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) med 556-601 nm bandpassfilter för att detektera röda fluorescenssignaler.
- Utför noggrant pre-gating för att eliminera dubblettfraktioner14. Grindinställningarna för dubbeleliminering bör vara enligt tillverkarens instruktioner.
- Ställ in framåtspridningen på x-axeln och den röda fluorescenssignalen på y-axeln. Tre populationer observerades: en nedersta population innehållande erytrocyter och döda celler, en mellersta population innehållande icke-kardiomyocyter, inklusive fibroblaster och endotelceller, och en topppopulation innehållande rena ventrikulära kardiomyocyter7.
- Beredning av röda fluorescensmärkta kardiomyocytbollar
- Sortera kardiomyocyterna selektivt och centrifugera i 5 minuter vid 150 x g. Lös upp cellpelletsen helt i 1 ml alfamodifierat minimalt essentiellt medium (alfa-MEM) som innehåller 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS).
- Mät cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer och späd cellsuspensionslösningen till 3 000 celler/ml med alfa-MEM 10 % FBS.
- Fördela dem i icke-vidhäftande cellplattor med 96 brunnar (100 μL per brunn), centrifugera i 5 minuter vid 100 x g och odla i 2-3 dagar i en cellodlingsinkubator med 5 % CO2 vid 37 °C.
- Före injektionsförsöken skördas en kardiomyocytboll från varje brunn genom aspiration med odlingsmediet med hjälp av en 1 000 μl pipett och samlas upp i ett 15 ml rör.
- Färga med PKH26 enligt tillverkarens instruktioner för spårning efter ingrepp.
2. Förberedelser för metoden med långsam injektion
- Beredning av stamgelatinlösningen
- Väg gelatinet, lös upp det i Ads-buffert för att producera en 10 % w/v-lösning och autoklavera det.
- Tillverkning av en cellinjektionsanordning
- Övergripande enhetsdesign: Förbered apparaten som visas i figur 1. Detta system kombineras med en apparat för kylning av sprutor och en huvudinjektionsapparat.
- Förbered huvudinsprutningsapparaten som beskrivs nedan:
- För en neonatal kardiomyocytkulinjektion, använd en 29 G, 50 mm lång nål utrustad med en spruta.
- Anslut en kraftöverföringsspruta (18 G, 1 ml) rygg mot rygg med en cellinjektionsspruta (Figur 1). Anslut nålen på kraftöverföringssprutan till ett tunt polypropenrör med låg lumenexpanderbarhet.
- Anslut sedan den andra sidan av kraftöverföringsröret till nålen på samma spruta (18 G, 1 ml) och sätt in den i en sprutpump. Fyll de två kraftöverföringssprutorna och rören med vatten utan luftbubblor.
OBS: När en kolv på kraftöverföringssprutan trycks in, överförs trycket direkt till den andra sprutan och kolven sticker ut.
- Ställ in injektionssprutans kylsystem enligt beskrivningen nedan.
- Linda ett kopparrör (ytterdiameter = 1 mm, innerdiameter = 0,3 mm, tjocklek = 0,35 mm) tätt runt den cellinnehållande delen av cellinjektionssprutan och lämna 10 mm överskottsrör i båda ändar.
- Anslut kopparröret till flexibel plastslang. Anslut sedan de andra ändarna av plastslangen till en extern pump, fyll ledningen med kylvatten och kyl vattnet genom att sänka ner överskottet av kopparröret i krossad is (Figur 1).
OBS: Detta kylsystem håller cellsuspensionslösningen i cylindern vid cirka 2 °C.
3. Utveckling av en modell för hjärtinfarkt på råtta genom trubbigt ocklusion av kranskärl
- Bedöva nakna hanråttor med immunbrist (F344/Njcl-rnu/rnu) med luft som innehåller 3% isofluran. Sätt in en kanyl i luftstrupen och anslut den till andningsskyddet.
- Anslut en kanyl till en isofluranförångare med en styrenhet för att upprätthålla en koncentration på 3 % isofluran och därmed upprätthålla tillräcklig anestesi. Bekräfta att du inte svarar på smärtstimuli. Applicera veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet.
- Fäst extremiteterna med avklippt kirurgtejp på en 40 °C uppvärmd operationsplatta. Vrid råttans kropp till höger om kroppsaxeln och använd vänster armhåla som operationsfält.
- Ta bort håret i det kirurgiska området med en hårborttagningskräm och torka huden med povidon-jod. Använd en vass sax och skär ett 1,5 cm snitt i huden och pectoralis major-muskeln.
- Bekräfta det tredje interkostala utrymmet och riv sönder interkostalmusklerna och costal pleura med hjälp av en mikropincett med trubbiga spetsar. Håll kistan öppen med hjälp av en upprullningsdon. Ta försiktigt bort det tunna hjärtsäcken med en pincett.
- För att konstruera en infarktmodell av hjärtats sidovägg, hitta positionen 1 mm kaudalt till spetsen av vänster förmak för att identifiera det trubbiga kranskärlet, passera en 7-0 silkessutur, skopa upp vävnad som är 2,5 mm bred och 2,5 mm djup från dorsal till ventral och ligera vävnaden tätt.
- Bekräfta framgångsrik ligering genom den svaga sammandragningen distalt från ligaturen. Efter att försiktigt ha tagit bort upprullningsdonet, placera en 5-0 silkessutur mellan det andra och fjärde interkostala utrymmet och stäng torakotomin.
- Sänk isoflurankoncentrationen till 1 %. Suturera försiktigt muskeln och huden med 5-0 silke. Sänk isoflurankoncentrationen till 0 % och vänta i cirka 5 minuter tills spontanandningen startar.
- Applicera lokalt 2 mg/ml lidokain i koksaltlösning på snittet. Administrera 1 ml koksaltlösning via en subkutan injektion. Applicera veterinärsalva utvärtes för att förhindra infektioner.
- Ta bort råttan från intubationsröret och återgå till djurburen; Föd sedan upp råttorna i individuella burar i 1 vecka.
- Analysera förändringarna i hjärtats systoliska pumpfunktion med hjälp av ekokardiografi.
OBS: Hjärtfunktionen kommer att vara nedsatt på grund av lateral hjärtinfarkt.
4. Ekostyrd perkutan celltransplantation med långsam injektion
- Värm 10 % gelatinbuljong vid 37 °C tills den blir flytande.
- Späd 10 % gelatinbuljong med förvärmd Ads-buffert för att erhålla den slutliga injicerbara 5 % vikt/volymprocent gelatinlösning (100 μl krävs per djur).
- Suspendera 96 kardiomyocytkulor (totalt: 28 800 kardiomyocyter/djur) i 100 μl förvärmd injektionslösning.
- Fyll på suspensionen som beretts i steg 4.3 i cellinjektionssprutan, undvik att överskottsluft trängs in.
- För att eliminera bubblor i sprutan, håll den vertikalt med nålen uppåt, knacka på sprutan och samla upp eventuella bubblor vid sprutans övre kant.
OBS: Under detta steg, observera att kardiomyocytkulorna gradvis sätter sig på kolvens gummitätning. - Behåll sprutans vertikala läge, tryck långsamt upp kolven och kassera bubblorna och överskottet av cellsuspensionslösning tills 20 μl av cellsuspensionen finns kvar i sprutan. Tryck försiktigt på kolven med konstant hastighet så att kardiomyocytkulan förblir vilande på kolvens gummitätning.
- Sänk ned sprutan med lock direkt i ett isbad i 5 minuter.
- Placera en kyld spruta i injektionsapparaten. Fäst injektionssprutan ordentligt på en fin rörelseanordning på djurstadiet med hjälp av en X-Y-Z-positionsjusterbar handgjord klämma. Finrörelseanordningen kan flytta nålens position med hjälp av x-riktningen 20 mm slide, y-riktningssvängning och z-riktningsböjningsrörelser.
- Bedöva råttorna i en förseglad låda fylld med luft som innehåller 3% isofluran. Bekräfta anestesi genom att inte svara på smärtstimuli. Applicera veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet.
- Fäst extremiteterna med avklippt kirurgtejp på en 40 °C uppvärmd ekoplatta. För att upprätthålla tillräcklig anestesi, se till att inandningsluften innehåller en koncentration av isofluran på cirka 3 %.
- Ta bort håret vid injektionsfältet (2 cm i diameter) och bröstet med hårborttagningskräm och torka av huden med povidonjod.
- Applicera ekogel på bröstet och ekosonden. Placera ekosonden nära bröstkorgen längs kranial- och kaudalaxlarna och börja få ekokardiografi i B-läge enligt tillverkarens manual.
- För in injektionsnålens spets i hjärtmuskeln framifrån (Figur 2 och kompletterande video 1).
- För att aktivera huvudsprutpumpen, tryck på Start-knappen och vrid ratten för att justera till ett förutbestämt antal för en injektionshastighet på cirka 0,02 μL/s. Applicera veterinärsalva lokalt runt nålpositionen för att förhindra infektioner.
OBS: Det är nödvändigt att bestämma lämpligt uppringningsnummer för den avsedda injektionshastigheten med hjälp av en injektionslösning. Efter injektionen avlägsnas injektionsnålen med hjälp av ett exemplariskt rörelsesystem. - Sänk isoflurankoncentrationen till 0 % och vänta i cirka 5 minuter tills djuret återfår tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande.
5. Utvärdering av hjärtfunktionen
- Bedöva råttorna i en förseglad låda fylld med luft som innehåller 3% isofluran. Bekräfta anestesi genom att inte svara på smärtstimuli. Applicera veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet.
- Applicera elektrifierande kräm för EKG-insamling på extremitetsspetsarna. Fäst extremiteterna med avklippt kirurgtejp på en 40 °C uppvärmd ekoplatta. Använd ett fysiologiskt övervakningssystem för att upptäcka EKG och hjärtfrekvens i realtid.
- Enligt tillverkarens instruktioner, bestäm först den långa axelvinkeln med hjälp av ekobilden i B-läge som visar vänster kammares apex till utflödeskanalen, och vrid sedan ekosonden 90° för att ändra till kortaxeln view.
- Använd endast det fina rörelsesystemet för kaudal- till rostralaxeln i djurstadiet, justera den korta axeln view till den papillära muskelnivån. Ändra sedan bildläget till M-läge genom att trycka på M-lägesknappen och spela in en video i 5 sekunder genom att trycka på Cine-loop-knappen .
- För att analysera och beräkna fraktionsförkortningen med hjälp av programvaran, tryck på mätknappen och ett vertikalt linjeverktyg för att definiera de endsystoliska och slutdiastoliska inre dimensionerna för vänster kammare. Programvaran beräknar automatiskt procentuell fraktionsförkortning (FS).
- Sänk isoflurankoncentrationen till 0 % och vänta i cirka 5 minuter tills djuret återfår tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande.
6. Immunhistokemi
- Fäst den avlivade kroppen (utför eutanasi enligt steg 1.1.3) på bordet med hjälp av de avklippta kirurgiska tejperna, skär av hjärtana, tvätta med PBS och sänk ner hjärtat i 4 % paraformaldehyd/PBS.
- Dela upp hjärtana i tre sektioner, sänk ner dem i 40 % sackaros för kryoskydd, bädda in dem i en OCT-förening (optimal skärtemperatur) och frys dem vid −80 °C.
- Fäst de kryosektionerade vävnaderna (8 μm tjocklek) på aminosilanbelagda glasglas. Efter tillräcklig torkning med hjälp av icke-uppvärmd vind som genereras av en allmän hårtork, sänk ner glasskivorna i trisbuffrad koksaltlösning som innehåller 0.2 % Tween-20 (TBS-T).
- Sänk ner dem i en blockerande lösning i 30 minuter vid 25 °C. Häll 100 μl av den primära antikroppsinnehållande blockerande lösningen på objektglaset och inkubera över natten vid 4 °C med paraffinförsegling för att förhindra att antikroppslösningen sprids på vävnaden.
OBS: Antikroppskoncentrationen visas i materialtabellen. - Lägg objektglasen horisontellt i en handgjord låda med hög luftfuktighet och använd den naturliga ångan från vått papper för att förhindra avdunstning. Tvätta objektglasen tre gånger med TBS-T.
- Behandla med det sekundära antikroppsinnehållande blockerande medlet i 1 timme vid 25 °C på samma sätt som den primära antikroppen. Efter tre tvättar, observera fluorescenssignalerna med hjälp av ett fluorescensmikroskop och konfokallasermikroskop.
OBS: Antikroppskoncentrationen visas i materialtabellen. - Statistisk analys: För jämförelsen av cellvolymen, som visas i figur 3A, utför ett icke-parat t-test; För att bedöma hjärtats funktionella återhämtning efter administrering av kardiomyocyter med hjälp av metoden för långsam injektion, som visas i figur 4A, använd ett parat t-test. I detta arbete ansågs skillnader vara statistiskt signifikanta vid P < 0,01. Felstaplar representerar standardavvikelsen.
Representative Results
Effekter av den långsamma injektionen på cellöverlevnad och kollagendeposition
Neonatala kardiomyocytkulor märkta med PKH26 injicerades i normalt naket råttmyokardium med en normal eller långsam injektionsmetod. Resultaten visade att den långsamma injektionsmetoden signifikant ökade den transplanterade cellvolymen (Figur 3A) och signifikant minskade kollagendepositionen på plats typ I (Figur 3B).
Effekter av långsam injektion på behandlingseffekt i en råttinfarktmodell
Den ekokardiografstyrda långsamma injektionsmetoden användes för att injicera neonatala kardiomyocytbollar eller PBS(−) i de infarkterade hjärtana hos modellråttor. Den cellinjicerade gruppen uppvisade signifikant förbättring av hjärtats kontraktionsfunktion efter 2 månader (Figur 4A). Immunhistokemiska analyser avslöjade en sömlös förbindelse mellan de transplanterade cellerna och värdmyocyterna via interkalerade skivor som innehåller gap junctions (Figur 4B).
Figur 1: Schematisk bild av hela insprutningssystemet . (A) Apparat för huvudinsprutning. (B) Kylsystem för injektionsspruta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ekokardiografistyrd perkutan långsam injektion . A) Inställning av djuret, ekosonden och injektionsapparaten. (B) Ekokardiografisk bild av injektionssprutan och hjärtat. Observera att vänster och höger bild är desamma, men en gul linje har lagts till för att indikera nålens position. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekten av den långsamma injektionsmetoden på den transplanterade cellvolymen och kollagendepositionen. (A) De transplanterade cellvolymerna (N = 3) beräknades från seriesnitt. Felstaplarna anger standardavvikelser. *P < 0,01 i ett icke-parat t-test. B) Immunhistokemisk färgning av kollagen av typ I. Skalstapeln visar 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Förbättringar av hjärtfunktion och histologisk integration med kardiomyocytkulor inympade med den långsamma injektionsmetoden . (A) Representativa ekokardiografer i M-lägesvyer. Grafen visar övergången av fraktionsförkortningar i den kardiomyocytbolltransplanterade gruppen (heldragen röd linje; N = 4) och vehikelgrupp (cellsuspensionslösning för långsam injektion) (streckad blå linje; N = 3). Förkortningar: MI = hjärtinfarkt; Cx43 = connexin 43; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; PKH26 = röd fluorescerande cellmembranetikett. Felstaplarna anger standardavvikelserna. *P < 0,01 i ett parat t-test. (B) Immunhistokemiska analyser av förhållandet mellan de transplanterade kardiomyocytkulorna och värdkardiomyocyterna. De konventionella lasermikroskopiska observationerna med en 2x objektivlins visas i den vänstra kolumnen. Inzoomade versioner (med en 20x objektivlins) av två områden som visas i rutan, märkta med * och #, presenteras nedan. Skalstaplar: toppbild = 300 μm; * och # = 30 μm. Konfokala lasermikroskopiska bilder med en 20x objektivlins visas tillsammans för jämförelse. Tre positioner visas. I de sammanslagna bilderna indikerar pilspetsarna förekomsten av gap junctions (Cx43) som direkt förbinder transplantatet och värdkardiomyocyterna. Skalstapeln visar 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande video 1: Ekostyrd långsam injektionsmetod. Ekokardiogrammet i B-läge framifrån visar injektionsnålspetsen framskjuten in i hjärtmuskeln. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
En av de kritiska punkterna för att den långsamma injektionsmetoden ska fungera framgångsrikt är att förbereda ett effektivt injektionssystem med hjälp av en kraftfull sprutpump och ett starkt trycköverföringsrör. Ett högtryckssystem krävs för att trycka ut gelén från spetsen av en fin nål. Den andra kritiska punkten är stabiliseringen av hjärtat. Hjärtats slag mot en injektionsnål som förs in i hjärtmuskeln kan skada vävnaden. I denna studie genomfördes en ekostyrd injektion för att undvika att djuren genomgick en andra öppen bröstskada och för att administrera cellinjektionen i ett stabiliserat hjärta med uppblåsta lungor. I vissa tillämpningar för större djur eller människor bör dessutom vissa injektionsanordningar som fästs på hjärtat övervägas som en del av den strategiska utformningen av tillämpningen. För injektioner med öppen bröstkorg i hjärtat på små djur rekommenderas användning av en lång, flexibel nål med tanke på deras högre hjärtfrekvens.
I detta arbete ökade den långsamma injektionsmetoden signifikant den överlevande kardiomyocytvolymen jämfört med den normala injektionsmetoden. Den normala injektionen orsakar cellskador via skjuvspänning15. Däremot orsakar den långsamma injektionsmetoden inte sådan stress teoretiskt eftersom den använder en icke-newtonsk lösning utöver den långsamma injektionen.
När det gäller lokal fibros uppvisade det interstitiella utrymmet runt de normalt injicerade överlevande kardiomyocyterna en stark och utbredd kollagenavlagring av typ I. Däremot var kollagensignalerna av typ I runt de transplanterade kardiomyocyterna som transplanterades med den långsamma injektionsmetoden mycket svagare och mer begränsade. Detta tyder på att den långsamma injektionsmetoden orsakade betydligt mindre skada. Den långsamma injektionen av neonatala kardiomyocyter i hjärtmuskeln hos vuxna förbättrade signifikant det infarktdrabbade hjärtats kontraktila funktion. De histologiska analyserna tydde på att ympning av kardiomyocyterna med hjälp av den långsamma injektionsmetoden resulterade i direkta förbindelser och funktionell koppling till värdkardiomyocyterna. Detta fenomen förklarar mekanismen för den funktionella återhämtningen av värdmyokardiet. Så vitt vi vet är detta den första rapporten om transplanterade neonatala kardiomyocyter med storskaliga sömlösa kopplingar till de vuxna kardiomyocyterna. De funktionella kopplingarna till värdmyokardium via elektrisk och mekanisk koppling kan få de transplanterade kardiomyocyterna att mogna och göra det möjligt för dem att fungera som funktionella myocyter som bidrar till värdens hjärtfunktion. Långsiktiga fysiska kraftinteraktioner mellan värden och transplantatets kardiomyocyter är avgörande för full mognad. Därför kan det behövas 2 månader efter injektionen för funktionell återhämtning av det infarktdrabbade hjärtat. Den tidsberoende återhämtningen av patientens hjärtfunktion kan vara ett förväntat fenomen i terapeutiska tillämpningar, och detta kan vara ett kännetecken för den framgångsrika etableringen av de novo-funktionell koppling och integration mellan värden och transplanterade kardiomyocyter.
Den långsamma injektionsmetoden kan utföras under öppen bröstkirurgi. Dessutom kan denna metod tillämpas på möss. För framtida tillämpningar inom humanterapi behöver vi fortfarande lösa flera problem. Injektionshastigheten bör optimeras genom att hänsyn tas till buffertkapaciteten hos det interstitiella vätskeflödet i varje humant målorgan. Xenofria material, t.ex. humangelatin eller biologiskt nedbrytbara syntetiska material, bör användas. Klinisk GMP-klassad apparat för långsam injektion, t.ex. kompakta organspecifika engångsverktyg eller en återanvändbar apparat som kan användas med breda organ, bör utvecklas.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ett anslag från JSPS KAKENHI (anslag nr 23390072 och 19K07335) och AMED (anslag nr A-149).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
| 29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
| A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
| Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
| alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
| Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
| Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
| blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
| collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
| confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
| fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
| fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
| fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
| gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
| Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
| non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
| peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
| syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
| syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
| tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
| trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
| Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
| veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
| Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |
References
- Chavkin, N. W., et al. The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation. Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904 (2021).
- Li, H., et al. The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-κB signaling to control kidney fibrosis. Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).
- Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. The role of monocytes in optic nerve injury. Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).
- Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473 (2023).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Hattori, F., Fukuda, K. Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols. Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).
- Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).
- Fernandes, S., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Wendel, J. S., et al. Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model. Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).
- Hattori, F. Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).
- Tao, S., et al. Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance. JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).
- Hattori, F. How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes. Cardiac Regeneration using Stem Cells. Fukuda, K., Yuasa, S. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).
