Summary
Denne artikkelen beskriver bruken av et program, mAbScale, for beregning av masser for monoklonale antistoffbaserte proteinterapier.
Abstract
Bioterapeutiske masser er et middel til å verifisere identitet og strukturell integritet. Massespektrometri (MS) av intakte proteiner eller proteinunderenheter gir et enkelt analyseverktøy for ulike stadier av biofarmasøytisk utvikling. Proteinets identitet bekreftes når den eksperimentelle massen fra MS er innenfor et forhåndsdefinert massefeilområde av den teoretiske massen. Mens det finnes flere beregningsverktøy for beregning av protein- og peptidmolekylvekter, ble de enten ikke designet for direkte anvendelse på bioterapeutiske enheter, har tilgangsbegrensninger på grunn av betalte lisenser, eller krever opplasting av proteinsekvenser til vertsservere.
Vi har utviklet en modulær masseberegningsrutine som gjør det enkelt å bestemme gjennomsnittlig eller monoisotopisk masse og elementære sammensetninger av terapeutiske glykoproteiner, inkludert monoklonale antistoffer (mAb), bispesifikke antistoffer (bsAb) og antistoff-legemiddelkonjugater (ADC). Den modulære naturen til dette Python-baserte beregningsrammeverket vil tillate utvidelse av denne plattformen til andre modaliteter som vaksiner, fusjonsproteiner og oligonukleotider i fremtiden, og dette rammeverket kan også være nyttig for undersøkelse av ovenfra og ned massespektrometridata. Ved å lage et frittstående skrivebordsprogram med åpen kildekode med et grafisk brukergrensesnitt (GUI), håper vi å overvinne begrensningene rundt bruk i miljøer der proprietær informasjon ikke kan lastes opp til nettbaserte verktøy. Denne artikkelen beskriver algoritmene og anvendelsen av dette verktøyet, mAbScale, på forskjellige antistoffbaserte terapeutiske modaliteter.
Introduction
I løpet av de siste to tiårene har bioterapi utviklet seg til å bli en bærebjelke i den moderne farmasøytiske industrien. SARS-CoV2-pandemien og andre livstruende tilstander har ytterligere økt behovet for raskere og bredere utvikling av biofarmasøytiske molekyler 1,2,3.
Den bioterapeutiske molekylvekten er kritisk for identifisering av molekylet, i kombinasjon med andre analytiske analyser. De intakte og reduserte underenhetsmassene brukes gjennom hele oppdagelses- og utviklingslivssyklusen som en del av kontrollstrategier som tar sikte på å opprettholde kvaliteten, som beskrevet i QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Analytisk utvikling i biofarmasøytisk industri er avhengig av massemålinger for intakt masseanalyse og dyp karakterisering ved hjelp av peptidkartlegging eller multiattributtmetode (MAM) overvåking. I sentrum av disse teknikkene som benytter moderne massespektrometri (MS) plattformer er evnen til å gi høyoppløselige nøyaktige masse (HR / AM) målinger. De fleste HR / AM-instrumenter gir massenøyaktigheter i området 0,5-5 ppm, som skalerer med masseområdet. Evnen til å måle masser nøyaktig for intakte store molekyler muliggjør rask og trygg identifisering av stormolekylære terapier. Siden isotopoppløsning ikke kan oppnås ved bruk av typiske eksperimentelle betingelser for store molekyler (>10 kDa), må gjennomsnittsmasser beregnes for sammenligning og identifisering 5,6.
Et typisk intakt eller subenhetsproteinmassespektrum representerer den overordnede proteoformprofilen, som inneholder sammensatt informasjon om de forskjellige molekylære formene som følge av posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) og eventuelle primære strukturforskjeller, for eksempel klipp eller sekvensvarianter. Den relativt enkle og høye gjennomstrømningen av disse målingene gjør dem attraktive for karakterisering og som overvåkingskontroller i prosessen 7,8. Dataanalyse for disse eksperimentene krever vanligvis at brukeren definerer søkeområdet for molekylære former (utvalg av PTM eller andre molekylære former). For glykosylerte proteiner er dette søkeområdet i stor grad drevet av glykoformheterogenitet. Kombinasjoner av flere PTM-er, disulfidbindingskonfigurasjoner og andre variasjoner langs primærstrukturen gjør beregning av alle mulige molekylære former til en kjedelig oppgave. Derfor er manuell beregning av mulige molekylære former en tid- og ressurskrevende prosess med høyt potensial for menneskelige feil.
Her presenterer vi et masseberegningsverktøy som ble utviklet med tanke på de viktigste egenskapene til bioterapeutiske molekyler, som mAbs, bsAbs, ADC, etc. Verktøyet gjør det enkelt å innlemme søkeromvariabler for konsistent beregning av masser og elementære komposisjoner. Den modulære naturen til dette verktøyet vil gjøre det mulig å videreutvikle og bruke til masseberegning og massematching for andre modaliteter.
GUI-modulen lar brukeren spesifisere inngangen for masseberegningen, som vist i figur 1; Spesielt går brukeren inn i aminosyresekvenser med én bokstav for lette og tunge antistoffkjeder. Vanlige modifikasjoner for tungkjedet N-terminal syklisering og C-terminal lysinklipping er inkludert som avmerkingsbokser. Videre kan den kjemiske formelen / elementsammensetningen legges til / trekkes fra disse proteinkjedene gjennom den respektive Chem Mod-tekstboksen . Dette gir brukeren fleksibiliteten til å legge til en elementær sammensetning som inkluderer flere posttranslasjonelle modifikasjoner eller en nyttelast med lite molekyl i tilfelle av en ADC. Siden de fleste terapeutiske mAbs er konstruert for å fjerne glykosyleringsstedene i lyskjeden, er glykosylering i lyskjeden valgfri og kan spesifiseres ved hjelp av en avmerkingsboks på GUI.
En typisk variasjon på intakt masseanalyse for antistoffer er en redusert subenhetsmasseanalyse, hvor den lette kjeden løsnes fra den tunge kjeden ved å redusere disulfidbindingene mellom kjedene. Avhengig av styrken av reduksjonsmidlet som brukes, kan de intrakjede disulfidbindingene spaltes eller ikke. Brukerne har fleksibilitet til å angi totalt antall disulfidbindinger avhengig av IgG-subtypen eller i tilfelle en cysteinkonjugert ADC9.
Applikasjonen beregner masser nedenfra og opp, der elementsammensetningene først beregnes for de enkelte tunge kjeder og lette kjeder. Deretter regnskapsføres tungkjede (HC) N-terminal syklisering Lys-klipping ved å justere de beregnede elementære sammensetningene. Eventuelle spesifiserte kjemiske modifikasjoner blir deretter påført de tunge og / eller lette kjedene. Avhengig av typen analyse og disulfidbindingsmønstrene spesifisert av brukeren, justeres antall hydrogener for de to polypeptidkjedene. De glykosylerte HC- og lettkjedemassene (LC) (valgfritt) beregnes basert på brukerens inndata. Til slutt kombineres flere HC- og LC-masser, og disulfidbindingsnumrene oppdateres automatisk for intakt masseberegning.
Med større molekyler som intakte proteiner kan monoisotopiske masser ikke måles på grunn av additivmassedefekten ved bruk av massespektrometre med typisk oppløsningskraft. I stedet måles eller rapporteres nominelle eller gjennomsnittlige masser 5,10,11,12,13. De gjennomsnittlige elementmassene kan variere basert på kilden som brukes til de kuraterte massene14,15. Mens forskjellene i elementmasser kan være små, kan de legge opp til signifikante verdier for molekylvektberegninger med store molekyler. De gjennomsnittlige elementmassene som brukes som standard i programvaren, er vist i tilleggstabell 1. For regulerte miljøer som biofarmasøytisk forskning og utvikling (FoU) -feltet, er det viktig å opprettholde konsistente molekylmasser fordi endringer i massene kan innebære endringer i molekylenheten under regulatoriske innleveringer. For å muliggjøre konsistens i bruken av elementmasser, følger en ordbok med elementmasser med programvareverktøyet som en kommaseparert tekstfil (csv): Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). På samme måte er en kuratert liste over glykankomposisjoner som vanligvis ses på mAbs inkludert: Glykan.csv (Supplementary Coding File 2). Begge filene lagres på samme mappeplassering som et kjørbart program og kan endres av brukeren for å bruke en bestemt elementær masseliste eller glykanbibliotek.
Figur 1: GUI-grensesnitt for mAbScale-programmet. GUI-modulen lar brukeren spesifisere inngangen for masseberegningen. Brukeren legger inn aminosyresekvenser på én bokstav for de lette og tunge antistoffkjedene. Vanlige modifikasjoner for tungkjedet N-terminal syklisering og C-terminal lysinklipping er inkludert som avmerkingsbokser. Kjemiske formler / elementære komposisjoner kan legges til / trekkes fra gjennom den respektive Chem Mod-tekstboksen . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Arbeidsflyten på høyt nivå for mAbScale er vist i figur 2. Hvert trinn har mer sofistikerte indre beslutningsgrener, løkker og kombinatorikk. En detaljert algoritmisk arbeidsflyt som beskriver beregningsprosessen er presentert i tilleggsfigur 1. Programutdataene lagres i regnearkformat i den brukervalgte mappen. Utdatafilen består av flere separate regneark, som kan kategoriseres som brukerinngang, molekylvektberegninger og referanser for gjennomsnittlige isotopiske massederivasjoner (eksempelutdata er gitt i tilleggstabeller). Brukerinngangsarkene inkluderer proteinaminosyresekvensene og annen informasjon som er angitt av brukeren, gjennomsnittlige elementmasser og glykanmasser, som brukes til å beregne elementsammensetningen og forskjellige molekylvekter. Molekylvektberegningsarkene inkluderer kjemisk sammensetning av forskjellige former, redusert masse med og uten glykosylering og kjemisk modifikasjon, og intakt masse med og uten glykosylering og kjemisk modifikasjon. Ark som inneholder halvantistoffmasser vil bli generert automatisk hvis brukeren legger inn to forskjellige HC-er og/eller to forskjellige LC-er på brukerinngangssiden, siden halvantistoffer er primære urenheter som må identifiseres og kvantifiseres i forhold til ønsket heterodimer. Kildekoden for mAbScale kan nås via følgende depot: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
Figur 2: Oversikt over trinnene som er involvert i beregningen av elementære komposisjoner og masser ved bruk av applikasjonen. Fargekoding kan brukes til å koble til prosessflyten beskrevet i tilleggsfigur 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Åpne mAbscale-applikasjonen
- Åpne programvaren ved å dobbeltklikke på ikonet for den kjørbare filen.
2. Sekvens oppføring
- Skriv inn tungkjede- og lettkjedesekvensene i de respektive tekstboksene merket med 1 uten mellomrom.
- For bsAbs legger du til flere tunge eller lette kjeder i det andre settet med tekstbokser merket 2. La 2 stå tomt for mAbs med identiske tunge kjeder og lette kjeder.
- Merk av for N-terminal syklisering og/eller C-terminal klipping hvis disse tungkjedeterminalvariantene er aktuelle.
- Legg til eventuelle kjemiske modifikasjoner, inkludert kobling og nyttelast for ADC-molekyler, til tekstboksene Heavy Chain Chem Mod og/eller Light Chain Chem Mod .
- Angi modifikasjoner som elementære komposisjoner, for eksempel CaCl2. Modifikasjonen vil bli lagt til den respektive proteinunderenheten eller kjeden.
MERK: En kjemisk sammensetning kan også trekkes fra en underenhet eller kjede ved å prefiksere elementsammensetningen med et -tegn. For eksempel vil -H2O trekke et vannmolekyl fra underenhetens sammensetning og masse.
- Angi modifikasjoner som elementære komposisjoner, for eksempel CaCl2. Modifikasjonen vil bli lagt til den respektive proteinunderenheten eller kjeden.
3. Angi antall disulfidbindinger
- Angi antall disulfidbindinger i proteinmolekylene i tekstboksen merket Totalt antall disulfider.
- Skriv inn antall ureduserte HC-disulfider i tekstboksen Ureduserte HC-disulfider og antall ureduserte LC-disulfider i tekstboksen Ureduserte LC-disulfider, avhengig av reduksjonsgraden (fullstendig kontra delvis).
MERK: Den reduserte masseanalysen av mAb-underenheter involverer reduksjon/separasjon av de disulfidbundne tunge og lette kjedene. - Hvis glykosylering finnes i mAb-lyskjeden, merker du av for Lyskjeden er glykosylert .
4. Angi utdatamappen og kjøre applikasjonen
- Klikk på Søk -knappen for å velge en utdatamappe for tekstboksen Output Folder .
- Skriv inn navnet på utdatafilen uten filtype (lagres automatisk som .xlsx) i tekstboksen Excel-fil (ingen ext).
- Klikk på Send-knappen for å starte søknaden. Utdatafilen finner du i den angitte mappen.
MERK: Elementmassene og listen over glykaner kan tilpasses ved å redigere henholdsvis tekstfilene med skilletegn Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1) og Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Disse filene må plasseres i samme mappe som den kjørbare filen mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) for at programmet skal kunne kjøre. Søknaden lukkes automatisk etter én kjøring. Brukeren må starte appen på nytt hvis en ny beregning er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En rekke mAbs ble valgt for å representere forskjellige typer mAbs. En kommersielt tilgjengelig mAb-standard ble valgt for å representere en konvensjonell mAb med identiske tunge kjeder, identiske lette kjeder og ett N-bundet glykosyleringssted i Fc-regionen. En mAb med en ekstra lettkjedet N-bundet glykosylering, en bispesifikk mAb og et antistoff-legemiddelkonjugat (ADC) mAb ble også valgt for å utvide applikasjonsbruken. Den kjemiske sammensetningen, beregnet masse, målt masse og massefeil i disse eksempel-mAbs er oppsummert i tabell 1. De proteinkjemiske sammensetningene og beregnede massene rapportert av mAbScale ble bekreftet av GPMAW16, et program for analyse av protein- og peptidprimærstruktur.
For den intakte masseanalysen ble mAb-prøvene fortynnet til 1 mg/ml ved bruk av vann av LC-MS-kvalitet og injisert for analyse. For den reduserte analysen ble prøvene først behandlet med dithithreitol og inkubert ved 37 °C i 15 minutter for å spalte disulfidbindingene mellom kjedene. Alle prøvene ble analysert ved hjelp av et Acquity UPLC-system koblet til et massespektrometer. En BEH 200 SEC kolonne ble brukt for online avsalting og separasjon av tunge og lette kjeder ved hjelp av en isokratisk metode med vann / acetonitril (65:35) og 0,1% TFA som mobil fase. Massespektrometeret ble operert i positiv ionemodus, og dataene ble samlet inn med et skanneområde på 700-5000 m/z.
Den intakte og reduserte arbeidsflyten til Protien Metrics, Inc. (PMi) Byos ble brukt til å behandle henholdsvis intakte og reduserte råspektra. Proteinmasseområdet ble satt til 143 000-163 000 Da for den intakte massedekonvolusjonen, 47 000-53 000 Da for HC-massedekonvolusjonen og 20 000-27 000 Da for LC-massedekonvolusjonen. For den automatiserte masse-/toppplukkingen ble minimumsforskjellen mellom massetoppene satt til 15 Da, og maksimalt antall massetopper ble begrenset til 10. En liste over forventede glykaner ble lagt inn/valgt for massematching-fanen, og den øvre grensen for massematchingstoleransen ble satt til 10 Da.
De små massefeilene mellom de beregnede massene og de målte massene var innenfor kriteriene for normal massefeilaksept (≤10 Da for intakte mAbs, ≤5 Da for henholdsvis reduserte tunge kjeder og lette kjeder), noe som tyder på at de beregnede massene var nøyaktige17.
For beregning av ADC-teoretiske masser kan en kjemisk modifikasjon med linker/nyttelastelementets sammensetning legges til spesifikke mAb-underenheter. Imidlertid vil bare molekylvekten til en legemiddelbelastningsforholdsmasse bli inkludert i utgangen. Den sammensatte molekylmassen av antistoffer med forskjellige legemiddelbelastningsforhold må legges til manuelt av brukeren. Disse funksjonene kan legges til i en senere versjon av mAbScale eller kan endres med fellesskapsstøtte, gitt åpen kildekode-naturen til dette prosjektet.
Tabell 1: Sammenligning av beregnet og målt masse for ulike mAb-underenheter og molekylære former. De kjemiske sammensetningene, beregnede masser, målte masser og massefeil i eksempel mAbs er oppsummert i denne tabellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfigur 1: Detaljert algoritmisk arbeidsflyt for mAbScale. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell 1: Den beregnede gjennomsnittlige elementmassen brukt i mAbScale14,15. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 1: Liste over elementmasser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 2: Liste over glykaner. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 3: Buntet applikasjon - mAbScale kjørbar. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mAbScale gir et intuitivt brukergrensesnitt med fleksibilitet til å endre byggesteinene for masse- og elementberegninger. Brukerne forventes å ha en grunnleggende forståelse av målmolekylet for å bruke applikasjonen, utlede korrekte masser og tolke resultatene. For eksempel kan det intakte eller reduserte masseutgangsarket være overveldende på grunn av de mange radene med intakte eller reduserte masser, siden standard glykandatabase inneholder 88 N-koblede glykaner som ofte finnes i Fc-delen av terapeutiske antistoffer, og applikasjonen beregner alle mulige glykoformmasser som er inkludert i databasen18, 19. Mens de fleste terapeutiske mAbs er konstruert for å fjerne glykosylering i Fab-regionen, kan noen mAbs beholde dette glykosyleringsstedet, og dette kan ytterligere øke det totale antallet glykosylerte proteoformer. Brukere anbefales å kuratere en glykandatabase som fokuserer på de mest hensiktsmessige glykoformene for et gitt molekyl for å redusere kompleksiteten til utgangen og for bedre å justere resultatene med de målte massene for massetoppidentifikasjon.
Kompleksitetsnivået øker ytterligere med bsAbs på grunn av heterogeniteten til de lette og tunge kjedene. Denne programvaren genererer alle mulige permutasjoner og kombinasjoner med de medfølgende LC- og HC-sekvensene og glykoformene for å tillate generering av alle potensielle biprodukter fra feilparring eller ufullstendig sammenkobling av antistoffunderenhetene, for eksempel halvantistoffer. Dette lar det være opp til brukeren å filtrere ut de mest hensiktsmessige proteoformene for deres bruk. Programvareutgangen deler glykosylerte og ikke-glykosylerte utganger i separate regneark, noe som gjør det lettere for brukeren å gjennomgå. De intakte og reduserte molekylmassene er også segregert, og alle mulige halvantistoffkombinasjoner for bsAbs er oppført i et dedikert regneark for ytterligere å forenkle opptaket av de behandlede resultatene.
En begrensning av den nåværende programvareversjonen er at applikasjonen beregner ADC-massene med bare ett legemiddel-til-antistoffforhold om gangen, siden nyttelastens kjemiske struktur er angitt i tekstboksene Heavy Chain Chem Mod og Light Chain Chem Mod . For hvert legemiddel-til-antistoffforhold (LAR) må elementsammensetningen legges inn av brukeren for omberegning.
Muligheten til å beregne masser for intakte proteiner er gitt av flere applikasjoner, men de krever enten en kommersiell lisens for å bli kjøpt eller er nettbaserte verktøy som krever at proteinsekvensene lastes opp 16,20,21. Disse applikasjonene gir brukeren svært begrenset fleksibilitet for å legge til tilpassede kjemiske modifikasjoner eller enkelt inkorporere intramolekylære bindinger, for eksempel disulfider. Videre er verdien av nettbaserte applikasjoner begrenset når proprietær og konfidensiell informasjon er involvert, for eksempel i farmasøytisk utvikling eller andre kontrollerte miljøer, fordi den bioterapeutiske sekvensinformasjonen ikke kan lastes opp til eksterne servere. Forskeren må derfor basere seg på enten manuelle beregninger eller programmatiske rutiner som er mindre fleksible, vanskelige å formidle og kan føre til inkonsekvenser.
Vi har utviklet et open-source rammeverk for beregning av molekylmasse og elementær sammensetning med fokus på å lindre restriksjonene knyttet til eksisterende applikasjoner. Den frittstående skrivebordsapplikasjonen med et GUI vil overvinne begrensningene knyttet til opplasting av proprietær informasjon til eksterne servere og muliggjøre enkel tilgang for brukere. Dette verktøyet kan brukes til de vanligste bioterapeutiske modalitetene, inkludert mAbs, bsAbs og ADC. Videre kan utvalget av modifikasjoner og kildeelementmasser enkelt tilpasses for å passe brukerens behov. Den fleksible naturen til denne arbeidsflyten vil tillate fremtidig utvikling å inkludere applikasjoner til andre terapeutiske modaliteter, som ikke-mAb-proteinbehandlinger, multi-subenhetsvaksiner og oligonukleotider eller mRNA. Ved å gjøre dette rammeverket åpen kildekode, håper vi å engasjere samfunnet i videreutvikling og tilpasning til andre modaliteter, samt å legge til flere funksjoner, for eksempel beregning av teoretiske fragmenter for ovenfra og ned MS-dataavhør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne programvaren blir utgitt under Apache 2.0-lisensen. Opphavsrett (2022) til GlaxoSmithKline Research &; Development Limited. Alle rettigheter forbeholdt. Lisensiert under Apache-lisensen, versjon 2.0 ("Lisensen"); du kan ikke bruke denne filen unntatt i samsvar med lisensen. Du kan få en kopi av lisensen på http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. Med mindre det kreves av gjeldende lov eller skriftlig avtalt, distribueres programvare distribuert under lisensen på en "som den er" basis, uten garantier eller betingelser av noe slag, verken uttrykt eller underforstått. Se lisensen for det spesifikke språket som styrer tillatelser og begrensninger under lisensen. L.C. er ansatt i GlaxoSmithKline (GSK). T.H. og K.K. utviklet denne programvaren som ansatte i GSK og er nå medarbeidere av henholdsvis Merck og Moderna.
Acknowledgments
Forfatterne takker Robert Schuster for hjelp med dataverifisering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
References
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).
- Wang, M. -Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline (2018).
- Donnelly, D. P., et al. Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry. Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).
- Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).
- Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).
- Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches. Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).
- Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of IgG molecules. mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
- Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).
- Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).
- Valeja, S. G., et al. Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).
- Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).
- Berglund, M., Wieser, M. E. Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).
- Wang, M., et al. The Ame2012 atomic mass evaluation. Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).
- Peri, S., Steen, H., Pandey, A. GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides. Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).
- De Leoz, M. L. A., et al. interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).
- Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential. Biologicals. 52, 1-11 (2018).
- Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. Modification site localization scoring integrated into a search engine. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).
- Chalkley, R. J., Clauser, K. R. Modification site localization scoring: Strategies and performance. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).
