Summary
Denne metode eliminerer enhver større invasion under celleinjektioner forårsaget af cellesuspensionsopløsningen.
Abstract
Direkte injektion af celler i væv er en nødvendig proces i celleadministration og / eller substitutionsterapi. Celleinjektionen kræver en tilstrækkelig mængde suspensionsopløsning for at tillade cellerne at komme ind i vævet. Suspensionsopløsningens volumen påvirker vævet, og dette kan forårsage større invasiv skade som følge af celleinjektionen. Dette papir rapporterer om en ny celleinjektionsmetode, kaldet langsom injektion, der sigter mod at undgå denne skade. Imidlertid kræver det en tilstrækkelig høj injektionshastighed i henhold til Newtons lov om forskydningskraft at skubbe cellerne ud af nålespidsen. For at løse ovenstående modsigelse blev en ikke-newtonsk væske, såsom gelatineopløsning, anvendt som cellesuspensionsopløsningen i dette arbejde. Gelatineopløsning har temperaturfølsomhed, da deres form skifter fra gel til sol ved ca. 20 °C. For at opretholde cellesuspensionsopløsningen i gelformen blev sprøjten derfor holdt afkølet i denne protokol; Men når opløsningen blev injiceret i kroppen, konverterede kropstemperaturen den til en sol. Den interstitielle vævsvæskestrøm kan absorbere overskydende opløsning. I dette arbejde tillod den langsomme injektionsteknik kardiomyocytkugler at komme ind i værtsmyokardiet og engraft uden omgivende fibrose. Denne undersøgelse anvendte en langsom injektionsmetode til at injicere oprensede og kugleformede neonatal rottekardiomyocytter i et fjerntliggende område af myokardieinfarkt i det voksne rottehjerte. 2 måneder efter injektionen viste hjerterne i de transplanterede grupper signifikant forbedret kontraktil funktion. Desuden afslørede histologiske analyser af de langsomt injicerede hjerter sømløse forbindelser mellem værts- og graftkardiomyocytterne via interkalerede diske indeholdende mellemrumsforbindelsesforbindelser. Denne metode kan bidrage til næste generations celleterapier, især inden for hjerteregenerativ medicin.
Introduction
Celleadministration og udskiftning er lovende nye terapeutiske strategier for stærkt beskadigede organer. Blandt disse nye terapeutiske strategier har hjerteregenerativ medicin tiltrukket sig stor opmærksomhed. Imidlertid medierer betændelsen forårsaget af skader ardannelse i flere organer 1,2,3,4. Det menneskelige hjerte består af ca. 1010 kardiomyocytter; Derfor skal teoretisk 5,6 behandles med mere end 109 kardiomyocytter. Administration af et stort antal kardiomyocytter via traditionelle injektionsmetoder kan føre til betydelige vævsskader7. Denne metode giver en ny celleinjektionsmetode med minimal vævsinvasion.
Celleadministration i organets parenchyma kræver injektion(er). Der er imidlertid en uoverensstemmelse i, at selve injektionen kan føre til vævsskade. Vævsskade forårsager lokal betændelse og uhelbredelig ardannelse i organer og væv samt nedsat regenerativ evne 8,9,10. Pattedyrs hjerte har en ekstremt høj tilbøjelighed til at udvikle ar i stedet for at regenerere, fordi det kræver øjeblikkelig skadereparation for at udholde det høje blodtryk forårsaget af dets kontinuerlige pumpefunktion11. Ablationsterapi udnytter denne høje tilbøjelighed til ardannelse og blokerer kredsløbet, der sandsynligvis vil gennemgå ardannelse ved hjælp af arytmi12. I en tidligere undersøgelse blev det observeret, at arvævet isolerede de injicerede kardiomyocytter i værtsmyokardiet. Dette repræsenterer således det næste målproblem, der skal overvindes for at opnå forbedret terapeutisk effekt i hjerteregenerativ medicin.
Vævets interstitielle væskestrøm spiller en afgørende rolle i transporten af ilt og næringsstoffer til celler og fjernelse af det udskillede affald fra celler. Den fysiologiske hastighed af interstitiel væskestrøm i hvert væv/organ er forskellig (intervallet er 0,01-10 μm/s)13. Så vidt forfatteren ved, er der ingen data om de enkelte vævs/organers evne til at understøtte ekstra mængder væske uden patologisk ødem; Dette eksperiment forsøger imidlertid at bruge en langsom injektionshastighed til muligvis at reducere vævsskade, og resultaterne kan bruges til at bestemme det praktiske ved dette koncept.
Protocol
Dyreforsøgene blev udført i henhold til Kansai-Medical Universitys etiske retningslinjer for dyreforsøg og blev godkendt af de etiske komitéer (godkendelsesnummer: 23-104). Alle dyrene blev opdrættet under en konstant lys-mørk cyklus i et specifikt patogenfrit miljø. Alle de steriliserede kirurgiske værktøjer, såsom saks, tang og retraktorer, blev autoklaveret og tørret grundigt.
1. Forberedelse af neonatal rottekardiomyocytkugler
- Neonatal rottehjerte samling
- For hjerteindsamlingen skal du følge en procedure, der ligner den, der er beskrevet i en tidligere rapport7.
- Dyp neonatal (0-2 dage efter fødslen) Sprague-Dawley (SD) rotter i povidon-jod og 70% ethanolopløsninger sekventielt, og overfør dem derefter til en lufttæt kasse fyldt med fordampet isofluran (koncentrationen skal være over 10% v / v) til dyb anæstesi.
- Efter bekræftelse af bevidstløshed ved tab af lokomotorisk aktivitet, halshug rottenmens du holder kroppen bagfra med hånden, og skær derefter 2-4 mm væv fra brystkassens frontale centrum til kaudale og derefter i rostral retning ved hjælp af skarp saks.
- Tag fat i ryghuden for at trække snittet åbent og skubbe hjertet ud af brystkassen. Skær ventriklerne ved hjælp af en saks og nedsænk dem i fosfatbufret saltvand (PBS) uden calcium eller magnesium (PBS (−)).
- Spredning af de neonatale rottekardiomyocytter
- Hak de indsamlede ventrikler dispergeret i en minimal mængde Ads-buffer (Annoncebuffer: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mMNaH2PO 4, 5,6 mM glucose,5,4 mM KCl, 0,8 mMMgSO4, pH 7,35) i et autoklaveret konkavt glas i små stykker (1 mm x 1 mm) ved hjælp af buet saks.
- Det hakkede væv og en mikromagnetisk omrører overføres til et 50 ml centrifugeringsrør, og vævene fordeles i enkeltceller med 0,1 % kollaganase, 0,1 % trypsin, 20 μg/ml DNase I og 50 nM tetramethylrhodaminmethylester i Ads-buffer ved 37 °C under omrøring i 30 minutter.
- Adskil aggregaterne og de dispergerede celler gennem naturlig sedimentering, saml kun de dispergerede celler i et rør, og fordøje de resterende celleaggregater igen med det samme fordøjelsesmedium.
- Fortsæt denne procedure, indtil alle cellerne er fuldstændigt dissocieret. For at bekræfte den fuldstændige spredning af cellerne skal du observere rørene under et mikroskop (4x objektiv linse).
- Opsaml de dispergerede celler ved hjælp af centrifugering ved 150 x g i 5 minutter og dissocier dem i 1-2 ml annoncebuffer.
- Fluorescensaktiveret cellesortering af kardiomyocytter
- Analyser cellerne ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) ved hjælp af 556-601 nm båndpasfiltre til at detektere røde fluorescenssignaler.
- Udfør forsigtigt pre-gating for at eliminere dublerede fraktioner14. Portindstillingerne for dobbelteliminering skal være i henhold til producentens anvisninger.
- Indstil spredningen fremad på x-aksen og det røde fluorescenssignal på y-aksen. Tre populationer blev observeret: en lavere population indeholdende erytrocytter og døde celler, en mellempopulation indeholdende ikke-kardiomyocytter, herunder fibroblaster og endotelceller, og en toppopulation indeholdende rene ventrikulære kardiomyocytter7.
- Fremstilling af røde fluorescensmærkede kardiomyocytkugler
- Selektivt sorteres kardiomyocytterne, og centrifugeres i 5 minutter ved 150 x g. Cellepillerne opløses fuldstændigt i 1 ml alfamodificeret minimalt essentielt medium (alfa-MEM) indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS).
- Cellekoncentrationen måles ved hjælp af et hæmocytometer og cellesuspensionsopløsningen fortyndes til 3.000 celler/ml med alfa-MEM 10% FBS.
- De fordeles i celleplader uden klæbende 96 brønde (100 μL pr. hul), centrifugeres i 5 minutter ved 100 x g og opvarmes til 2-3 d i en cellekulturinkubator med 5 % CO2 ved 37 °C.
- Før injektionsforsøgene høstes en kardiomyocytkugle fra hver brønd via aspiration med dyrkningsmediet ved hjælp af en 1.000 μL pipette, og de samles i et 15 ml rør.
- Plet med PKH26 efter producentens anvisninger til sporing efter engraftment.
2. Forberedelser til langsom injektionsmetode
- Fremstilling af gelatinestamopløsningen
- Vej gelatinen, opløs den i Ads-buffer for at producere en 10% w/v-opløsning, og autoklav den.
- Fremstilling af en celleinjektionsanordning
- Samlet enhedsdesign: Klargør apparatet vist i figur 1. Dette system kombineres med et sprøjtekøleapparat og hovedinjektionsapparat.
- Forbered det nedenfor beskrevne hovedinjektionsapparat:
- Til en neonatal kardiomyocytkugleinjektion skal du bruge en 29 G, 50 mm lang nål udstyret med en sprøjte.
- Tilslut en strømoverførselssprøjte (18G, 1 ml) ryg mod ryg ved hjælp af en celleinjektionssprøjte (figur 1). Tilslut nålen på kraftoverførselssprøjten til et tyndt polypropylenrør med lav lumen udvidelsesevne.
- Tilslut derefter den anden side af strømoverføringsrøret til nålen på den samme sprøjte (18G, 1 ml), og sæt den i en sprøjtepumpe. Fyld de to strømoverførselssprøjter og tuber med vand uden luftbobler.
BEMÆRK: Når det ene stempel på kraftoverføringssprøjten skubbes ind, overføres trykket direkte til den anden sprøjte, og stemplet stikker ud.
- Opsæt injektionssprøjtens kølesystem som beskrevet nedenfor.
- Vind et kobberrør (udvendig diameter = 1 mm; indvendig diameter = 0,3 mm; tykkelse = 0,35 mm) tæt omkring den celleholdige del af celleinjektionssprøjten, så der efterlades 10 mm overskydende rør i begge ender.
- Tilslut kobberrøret til fleksible plastrør. Tilslut yderligere de andre ender af plastslangen til en ekstern pumpe, fyld ledningen med kølevand og afkøl vandet ved at nedsænke det overskydende kobberrør i knust is (figur 1).
BEMÆRK: Dette kølesystem opretholder celleophængsopløsningen i cylinderen ved ca. 2 °C.
3. Udvikling af en rotte myokardieinfarktmodel ved stump koronararterieokklusion
- Bedøv nøgne hanrotter med immunmangel (F344/Njcl-rnu/rnu) med luft indeholdende 3% isofluran. Indsæt en kanyle i luftrøret og tilslut den til åndedrætsorganet.
- Tilslut en kanyle til en isofluranfordamper med en regulator for at opretholde en 3% isoflurankoncentration og dermed opretholde tilstrækkelig bedøvelse. Bekræft intet svar på smertestimuli. Påfør dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed.
- Fastgør lemmerne med skårne kirurgiske bånd på en 40 ° C opvarmet kirurgisk plade. Drej rottens krop til højre for kropsaksen og brug venstre armhule som det kirurgiske felt.
- Fjern håret i det kirurgiske felt ved hjælp af en hårfjerningscreme og tør huden med povidon-jod. Brug en skarp saks til at skære et 1,5 cm snit i huden og pectoralis major muskel.
- Bekræft det tredje interkostale rum og rip de interkostale muskler og costal pleura ved hjælp af mikrotang med stumpe spidser. Hold brystet åbent ved hjælp af en retraktor. Fjern forsigtigt det tynde perikardium med tang.
- For at konstruere en infarktmodel af hjertets laterale væg skal du finde positionen 1 mm kaudal til spidsen af venstre atrium for at identificere den stump koronararterie, passere en 7-0 silkesutur, øse væv, der er 2,5 mm bredt og 2,5 mm dybt fra dorsal til ventral, og ligere vævet tæt.
- Bekræft vellykket ligering ved den svage sammentrækning distal fra ligaturen. Når du forsigtigt har fjernet retraktoren, skal du placere en 5-0 silkesutur mellem det andet og fjerde interkostale rum og lukke thoracotomien.
- Sænk isoflurankoncentrationen til 1%. Sutur forsigtigt muskler og hud med 5-0 silke. Sænk isoflurankoncentrationen til 0 % og vent i ca. 5 minutter, indtil den spontane vejrtrækning starter.
- Topisk påføres 2 mg / ml lidokain i saltvand på snittet. Administrer 1 ml saltvand via en subkutan injektion. Påfør dyrlægesalve topisk for at forhindre infektioner.
- Fjern rotten fra intubationsrøret, og vend tilbage til dyreburet; Hæv derefter rotterne i individuelle bur i 1 uge.
- Analyser ændringerne i hjertets systoliske pumpefunktion ved hjælp af ekkokardiografi.
BEMÆRK: Hjertefunktionen vil blive reduceret på grund af lateralt myokardieinfarkt.
4. Ekkostyret perkutan celletransplantation ved hjælp af langsom injektionsmetode
- Forvarm 10% gelatinefond ved 37 °C, indtil den bliver flydende.
- Fortynd 10% gelatinefond med forvarmet Ads-buffer for at opnå den endelige injicerbare 5% w / v gelatineopløsning (100 μL kræves pr. Dyr).
- Suspender 96 kardiomyocytkugler (i alt: 28.800 kardiomyocytter/dyr) i 100 μL forvarmet injektionsopløsning.
- Læg suspensionen fremstillet i trin 4.3 i celleinjektionssprøjten, idet du undgår aspiration af overskydende luft.
- For at fjerne bobler i sprøjten skal du holde den lodret med kanylen opad, banke på sprøjten og samle eventuelle bobler på sprøjtens øverste ryg.
BEMÆRK: I løbet af dette trin skal du observere, at kardiomyocytkuglerne gradvist sætter sig på stemplets gummitætning. - Bevar sprøjtens lodrette position, tryk langsomt stemplet op, og kassér boblerne og den overskydende cellesuspensionsopløsning, indtil 20 μL af cellesuspensionen forbliver i sprøjten. Tryk forsigtigt på stemplet med konstant hastighed, så kardiomyocytkuglen forbliver hvilende på stemplets gummipakning.
- Nedsænk sprøjten med låg direkte i et isbad i 5 min.
- Anbring en afkølet sprøjte i injektionsapparatet. Fastgør injektionssprøjteapparatet tæt, der er fastgjort på en fin bevægelsesanordning på dyrestadiet ved hjælp af en X-Y-Z positionsjusterbar håndlavet klemme. Finbevægelsesenheden kan flytte nålepositionen ved hjælp af x-retning 20 mm glide, y-retning sving og z-retning buebevægelser.
- Bedøv rotterne i en forseglet kasse fyldt med luft indeholdende 3% isofluran. Bekræft anæstesi uden svar på smertestimuli. Påfør dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed.
- Fastgør lemmerne med skårne kirurgiske bånd på en 40 ° C opvarmet ekkoplade. For at opretholde tilstrækkelig bedøvelse skal du sikre dig, at den indåndede luft indeholder en koncentration af isofluran på ca. 3%.
- Fjern håret ved injektionsfeltet (2 cm i diameter) og brystet med hårfjerningscreme og tør huden med povidon-jod.
- Påfør ekko-gel på brystet og ekko sonde. Placer ekkosonden tæt på brystet langs kranie- og kaudale akser, og begynd at opnå B-mode ekkokardiografi efter producentens manual.
- Før spidsen af kanylen ind i myokardiet set forfra (figur 2 og supplerende video 1).
- For at aktivere hovedsprøjtepumpen skal du trykke på Start-knappen og dreje drejeknappen for at justere til et forudbestemt tal for en injektionshastighed på ca. 0,02 μL/s. Påfør dyrlægesalve topisk omkring nålepositionen for at forhindre infektioner.
BEMÆRK: Det er nødvendigt at bestemme det passende opkaldsnummer for den tilsigtede injektionshastighed ved hjælp af en injektionsopløsning. Efter injektionen fjernes kanylen ved hjælp af et eksemplarisk bevægelsessystem. - Sænk isoflurankoncentrationen til 0 % og vent i ca. 5 minutter, indtil dyret genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende.
5. Evaluering af hjertefunktion
- Bedøv rotterne i en forseglet kasse fyldt med luft indeholdende 3% isofluran. Bekræft anæstesi uden svar på smertestimuli. Påfør dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed.
- Påfør elektrificerende creme til EKG-erhvervelse på lemspidserne. Fastgør lemmerne med skårne kirurgiske bånd på en 40 ° C opvarmet ekkoplade. Brug et fysiologisk overvågningssystem til at registrere EKG og puls i realtid.
- I henhold til producentens anvisninger skal du først bestemme den lange aksevinkel ved hjælp af B-mode ekkobilledet, der viser venstre ventrikulær spids til udstrømningskanalen, og drej derefter ekkosonden 90 ° for at skifte til kortaksevisningen.
- Brug kun det kaudale til rostralakse fine bevægelsessystem i dyrestadiet, juster kortaksevisningen til papillærmuskelniveauet. Skift derefter billedtilstanden til M-tilstand ved at trykke på M-tilstandsknappen , og optag en video i 5 sekunder ved at trykke på Cine-loop-knappen .
- For at analysere og beregne brøkforkortelsen ved hjælp af softwaren skal du trykke på knappen Mål og et lodret linjeværktøj for at definere de endesystoliske og endediastoliske venstre ventrikulære indre dimensioner. Softwaren beregner automatisk den procentvise fraktionsforkortelse (FS).
- Sænk isoflurankoncentrationen til 0 % og vent i ca. 5 minutter, indtil dyret genvinder tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende.
6. Immunhistokemi
- Fastgør den aflivede krop (udfør eutanasi som i trin 1.1.3) på bordet ved hjælp af de skårne kirurgiske bånd, skær hjerterne, vask med PBS og nedsænk hjertet i 4% paraformaldehyd / PBS.
- Disseker hjerterne i tre sektioner, nedsænk dem i 40% saccharose til kryobeskyttelse, indlejr i en optimal skæretemperaturforbindelse (OCT), og frys dem ved -80 °C.
- Fastgør det kryosektionerede væv (8 μm tykkelse) til aminosilanbelagte glasglas. Efter tilstrækkelig tørring ved hjælp af ikke-opvarmet vind genereret af en generel hårtørrer, nedsænkes glasobjektglassene i tris-bufret saltvand indeholdende 0,2% Tween-20 (TBS-T).
- Nedsænk dem i en blokerende opløsning i 30 minutter ved 25 °C. 100 μL af den primære antistofholdige blokerende opløsning hældes på objektglasset, og der inkuberes natten over ved 4 °C paraffinforsegling for at holde antistofopløsningen spredt på vævet.
BEMÆRK: Antistofkoncentrationen er vist i materialetabellen. - Læg diasene vandret i en håndlavet kasse med høj luftfugtighed ved hjælp af den naturlige damp fra vådt papir for at forhindre fordampning. Vask diasene tre gange med TBS-T.
- Det sekundære antistofholdige blokeringsmiddel behandles i 1 time ved 25 °C på samme måde som det primære antistof. Efter tre vaske observeres fluorescenssignalerne ved hjælp af et fluorescensmikroskop og konfokal lasermikroskop.
BEMÆRK: Antistofkoncentrationen er vist i materialetabellen. - Statistisk analyse: Til sammenligning af cellevolumen, som vist i figur 3A, udføres en ikke-parret t-test; For at vurdere hjertets funktionelle restitution efter administration af kardiomyocytter ved hjælp af metoden med langsom injektion, som vist i figur 4A, anvendes en parret t-test. I dette arbejde blev forskelle betragtet som statistisk signifikante ved P < .01. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelsen.
Representative Results
Virkninger af den langsomme injektion på celleoverlevelse og kollagenaflejring
Neonatal rotte kardiomyocytkugler mærket med PKH26 blev injiceret i normalt nøgen rotte myokardium ved hjælp af en normal eller langsom injektionsmetode. Resultaterne viste, at metoden med langsom injektion signifikant øgede det indpodede cellevolumen (figur 3A) og signifikant reducerede type I-kollagenaflejring på stedet (figur 3B).
Virkninger af langsom injektion på behandlingseffekten i en rotteinfarktmodel
Den ekkokardiograf-guidede langsomme injektionsmetode blev brugt til at injicere neonatal rottekardiomyocytkugler eller PBS (−) i de infarktede hjerter hos modelrotter. Den celleinjicerede gruppe alene udviste signifikant forbedring i hjertekontraktionsfunktionen efter 2 måneder (figur 4A). Immunohistokemiske analyser afslørede en sømløs forbindelse mellem de indpodede celler og værtsmyocytter via interkalerede diske indeholdende mellemrumskryds (figur 4B).
Figur 1: Skematisk oversigt over hele indsprøjtningssystemet . (A) Hovedinjektionsapparatur. (B) Kølesystem til injektionssprøjter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ekkokardiografi-vejledt perkutan langsom injektion . A) Indstilling af dyret, ekkosonden og injektionsapparaturet. (B) Ekkokardiografisk billede af injektionssprøjten og hjertet. Bemærk, at venstre og højre billede er de samme, men der er tilføjet en gul linje for at angive nålens position. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Effekt af metoden med langsom injektion på det podede cellevolumen og kollagenaflejringen. (A) De indpodede cellevolumener (N = 3) blev beregnet ud fra serielle sektioner. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelser. *P < 0,01 i en ikke-parret t-test. B) Immunohistokemisk farvning af type I-kollagen. Skalabjælken angiver 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Forbedringer i hjertefunktion og histologisk integration med kardiomyocytkugler podet ved langsom injektionsmetode . (A) Repræsentative ekkokardiograf M-mode visninger. Grafen viser overgangen af fraktionsforkortelser i den kardiomyocytkugletransplanterede gruppe (solid rød linje; N = 4) og køretøjsgruppe (celleophængsopløsning til langsom injektion) gruppe (stiplet blå linje; N = 3). Forkortelser: MI = myokardieinfarkt; Cx43 = connexin 43; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; PKH26 = rød fluorescerende cellemembranetiket. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelserne. *P < 0,01 i en parret t-test. B) Immunohistokemiske analyser af forholdet mellem de indpodede kardiomyocytkugler og værtskardiomyocytter. De konventionelle lasermikroskopiske observationer ved hjælp af en 2x objektivlinse er vist i venstre kolonne. Zoomede versioner (ved hjælp af et 20x objektivobjektiv) af to områder vist i boksen, mærket med * og #, er præsenteret nedenfor. Skalabjælker: øverste billede = 300 μm; * og # = 30 μm. Konfokale lasermikroskopiske billeder ved hjælp af en 20x objektivlinse vises sammen til comaparison. Tre positioner vises. I de fusionerede billeder angiver pilespidserne eksistensen af mellemrumskryds (Cx43), der direkte forbinder transplantatet og værtskardiomyocytterne. Skalabjælken angiver 30 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1: Ekkostyret langsom injektionsmetode. B-mode ekkokardiogrammet i frontal visning viser injektionsnålens spids avanceret ind i myokardiet. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Et af de kritiske punkter i den vellykkede udførelse af den langsomme injektionsmetode er forberedelsen af et effektivt injektionssystem ved hjælp af en kraftig sprøjtepumpe og et stærkt trykoverførselsrør. Et højtrykssystem er nødvendigt for at skubbe gel ud fra spidsen af en fin nål. Det andet kritiske punkt er stabiliseringen af hjertet. Hjertets slag mod en injektionsnål, der er avanceret ind i myokardiet, kan skade vævet. I denne undersøgelse blev der udført en ekkostyret injektion for at undgå, at dyrene gennemgik en anden åben brystskade og for at administrere celleinjektionen i et stabiliseret hjerte med lungerne oppustet. I nogle anvendelser til større dyr eller mennesker bør nogle injektionsanordninger, der er fastgjort til hjertet, desuden overvejes som en del af applikationens strategiske design. Til åbne brystinjektioner i små dyrs hjerter anbefales brug af en lang, fleksibel nål på grund af deres højere hjertefrekvens.
I dette arbejde øgede den langsomme injektionsmetode signifikant det overlevende kardiomyocytvolumen sammenlignet med den normale injektionsmetode. Den normale injektion forårsager celleskader via forskydningsspænding15. I modsætning hertil forårsager den langsomme injektionsmetode ikke sådan stress teoretisk, fordi den bruger en ikke-newtonsk opløsning ud over den langsomme injektion.
Med hensyn til lokal fibrose viste det interstitielle rum omkring de normalt injicerede overlevende kardiomyocytter stærk og udbredt type I kollagenaflejring. I modsætning hertil var type I-kollagensignalerne omkring de indpodede kardiomyocytter podet ved hjælp af den langsomme injektionsmetode meget svagere og mere begrænsede. Dette tyder på, at den langsomme injektionsmetode forårsagede betydeligt mindre skade. Den langsomme injektion af neonatale kardiomyocytter i det voksne myokardium forbedrede signifikant kontraktilfunktionen af det infarkte hjerte. De histologiske analyser antydede, at podning af kardiomyocytterne ved hjælp af langsom injektionsmetode resulterede i direkte forbindelser og funktionel kobling med værtskardiomyocytterne. Dette fænomen forklarer mekanismen for funktionel genopretning af værtsmyokardiet. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om indpodede neonatale kardiomyocytter med store sømløse forbindelser til værtsvoksne kardiomyocytter. De funktionelle forbindelser med værtsmyokardiet via elektrisk og mekanisk kobling kan gøre de indpodede kardiomyocytter modne og give dem mulighed for at fungere som funktionelle myocytter, der bidrager til værtshjertefunktionen. Langsigtede fysiske kraftinteraktioner mellem værts- og transplantatkardiomyocytter er afgørende for fuld modning. Derfor kan det være nødvendigt med 2 måneder efter injektionen for funktionel genopretning af det infarkterede hjerte. Den tidsafhængige genopretning af patientens hjertefunktion kan være et forventet fænomen i terapeutiske anvendelser, og dette kan være et kendetegn ved en vellykket etablering af de novo funktionel kobling og integration mellem værten og podede kardiomyocytter.
Den langsomme injektionsmetode kan udføres under åben brystkirurgi. Desuden kan denne metode anvendes på mus. For fremtidige anvendelser inden for human terapi skal vi stadig løse flere problemer. Injektionshastigheden bør optimeres ved at overveje bufferkapaciteten af den interstitielle væskestrøm i hvert humant målorgan. Der bør anvendes xenofrie materialer, såsom gelatine fra mennesker eller biologisk nedbrydelige syntetiske materialer. Der bør udvikles kliniske apparater til langsom injektion af GMP-kvalitet, såsom kompakte organspecifikke engangsværktøjer eller et genanvendeligt apparat til brede organer.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra JSPS KAKENHI (bevilling nr. 23390072 og 19K07335) og AMED (bevilling nr. A-149).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18-gauge needle & tuberculin, 1 mL | Terumo | NN1838R, SS-01T | |
| 29-gauge 50 mm-long needle | Ito Corporation, Tokyo, Japan | 14903 Type-A | |
| A copper tube | General Suppliers | outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm | |
| Ads Buffer | Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35 | |
| alpha-MEM | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 051-07615 | |
| Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L) | Proteintech | 14695-1-AP | using dilution 1:100 |
| Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L) | Sigma Aldrich | C6219 | using dilution 1:100 |
| Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | using dilution 1:300 |
| blocking solution (Blocking One) | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 03953-95 | |
| collagenase | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 034-22363 | |
| confocal laser microscope | Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany | LSM510 META | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| FACS Aria III | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | ||
| fetal bovine serum | BioWest, FL, USA | S1820-500 | |
| fine movement device (Micromanipulator) | Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan | M-44 | |
| fluorescence microscope | Nikon Instruments, Tokyo, Japan | Eclipse Ti2 | |
| gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | G9382 | dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it |
| Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats | Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan | 0–2 d after birth | |
| non-adhesive 96-well plates (spheloid plate) | Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan | MS-0096S | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA | Tissue-Tek OCT compound | |
| peristaltic pump (for cooling system) | As One Co., Osaka, Japan | SMP-23AS | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2 | Chemglass life sciences LLC, NJ, USA | CG-2003-120 | |
| syringe | Ito Corporation, Tokyo, Japan | MS-N25 | |
| syringe pump with remote controller | As One Co., Osaka, Japan | MR-1, CT-10 | |
| tetramethylrhodamine methyl ester | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | T668 | |
| trypsin | DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA | 215240 | |
| Tween-20 | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 167-11515 | |
| veterinarian ointment | Fujita Pharmaceutical Co., Ltd. | Hibikusu ointment #WAK-95832 | |
| Vevo 2100 Imaging System | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0 | Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada | Vevo 2100 | |
| Weakly curved needle with ophthalmic thread | Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan | C7-70 |
References
- Chavkin, N. W., et al. The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation. Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904 (2021).
- Li, H., et al. The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-κB signaling to control kidney fibrosis. Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).
- Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. The role of monocytes in optic nerve injury. Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).
- Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473 (2023).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Hattori, F., Fukuda, K. Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols. Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).
- Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).
- Fernandes, S., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Wendel, J. S., et al. Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model. Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).
- Hattori, F. Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).
- Tao, S., et al. Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance. JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).
- Hattori, F. How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes. Cardiac Regeneration using Stem Cells. Fukuda, K., Yuasa, S. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).
