Summary
Denne artikel beskriver brugen af et softwareprogram, mAbScale, til beregning af masser til monoklonal antistofbaseret proteinterapi.
Abstract
Bioterapeutiske masser er et middel til at verificere identitet og strukturel integritet. Massespektrometri (MS) af intakte proteiner eller proteinunderenheder giver et let analytisk værktøj til forskellige stadier af biofarmaceutisk udvikling. Proteinets identitet bekræftes, når den eksperimentelle masse fra MS ligger inden for et foruddefineret massefejlområde af den teoretiske masse. Mens der findes flere beregningsværktøjer til beregning af protein- og peptidmolekylvægte, er de enten ikke designet til direkte anvendelse på bioterapeutiske enheder, har adgangsbegrænsninger på grund af betalte licenser eller kræver upload af proteinsekvenser til værtsservere.
Vi har udviklet en modulær masseberegningsrutine, der muliggør nem bestemmelse af de gennemsnitlige eller monoisotopiske masser og elementære sammensætninger af terapeutiske glycoproteiner, herunder monoklonale antistoffer (mAb), bispecifikke antistoffer (bsAb) og antistof-lægemiddelkonjugater (ADC). Den modulære karakter af denne Python-baserede beregningsramme vil gøre det muligt at udvide denne platform til andre modaliteter såsom vacciner, fusionsproteiner og oligonukleotider i fremtiden, og denne ramme kan også være nyttig til søgning i top-down massespektrometridata. Ved at oprette en open source standalone desktop-applikation med en grafisk brugergrænseflade (GUI) håber vi at overvinde begrænsningerne omkring brug i miljøer, hvor proprietære oplysninger ikke kan uploades til webbaserede værktøjer. Denne artikel beskriver algoritmerne og anvendelsen af dette værktøj, mAbScale, til forskellige antistofbaserede terapeutiske modaliteter.
Introduction
I løbet af de sidste to årtier har bioterapi udviklet sig til at blive en grundpille i den moderne farmaceutiske industri. SARS-CoV2-pandemien og andre livstruende tilstande har yderligere øget behovet for hurtigere og bredere udvikling af biofarmaceutiske molekyler 1,2,3.
Den bioterapeutiske molekylvægt er kritisk for identifikationen af molekylet i kombination med andre analytiske assays. De intakte og reducerede underenhedsmasser anvendes gennem hele opdagelses- og udviklingslivscyklussen som en del af kontrolstrategier, der sigter mod at opretholde kvaliteten, som beskrevet i QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Analytisk udvikling i den biofarmaceutiske industri er stærkt afhængig af massemålinger til intakt masseanalyse og dyb karakterisering ved hjælp af peptidkortlægning eller multi-attributmetode (MAM) overvågning. I centrum for disse teknikker, der anvender moderne massespektrometri (MS) platforme, er evnen til at levere højopløsnings nøjagtige massemålinger (HR / AM). De fleste HR/AM-instrumenter giver massenøjagtigheder i området 0,5-5 ppm, som skaleres med masseområdet. Evnen til at måle masser nøjagtigt for intakte store molekyler muliggør hurtig og sikker identifikation af stormolekylær terapi. Da isotopopløsning ikke kan opnås ved hjælp af typiske forsøgsbetingelser for store molekyler (>10 kDa), skal gennemsnitsmasserne beregnes med henblik på sammenligning og identifikation 5,6.
Et typisk intakt eller underenhedsproteinmassespektrum repræsenterer den overordnede proteoformprofil, som indeholder sammensat information om de forskellige molekylære former, der er resultatet af posttranslationelle modifikationer (PTM) og eventuelle primære strukturforskelle, såsom klip eller sekvensvarianter. Disse målingers relativt lette og høje kapacitet gør dem attraktive til karakterisering og som procesovervågningskontrol 7,8. Dataanalyse for disse eksperimenter kræver normalt, at brugeren definerer søgerummet for molekylære former (række PTM'er eller andre molekylære former). For glykosylerede proteiner er dette søgerum i høj grad drevet af glycoform heterogenitet. Kombinationer af flere PTM'er, disulfidbindingskonfigurationer og andre variationer langs den primære struktur gør beregning af alle mulige molekylære former til en kedelig opgave. Derfor er den manuelle beregning af de mulige molekylære former en tids- og ressourcekrævende proces med et stort potentiale for menneskelige fejl.
Her præsenterer vi et masseberegningsværktøj, der blev udviklet i betragtning af de vigtigste træk ved bioterapeutiske molekyler, såsom mAbs, bsAbs, ADC'er osv. Værktøjet giver mulighed for nem inkorporering af søgerumsvariabler til konsekvent beregning af masser og elementære sammensætninger. Dette værktøjs modulære karakter vil gøre det muligt at videreudvikle det og anvende det til masseberegning og massematchning for andre metoder.
GUI-modulet giver brugeren mulighed for at specificere input til masseberegningen, som vist i figur 1; Specifikt indtaster brugeren aminosyresekvenser med et enkelt bogstav for lette og tunge antistofkæder. Almindelige ændringer til tung kæde N-terminal cyklisering og C-terminal lysin klipning er inkluderet som afkrydsningsfelter. Endvidere kan den kemiske formel / elementære sammensætning tilføjes / trækkes fra disse proteinkæder gennem den respektive Chem Mod-tekstboks . Dette giver brugeren fleksibilitet til at tilføje en elementær sammensætning, der inkluderer flere posttranslationelle modifikationer eller en nyttelast med små molekyler i tilfælde af en ADC. Da de fleste terapeutiske mAbs er konstrueret til at fjerne glykosyleringsstederne i lyskæden, er glykosylering i lyskæden valgfri og kan specificeres ved hjælp af et afkrydsningsfelt på GUI'en.
En typisk variation på intakt masseanalyse for antistoffer er en reduceret underenhedsmasseanalyse, hvor lyskæden løsnes fra den tunge kæde ved at reducere interchain-disulfidbindingerne. Afhængigt af styrken af det anvendte reduktionsmiddel kan intrachain-disulfidbindingerne muligvis spaltes. Brugerne har fleksibiliteten til at indtaste det samlede antal disulfidbindinger afhængigt af IgG-undertypen eller i tilfælde af en cysteinkonjugeret ADC9.
Applikationen beregner masser i en bottom-up måde, hvor de elementære sammensætninger først beregnes for de enkelte tunge kæder og lette kæder. Dernæst redegøres for tung kæde (HC) N-terminal cyklisering Lysklipning ved at justere de beregnede elementære sammensætninger. Eventuelle specificerede kemiske ændringer påføres derefter på de tunge og/eller lette kæder. Afhængigt af analysetypen og de disulfidbindingsmønstre, der er specificeret af brugeren, justeres antallet af hydrogener for de to polypeptidkæder. De glykosylerede HC- og lyskædemasser (LC) (valgfri) beregnes ud fra brugerens input. Endelig kombineres flere HC- og LC-masser, og disulfidbindingsnumrene opdateres automatisk til beregning af intakt masse.
Med større molekyler såsom intakte proteiner kan monoisotopiske masser ikke måles på grund af additivmassedefekten, når der anvendes massespektrometre med typisk opløsningsevne. I stedet måles eller rapporteres nominelle eller gennemsnitlige masser 5,10,11,12,13. De gennemsnitlige elementære masser kan variere baseret på den kilde, der anvendes til de kuraterede masser14,15. Mens forskellene i elementære masser kan være små, kan de tilføje op til betydelige værdier for beregninger af store molekylers molekylvægt. De gennemsnitlige grundstofmasser, der anvendes som standard i softwareprogrammet, er vist i supplerende tabel 1. For regulerede miljøer som det biofarmaceutiske forsknings- og udviklingsfelt (R&D) er det vigtigt at opretholde konsistente molekylmasser, fordi ændringer i masser kan indebære ændringer i den molekylære enhed under regulatoriske arkiveringer. For at muliggøre konsistens i brugen af elementære masser er en ordbog over elementære masser inkluderet i softwareværktøjet som en kommasepareret værdi (csv) tekstfil: Element_Mass.csv (supplerende kodningsfil 1). På samme måde er en kurateret liste over glycansammensætninger, der typisk ses på mAbs, inkluderet: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Begge filer gemmes i samme mappeplacering som et eksekverbart program og kan ændres af brugeren til at bruge en bestemt elementær masseliste eller glycanbibliotek.
Figur 1: GUI-grænseflade til mAbScale-applikationen. GUI-modulet giver brugeren mulighed for at angive input til masseberegningen. Brugeren indtaster aminosyresekvenser med et enkelt bogstav for de lette og tunge antistofkæder. Almindelige modifikationer til den tunge N-terminale cyklisering og C-terminal lysinklipning er inkluderet som afkrydsningsfelter. Kemiske formler / elementære sammensætninger kan tilføjes / trækkes fra gennem den respektive Chem Mod-tekstboks . Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Arbejdsprocessen på højt niveau for mAbScale er vist i figur 2. Hvert trin har mere sofistikerede indre beslutningsgrene, sløjfer og kombinatorik. En detaljeret algoritmisk arbejdsgang, der beskriver beregningsprocessen, er vist i supplerende figur 1. Programoutputtet gemmes i regnearksformat i den brugervalgte mappe. Outputfilen består af flere separate regneark, som kan kategoriseres som brugerinput, molekylvægtberegninger og referencer til de gennemsnitlige isotopmasseafledninger (eksempeloutput findes i supplerende tabeller). Brugerinputarkene inkluderer proteinaminosyresekvenserne og anden information, der indtastes af brugeren, gennemsnitlige elementære masser og glycanmasser, som bruges til at beregne elementsammensætningen og forskellige molekylvægte. Molekylvægtberegningsarkene inkluderer den kemiske sammensætning af forskellige former, den reducerede masse med og uden glykosylering og kemisk modifikation og den intakte masse med og uden glykosylering og kemisk modifikation. Ark, der indeholder halve antistofmasser, genereres automatisk, hvis brugeren indtaster to forskellige HC'er og/eller to forskellige LC'er på brugerinputsiden, da halvantistoffer er primære urenheder, der skal identificeres og kvantificeres i forhold til den ønskede heterodimer. Kildekoden til mAbScale kan tilgås via følgende lager: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
Figur 2: Oversigt over de trin, der er involveret i beregningen af elementære sammensætninger og masser ved hjælp af applikationen. Farvekodning kan bruges til at linke til procesforløbet beskrevet i supplerende figur 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Åbning af mAbscale-applikationen
- Åbn softwareprogrammet ved at dobbeltklikke på ikonet for den eksekverbare fil.
2. Indtastning af sekvens
- Indtast sekvenserne for tunge kæder og lette kæder i de respektive tekstfelter markeret med 1 uden mellemrum.
- For bsAbs skal du tilføje yderligere tunge eller lette kæder i det andet sæt tekstfelter markeret med 2. Lad 2 være tomme til mAbs med identiske tunge kæder og lette kæder.
- Marker afkrydsningsfelterne N-terminal cyklisering og / eller C-terminal klipning , hvis disse tunge kædeterminalvarianter er anvendelige.
- Tilføj eventuelle kemiske ændringer, herunder linker og nyttelast for ADC-molekyler, til tekstfelterne Heavy Chain Chem Mod og/eller Light Chain Chem Mod .
- Angiv ændringer som elementære sammensætninger, såsom CaCl2. Modifikationen vil blive tilføjet til den respektive proteinunderenhed eller kæde.
BEMÆRK: En kemisk sammensætning kan også trækkes fra en underenhed eller kæde ved at præfikse elementærsammensætningen med et tegn. For eksempel vil -H2O trække et vandmolekyle fra underenhedens sammensætning og masse.
- Angiv ændringer som elementære sammensætninger, såsom CaCl2. Modifikationen vil blive tilføjet til den respektive proteinunderenhed eller kæde.
3. Angivelse af antallet af disulfidbindinger
- Angiv antallet af disulfidbindinger i proteinmolekylerne i tekstfeltet markeret Samlet antal disulfider.
- Indtast antallet af ureducerede HC-disulfider i tekstfeltet Ureducerede HC-disulfider og antallet af ureducerede LC-disulfider i tekstfeltet Ureducerede LC-disulfider, afhængigt af reduktionsomfanget (komplet vs. delvis).
BEMÆRK: Den reducerede masseanalyse af mAb-underenheder involverer reduktion/adskillelse af de disulfidbundne tunge og lette kæder. - Hvis der er glykosylering på mAb-lyskæden, skal du markere afkrydsningsfeltet Lyskæden er glykosyleret .
4. Indstilling af outputmappen og kørsel af applikationen
- Klik på Gennemse knappen for at vælge en outputmappe til tekstboksen Outputmappe .
- Indtast outputfilnavnet uden filtypenavn (gemmes automatisk som .xlsx) i tekstfeltet Excel-fil (ingen ext).
- Klik på knappen Send for at starte applikationen. Outputfilen findes i den udpegede mappe.
BEMÆRK: Elementmasserne og listen over glycaner kan tilpasses ved at redigere de afgrænsede tekstfiler Element_Mass.csv henholdsvis (Supplerende kodningsfil 1) og Glycan.csv (Supplerende kodningsfil 2). Disse filer skal placeres i samme mappe som den eksekverbare fil mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3), for at programmet kan udføres. Programmet lukkes automatisk efter en udførelse. Brugeren skal starte appen igen, hvis der er behov for en anden beregning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En række mAbs blev udvalgt til at repræsentere forskellige typer mAbs. En kommercielt tilgængelig mAb-standard blev valgt til at repræsentere en konventionel mAb med identiske tunge kæder, identiske lette kæder og et N-bundet glykosyleringssted i Fc-regionen. En mAb med en ekstra lyskæde N-bundet glykosylering, en bispecifik mAb og et antistof-lægemiddelkonjugat (ADC) mAb blev også valgt for at udvide applikationsbrugen. Den kemiske sammensætning, beregnede masse, målte masse og massefejl for disse eksempler mAbs er opsummeret i tabel 1. De proteinkemiske sammensætninger og beregnede masser rapporteret af mAbScale blev bekræftet af GPMAW16, et program til analyse af primær struktur af protein og peptid.
Til den intakte masseanalyse blev mAb-prøverne fortyndet til 1 mg/ml ved hjælp af LC-MS-vand og injiceret til analyse. Til den reducerede analyse blev prøverne først behandlet med dithithreitol og inkuberet ved 37 °C i 15 minutter for at spalte disulfidbindingerne mellem kæderne. Alle prøverne blev analyseret ved hjælp af et Acquity UPLC-system koblet til et massespektrometer. En BEH 200 SEC-søjle blev anvendt til online afsaltning og adskillelse af de tunge og lette kæder ved hjælp af en isokratisk metode med vand / acetonitril (65:35) og 0,1% TFA som den mobile fase. Massespektrometeret blev betjent i positiv iontilstand, og dataene blev indsamlet med et scanningsområde på 700-5.000 m/z.
De intakte og reducerede arbejdsgange i Protien Metrics, Inc. (PMi) Byos blev brugt til at behandle henholdsvis de intakte og reducerede råspektre. Proteinmasseområdet blev sat til 143.000-163.000 Da for den intakte massedekonvolution, 47.000-53.000 Da for HC-massedekonvolutionen og 20.000-27.000 Da for LC-massedekonvolutionen. For den automatiserede masse-/peak-picking blev minimumsforskellen mellem massetoppene sat til 15 Da, og det maksimale antal massetoppe blev begrænset til 10. En liste over forventede glycaner blev indtastet/valgt til fanen massematchning, og den øvre grænse for massematchningstolerancen blev sat til 10 Da.
De små massefejl mellem de beregnede masser og de målte masser lå inden for de normale kriterier for accept af massefejl (≤10 Da for intakte mAbs, ≤5 Da for henholdsvis reducerede tunge kæder og lette kæder), hvilket tyder på, at de beregnede masser var nøjagtige17.
Til beregning af ADC's teoretiske masser kan en kemisk modifikation med linker/nyttelastens elementære sammensætning tilføjes til specifikke mAb-underenheder. Imidlertid vil kun molekylvægten af en lægemiddelbelastningsforholdsmasse blive inkluderet i outputtet. Den sammensatte molekylmasse af antistoffer med forskellige lægemiddelbelastningsforhold skal tilsættes manuelt af brugeren. Disse funktioner kan tilføjes i en senere version af mAbScale eller kan ændres med fællesskabsstøtte i betragtning af dette projekts open source-karakter.
Tabel 1: Sammenligning af de beregnede og målte masser for forskellige mAb-underenheder og molekylære former. De kemiske sammensætninger, beregnede masser, målte masser og massefejl for eksempel mAbs er opsummeret i denne tabel. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende figur 1: Detaljeret algoritmisk arbejdsgang for mAbScale. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: De beregnede gennemsnitlige grundstofmasser anvendt i mAbScale14,15. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 1: Liste over elementære masser. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 2: Liste over glycaner. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfil 3: Medfølgende applikation - mAbScale eksekverbar. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mAbScale giver en intuitiv brugergrænseflade med fleksibilitet til at ændre byggestenene til masse- og elementberegninger. Brugerne forventes at have en grundlæggende forståelse af målmolekylet for at bruge applikationen, udlede korrekte masser og fortolke resultaterne. For eksempel kan det intakte eller reducerede masseoutputark være overvældende på grund af de mange rækker intakte eller reducerede masser, da standardglycandatabasen indeholder 88 N-bundne glycaner, der almindeligvis findes i Fc-delen af terapeutiske antistoffer, og applikationen beregner alle mulige glycoformmasser, der er inkluderet i databasen18, 19. Mens de fleste terapeutiske mAbs er konstrueret til at fjerne glykosylering i Fab-regionen, kan nogle mAbs muligvis beholde dette glykosyleringssted, og dette kan yderligere øge det samlede antal glykosylerede proteoformer. Brugere anbefales at kuratere en glykandatabase, der fokuserer på de mest passende glycoformer for et givet molekyle for at reducere kompleksiteten af outputtet og for bedre at tilpasse resultaterne med de målte masser til identifikation af massetoppen.
Kompleksitetsniveauet stiger yderligere med bsAbs på grund af heterogeniteten af de lette og tunge kæder. Denne softwareapplikation genererer alle mulige permutationer og kombinationer med de medfølgende LC- og HC-sekvenser og glycoformer for at muliggøre generering af alle de potentielle biprodukter fra forkert parring eller ufuldstændig parring af antistofunderenhederne, såsom halvantistoffer. Dette overlader det til brugeren at filtrere de mest hensigtsmæssige proteoformer til deres brug. Softwareoutputtet opdeler glykosylerede og ikke-glykosylerede output i separate regneark, hvilket gør det lettere for brugeren at gennemgå. De intakte og reducerede molekylmasser adskilles også, og alle mulige halvantistofkombinationer for bsAbs er opført i et dedikeret regneark for yderligere at forenkle optagelsen af de behandlede resultater.
En begrænsning af den aktuelle softwareversion er, at applikationen beregner ADC-masserne med kun et lægemiddel-til-antistof-forhold ad gangen, da nyttelastens kemiske struktur indtastes i tekstboksene Heavy Chain Chem Mod og Light Chain Chem Mod . For hvert lægemiddel-til-antistof-forhold (DAR) skal elementærsammensætningen indtastes af brugeren til genberegning.
Evnen til at beregne masser for intakte proteiner leveres af flere applikationer, men de kræver enten en kommerciel licens for at blive købt eller er webbaserede værktøjer, der kræver, at proteinsekvenserne uploades 16,20,21. Disse applikationer giver brugeren meget begrænset fleksibilitet til at tilføje brugerdefinerede kemiske modifikationer eller let inkorporere intramolekylære bindinger, såsom disulfider. Desuden er værdien af webbaserede applikationer begrænset, når proprietære og fortrolige oplysninger er involveret, såsom i farmaceutisk udvikling eller andre kontrollerede miljøer, fordi de bioterapeutiske sekvensoplysninger ikke kan uploades til eksterne servere. Derfor skal forskere stole på enten manuelle beregninger eller programmatiske rutiner, der er mindre fleksible, vanskelige at formidle og kan føre til uoverensstemmelser.
Vi har udviklet en open source-ramme til beregning af molekylmasse og grundstofsammensætning med fokus på at afhjælpe de begrænsninger, der er forbundet med de eksisterende applikationer. Den enkeltstående desktop-applikation med en GUI vil overvinde de begrænsninger, der er forbundet med at uploade proprietære oplysninger til eksterne servere og muliggøre nem adgang for brugerne. Dette værktøj kan bruges til de mest almindelige bioterapeutiske modaliteter, herunder mAbs, bsAbs og ADC'er. Desuden kan udvalget af modifikationer og kildeelementmasser let tilpasses, så det passer til brugerens behov. Den fleksible karakter af denne arbejdsgang vil gøre det muligt for fremtidig udvikling at omfatte applikationer til andre terapeutiske modaliteter, såsom ikke-mAb-proteinterapi, multi-underenhedsvacciner og oligonukleotider eller mRNA. Ved at gøre denne ramme open source håber vi at engagere samfundet i yderligere udvikling og tilpasning til andre modaliteter samt i at tilføje flere funktioner, såsom beregning af teoretiske fragmenter til top-down MS-datasøgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne software frigives under Apache 2.0-licensen. Copyright (2022) af GlaxoSmithKline Research & Development Limited. Alle rettigheder forbeholdes. Licenseret under Apache-licensen, version 2.0 ("licensen"); Du må ikke bruge denne fil undtagen i overensstemmelse med licensen. Du kan få en kopi af licensen på http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. Medmindre det kræves af gældende lov eller aftales skriftligt, distribueres software, der distribueres under licensen, "som den er" uden garantier eller betingelser af nogen art, hverken udtrykkelige eller underforståede. Se licensen for det specifikke sprog, der regulerer tilladelser og begrænsninger under licensen. L.C. er ansat hos GlaxoSmithKline (GSK). T.H. og K.K. udviklede denne software som medarbejdere hos GSK og er nu medarbejdere hos henholdsvis Merck og Moderna.
Acknowledgments
Forfatterne takker Robert Schuster for hjælp med dataverifikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
References
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).
- Wang, M. -Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline (2018).
- Donnelly, D. P., et al. Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry. Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).
- Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).
- Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).
- Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches. Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).
- Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of IgG molecules. mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
- Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).
- Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).
- Valeja, S. G., et al. Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).
- Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).
- Berglund, M., Wieser, M. E. Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).
- Wang, M., et al. The Ame2012 atomic mass evaluation. Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).
- Peri, S., Steen, H., Pandey, A. GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides. Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).
- De Leoz, M. L. A., et al. interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).
- Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential. Biologicals. 52, 1-11 (2018).
- Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. Modification site localization scoring integrated into a search engine. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).
- Chalkley, R. J., Clauser, K. R. Modification site localization scoring: Strategies and performance. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).
