Summary
Den här artikeln beskriver användningen av en programvara, mAbScale, för beräkning av massor för monoklonala antikroppsbaserade proteinterapier.
Abstract
Bioterapeutiska massor är ett sätt att verifiera identitet och strukturell integritet. Masspektrometri (MS) av intakta proteiner eller proteinsubenheter ger ett enkelt analysverktyg för olika stadier av biofarmaceutisk utveckling. Proteinets identitet bekräftas när den experimentella massan från MS ligger inom ett fördefinierat massfelsintervall för den teoretiska massan. Även om det finns flera beräkningsverktyg för beräkning av protein- och peptidmolekylvikter, var de antingen inte utformade för direkt tillämpning på bioterapeutiska enheter, har åtkomstbegränsningar på grund av betalda licenser eller kräver uppladdning av proteinsekvenser till värdservrar.
Vi har utvecklat en modulär massberäkningsrutin som möjliggör enkel bestämning av de genomsnittliga eller monoisotopiska massorna och elementära sammansättningarna av terapeutiska glykoproteiner, inklusive monoklonala antikroppar (mAb), bispecifika antikroppar (bsAb) och antikropps-läkemedelskonjugat (ADC). Den modulära karaktären hos detta Python-baserade beräkningsramverk kommer att göra det möjligt att utvidga denna plattform till andra modaliteter såsom vacciner, fusionsproteiner och oligonukleotider i framtiden, och detta ramverk kan också vara användbart för utfrågning av masspektrometridata uppifrån och ner. Genom att skapa ett fristående skrivbordsprogram med öppen källkod och ett grafiskt användargränssnitt (GUI) hoppas vi kunna övervinna begränsningarna kring användning i miljöer där upphovsrättsskyddad information inte kan laddas upp till webbaserade verktyg. Den här artikeln beskriver algoritmerna och tillämpningen av detta verktyg, mAbScale, på olika antikroppsbaserade terapeutiska modaliteter.
Introduction
Under de senaste två decennierna har bioterapier utvecklats till att bli en stöttepelare i den moderna läkemedelsindustrin. SARS-CoV2-pandemin och andra livshotande tillstånd har ytterligare ökat behovet av en snabbare och bredare utveckling av biofarmaceutiska molekyler 1,2,3.
Den bioterapeutiska molekylvikten är avgörande för identifieringen av molekylen, i kombination med andra analytiska analyser. De intakta och reducerade delenhetsmassorna används under hela upptäckts- och utvecklingslivscykeln som en del av kontrollstrategier som syftar till att upprätthålla kvaliteten, enligt beskrivningen i QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Analytisk utveckling inom den biofarmaceutiska industrin är starkt beroende av massmätningar för analys av intakt massa och djup karakterisering med hjälp av peptidkartläggning eller övervakning av multiattributmetoden (MAM). I centrum för dessa tekniker som använder moderna masspektrometriplattformar (MS) är förmågan att tillhandahålla högupplösta noggranna massmätningar (HR/AM). De flesta HR/AM-instrument ger massnoggrannheter i intervallet 0,5-5 ppm, som skalas med massområdet. Möjligheten att mäta massor noggrant för intakta stora molekyler möjliggör snabb och säker identifiering av läkemedel med stora molekyler. Eftersom isotopupplösning inte kan uppnås med typiska experimentella betingelser för stora molekyler (>10 kDa), måste medelmassan beräknas för jämförelse och identifiering 5,6.
Ett typiskt intakt eller subenhetsproteinmassspektrum representerar den övergripande proteoformprofilen, som innehåller sammansatt information om de olika molekylära formerna som är resultatet av posttranslationella modifieringar (PTM) och eventuella skillnader i primärstrukturen, såsom klipp eller sekvensvarianter. Den relativt enkla och höga genomströmningen hos dessa mätningar gör dem attraktiva för karakterisering och som kontroller för övervakning under processen 7,8. Dataanalys för dessa experiment kräver vanligtvis att användaren definierar sökutrymmet för molekylära former (utbud av PTM eller andra molekylära former). För glykosylerade proteiner drivs detta sökutrymme till stor del av glykoform heterogenitet. Kombinationer av flera PTM, disulfidbindningskonfigurationer och andra variationer längs den primära strukturen gör det till en tråkig uppgift att beräkna alla möjliga molekylformer. Därför är den manuella beräkningen av de möjliga molekylformerna en tids- och resurskrävande process med hög risk för mänskliga fel.
Här presenterar vi ett massberäkningsverktyg som utvecklats med hänsyn till de viktigaste egenskaperna hos bioterapeutiska molekyler, såsom mAbs, bsAbs, ADC, etc. Verktyget gör det enkelt att införliva sökutrymmesvariabler för konsekvent beräkning av massor och elementära sammansättningar. Verktygets modulära karaktär kommer att göra det möjligt att vidareutveckla och tillämpa det på massberäkning och massmatchning för andra modaliteter.
GUI-modulen låter användaren ange ingången för massberäkningen, som visas i figur 1; Specifikt anger användaren aminosyrasekvenser med en bokstav för lätta och tunga antikroppskedjor. Vanliga modifieringar för tung cyklisering av tunga N-terminaler och lysinklippning i C-terminalen ingår som kryssrutor. Vidare kan den kemiska formeln/elementsammansättningen läggas till/subtraheras från dessa proteinkedjor genom respektive Chem Mod-textruta. Detta ger användaren flexibiliteten att lägga till en elementär komposition som inkluderar flera posttranslationella modifieringar eller en nyttolast med små molekyler i fallet med en ADC. Eftersom de flesta terapeutiska mAbs är konstruerade för att ta bort glykosyleringsställena i ljuskedjan, är glykosylering i ljuskedjan valfri och kan specificeras med hjälp av en kryssruta på det grafiska användargränssnittet.
En typisk variant av intakt massanalys för antikroppar är en analys av reducerad subenhetsmassa, där den lätta kedjan lösgörs från den tunga kedjan genom att minska disulfidbindningarna mellan kedjorna. Beroende på styrkan hos det reduktionsmedel som används kan disulfidbindningarna inom kedjan klyvas eller inte. Användarna har flexibiliteten att ange det totala antalet disulfidbindningar beroende på IgG-subtyp eller i fallet med en cysteinkonjugerad ADC9.
Applikationen beräknar massor på ett bottom-up-sätt, där de elementära sammansättningarna först beräknas för de enskilda tunga kedjorna och lätta kedjorna. Därefter redovisas tung kedja (HC) N-terminal cyklisering Lys-klippning genom att justera de beräknade elementsammansättningarna. Eventuella specificerade kemiska modifieringar appliceras sedan på de tunga och/eller lätta kedjorna. Beroende på typ av analys och de disulfidbindningsmönster som anges av användaren justeras antalet väten för de två polypeptidkedjorna. De glykosylerade HC- och lätta kedjemassorna (LC) (tillval) beräknas baserat på användarens inmatning. Slutligen kombineras flera HC- och LC-massor, och disulfidbindningsnumren uppdateras automatiskt för beräkningen av intakt massa.
Med större molekyler som intakta proteiner kan monoisotopiska massor inte mätas på grund av den additiva massdefekten vid användning av masspektrometrar med typisk upplösningsförmåga. I stället mäts eller rapporteras nominella eller genomsnittliga massor 5,10,11,12,13. De genomsnittliga elementära massorna kan variera beroende på källan som används för de kurerade massorna14,15. Även om skillnaderna i elementära massor kan vara små, kan de summera till signifikanta värden för beräkningar av molekylvikt med stora molekyler. De genomsnittliga elementarmassorna som används som standard i programvaran visas i tilläggstabell 1. För reglerade miljöer som biofarmaceutisk forskning och utveckling (FoU) är det viktigt att upprätthålla konsekventa molekylmassor eftersom förändringar i massor kan innebära förändringar i den molekylära enheten under regulatoriska ansökningar. För att möjliggöra konsekvens i användningen av elementära massor ingår en ordlista över elementära massor i programvaruverktyget som en textfil med kommaseparerade värden (csv): Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). På samma sätt ingår en kuraterad lista över glykankompositioner som vanligtvis ses på mAbs: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Båda filerna sparas på samma mappplats som ett körbart program och kan ändras av användaren för att använda en specifik elementmasslista eller glykanbibliotek.
Figur 1: GUI-gränssnitt för mAbScale-applikationen. GUI-modulen låter användaren ange ingången för massberäkningen. Användaren matar in aminosyrasekvenser med en bokstav för de lätta och tunga antikroppskedjorna. Vanliga modifieringar för den tunga kedjiga N-terminalcykliseringen och C-terminalens lysinklippning ingår som kryssrutor. Kemiska formler/elementära kompositioner kan läggas till/subtraheras genom respektive Chem Mod-textruta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Arbetsflödet på hög nivå för mAbScale visas i figur 2. Varje steg har mer avancerade inre beslutsgrenar, loopar och kombinatorik. Ett detaljerat algoritmiskt arbetsflöde som beskriver beräkningsprocessen presenteras i kompletterande figur 1. Programutdata sparas i ett kalkylbladsformat i den användarvalda mappen. Utdatafilen består av flera separata kalkylblad, som kan kategoriseras som användarinmatning, molekylviktsberäkningar och referenser för de genomsnittliga isotopiska masshärledningarna (exempelutdata finns i kompletterande tabeller). Användarinmatningskalkylbladen inkluderar proteinaminosyrasekvenserna och annan information som användaren matar in, genomsnittliga elementära massor och glykanmassor, som används för att beräkna elementsammansättningen och olika molekylvikter. Molekylviktsberäkningsbladen inkluderar den kemiska sammansättningen av olika former, den reducerade massan med och utan glykosylering och kemisk modifiering, och den intakta massan med och utan glykosylering och kemisk modifiering. Ark som innehåller halva antikroppsmassor kommer att genereras automatiskt om användaren anger två olika HC och/eller två olika LC på användarens inmatningssida, eftersom halvantikroppar är primära föroreningar som måste identifieras och kvantifieras i förhållande till den önskade heterodimeren. Källkoden för mAbScale kan nås via följande lagringsplats: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
Figur 2: Översikt över de steg som ingår i beräkningen av elementära sammansättningar och massor med hjälp av applikationen. Färgkodning kan användas för att länka till det processflöde som beskrivs i kompletterande figur 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Öppna mAbscale-applikationen
- Öppna programmet genom att dubbelklicka på ikonen för den körbara filen.
2. Inmatning av sekvens
- Ange sekvenserna för tung kedja och lätt kedja i respektive textrutor markerade med 1 utan mellanslag.
- För bsAbs lägger du till ytterligare tunga eller lätta kedjor i den andra uppsättningen textrutor markerade med 2. Lämna 2 tomma för mAbs med identiska tunga kedjor och lätta kedjor.
- Markera kryssrutorna N-terminalcyklisering och/eller C-terminalklippning , om dessa varianter av tunga kedjeterminaler är tillämpliga.
- Lägg till eventuella kemiska modifieringar, inklusive länkare och nyttolast för ADC-molekyler, i textrutorna Heavy Chain Chem Mod och/eller Light Chain Chem Mod.
- Ange ändringar som elementära sammansättningar, till exempel CaCl2. Modifieringen kommer att läggas till respektive proteinsubenhet eller kedja.
OBS: En kemisk sammansättning kan också subtraheras från en underenhet eller kedja genom att grundämnessammansättningen föregås av ett - tecken. Till exempel kommer -H2O att subtrahera en vattenmolekyl från underenhetens sammansättning och massa.
- Ange ändringar som elementära sammansättningar, till exempel CaCl2. Modifieringen kommer att läggas till respektive proteinsubenhet eller kedja.
3. Specificering av antalet disulfidbindningar
- Ange antalet disulfidbindningar i proteinmolekylerna i textrutan märkt Totalt antal disulfider.
- Ange antalet oreducerade HC-disulfider i textrutan Oreducerad HC-disulfider och antalet oreducerade LC-disulfider i textrutan Oreducerade LC-disulfider, beroende på reduktionens omfattning (fullständig eller partiell).
OBS: Analysen av reducerad massa av mAb-subenheter innebär reduktion/separation av de disulfidkopplade tunga och lätta kedjorna. - Om det finns glykosylering på mAb-ljuskedjan, markera kryssrutan Ljuskedjan är glykosylerad .
4. Ställa in utdatamappen och köra programmet
- Klicka på knappen Bläddra för att välja en utdatamapp för textrutan Utdatamapp .
- Ange utdatafilens namn utan filtillägg (sparas automatiskt som .xlsx) i textrutan Excel-fil (ingen ext).
- Klicka på knappen Skicka för att starta ansökan. Utdatafilen finns i den angivna mappen.
OBS: Elementmassorna och listan över glykaner kan anpassas genom att redigera de avgränsade textfilerna Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1) respektive Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Dessa filer måste placeras i samma mapp som den körbara filen mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) för att programmet ska kunna köras. Programmet stängs automatiskt efter en körning. Användaren måste starta appen igen om en andra beräkning behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mängd olika mAbs valdes ut för att representera olika typer av mAbs. En kommersiellt tillgänglig mAb-standard valdes för att representera en konventionell mAb med identiska tunga kedjor, identiska lätta kedjor och ett N-kopplat glykosyleringsställe i Fc-regionen. En mAb med en extra lätt kedja N-kopplad glykosylering, en bispecifik mAb och ett antikropps-läkemedelskonjugat (ADC) mAb valdes också för att bredda applikationsanvändningen. Den kemiska sammansättningen, den beräknade massan, den uppmätta massan och massfelet för dessa exempel på mAbs sammanfattas i tabell 1. Proteinets kemiska sammansättning och beräknade massor som rapporterats av mAbScale bekräftades av GPMAW16, ett program för analys av proteiners och peptiders primära struktur.
För analys av intakt massa späddes mAb-proverna till 1 mg/ml med hjälp av vatten av LC-MS-kvalitet och injicerades för analys. För den reducerade analysen behandlades proverna först med dithithreitol och inkuberades vid 37 °C i 15 minuter för att klyva disulfidbindningarna mellan kedjorna. Alla prover analyserades med hjälp av ett Acquity UPLC-system kopplat till en masspektrometer. En BEH 200 SEC-kolonn användes för avsaltning online och separering av de tunga och lätta kedjorna med hjälp av en isokratisk metod med vatten/acetonitril (65:35) och 0,1 % TFA som mobil fas. Masspektrometern kördes i positivt jonläge och data samlades in med ett skanningsområde på 700-5 000 m/z.
De intakta och reducerade arbetsflödena för Protien Metrics, Inc. (PMi) Byos användes för att bearbeta de intakta respektive reducerade råspektra. Proteinmassintervallet sattes till 143 000-163 000 Da för den intakta massdekonvolutionen, 47 000-53 000 Da för HC-massdekonvolutionen och 20 000-27 000 Da för LC-massdekonvolutionen. För den automatiserade mass-/toppplockningen sattes den minsta skillnaden mellan masstopparna till 15 Da, och det maximala antalet masstoppar begränsades till 10. En lista över förväntade glykaner angavs/valdes för massmatchningsfliken, och den övre gränsen för massmatchningstoleransen sattes till 10 Da.
De små massfelen mellan de beräknade massorna och de uppmätta massorna låg inom de normala acceptanskriterierna för massfel (≤10 Da för intakta mAbs, ≤5 Da för reducerade tunga kedjor respektive lätta kedjor), vilket tyder på att de beräknade massorna var korrekta17.
För beräkning av ADC:s teoretiska massor kan en kemisk modifiering med länknings-/nyttolastelementsammansättningen läggas till specifika mAb-underenheter. Emellertid kommer endast molekylvikten för en massa för läkemedelsbelastningskvot att inkluderas i resultatet. Den sammansatta molekylmassan av antikroppar med olika läkemedelsbelastningsförhållanden måste tillsättas manuellt av användaren. Dessa funktioner kan läggas till i en senare version av mAbScale eller modifieras med stöd från communityn, med tanke på projektets öppna källkod.
Tabell 1: Jämförelse av de beräknade och uppmätta massorna för olika mAb-underenheter och molekylformer. De kemiska sammansättningarna, beräknade massor, uppmätta massor och massfel för exempel mAbs sammanfattas i denna tabell. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande figur 1: Detaljerat algoritmiskt arbetsflöde för mAbScale. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: De beräknade genomsnittliga grundämnesmassorna som används i mAbScale14,15. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: Förteckning över grundämnesmassor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: Förteckning över glykaner. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 3: Paketerad applikation - körbar mAbScale-fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mAbScale ger ett intuitivt användargränssnitt med flexibiliteten att ändra byggstenarna för mass- och elementberäkningar. Användarna förväntas ha en grundläggande förståelse för målmolekylen för att kunna använda applikationen, härleda korrekta massor och tolka resultaten. Till exempel kan det intakta eller reducerade massutmatningsarket vara överväldigande på grund av de många raderna av intakta eller reducerade massor, eftersom standardglykandatabasen innehåller 88 N-länkade glykaner som vanligtvis finns i Fc-delen av terapeutiska antikroppar, och applikationen beräknar alla möjliga glykoforma massor som ingår i databasen18, 19. veckor Medan de flesta terapeutiska mAbs är konstruerade för att avlägsna glykosylering i Fab-regionen, kan vissa mAbs behålla detta glykosyleringsställe, och detta kan ytterligare öka det totala antalet glykosylerade proteoformer. Användare rekommenderas att kurera en glykandatabas som fokuserar på de mest lämpliga glykoformerna för en given molekyl för att minska komplexiteten i utdata och för att bättre anpassa resultaten till de uppmätta massorna för identifiering av masstoppar.
Komplexitetsnivån ökar ytterligare med bsAbs på grund av heterogeniteten mellan de lätta och tunga kedjorna. Denna programvara genererar alla möjliga permutationer och kombinationer med de tillhandahållna LC- och HC-sekvenserna och glykoformerna för att möjliggöra generering av alla potentiella biprodukter från felparning eller ofullständig parning av antikroppsunderenheterna, såsom halvantikroppar. Detta lämnar det upp till användaren att filtrera bort de mest lämpliga proteoformerna för deras användning. Programvarans utdata delar upp glykosylerade och icke-glykosylerade utgångar i separata kalkylblad, vilket gör det lättare för användaren att granska. De intakta och reducerade molekylmassorna är också separerade, och alla möjliga halv-antikroppskombinationer för bsAbs listas i ett dedikerat arbetsblad för att ytterligare förenkla upptaget av de bearbetade resultaten.
En begränsning med den nuvarande programvaruversionen är att applikationen beräknar ADC-massorna med endast ett läkemedels-till-antikroppsförhållande åt gången, eftersom nyttolastens kemiska struktur anges i textrutorna Heavy Chain Chem Mod och Light Chain Chem Mod. För varje läkemedels-till-antikroppsförhållande (DAR) måste den elementära sammansättningen anges av användaren för omräkning.
Möjligheten att beräkna massor för intakta proteiner tillhandahålls av flera applikationer, men de kräver antingen en kommersiell licens för att köpas eller är webbaserade verktyg som kräver att proteinsekvenserna laddas upp 16,20,21. Dessa applikationer erbjuder mycket begränsad flexibilitet för användaren att lägga till anpassade kemiska modifieringar eller enkelt införliva intramolekylära bindningar, såsom disulfider. Vidare är värdet av webbaserade applikationer begränsat när proprietär och konfidentiell information är inblandad, till exempel i läkemedelsutveckling eller andra kontrollerade miljöer, eftersom den bioterapeutiska sekvensinformationen inte kan laddas upp till externa servrar. Följaktligen måste forskare förlita sig på antingen manuella beräkningar eller programmatiska rutiner som är mindre flexibla, svåra att sprida och kan leda till inkonsekvenser.
Vi har utvecklat ett ramverk med öppen källkod för beräkning av molekylmassa och grundämnessammansättning med fokus på att lindra de begränsningar som är förknippade med de befintliga tillämpningarna. Den fristående skrivbordsapplikationen med ett GUI kommer att övervinna de begränsningar som är förknippade med att ladda upp proprietär information till externa servrar och möjliggöra enkel åtkomst för användare. Detta verktyg kan användas för de vanligaste bioterapeutiska modaliteterna, inklusive mAbs, bsAbs och ADC. Dessutom kan utbudet av modifieringar och källelementära massor enkelt anpassas för att passa användarens behov. Den flexibla karaktären hos detta arbetsflöde kommer att göra det möjligt för framtida utveckling att inkludera tillämpningar på andra terapeutiska modaliteter, såsom icke-mAb-proteinterapier, multisubenhetsvacciner och oligonukleotider eller mRNA. Genom att göra detta ramverk med öppen källkod hoppas vi kunna engagera gemenskapen i vidareutveckling och anpassning till andra modaliteter, samt i att lägga till fler funktioner, såsom beräkning av teoretiska fragment för uppifrån och ner MS-dataförhör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denna programvara släpps under Apache 2.0-licensen. Upphovsrätt (2022) för GlaxoSmithKline Research & Development Limited. Alla rättigheter förbehållna. Licensierad under Apache-licensen, version 2.0 ("Licensen"); du får inte använda den här filen förutom i enlighet med licensen. Du kan få en kopia av licensen på http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. Såvida det inte krävs enligt tillämplig lag eller skriftligen överenskommits, distribueras programvara som distribueras under licensen "i befintligt skick", utan garantier eller villkor av något slag, vare sig uttryckliga eller underförstådda. Se Licensen för det specifika språk som styr behörigheter och begränsningar under Licensen. L.C. är anställd av GlaxoSmithKline (GSK). T.H. och K.K. utvecklade denna programvara i egenskap av anställda hos GSK och är nu delägare i Merck respektive Moderna.
Acknowledgments
Författarna tackar Robert Schuster för hjälp med dataverifiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
References
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).
- Wang, M. -Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline (2018).
- Donnelly, D. P., et al. Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry. Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).
- Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).
- Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).
- Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches. Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).
- Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of IgG molecules. mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
- Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).
- Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).
- Valeja, S. G., et al. Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).
- Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).
- Berglund, M., Wieser, M. E. Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).
- Wang, M., et al. The Ame2012 atomic mass evaluation. Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).
- Peri, S., Steen, H., Pandey, A. GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides. Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).
- De Leoz, M. L. A., et al. interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).
- Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential. Biologicals. 52, 1-11 (2018).
- Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. Modification site localization scoring integrated into a search engine. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).
- Chalkley, R. J., Clauser, K. R. Modification site localization scoring: Strategies and performance. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).
