Summary
Este artigo descreve o uso de um software, mAbScale, para o cálculo de massas para a terapêutica proteica baseada em anticorpos monoclonais.
Abstract
As massas bioterapêuticas são um meio de verificação de identidade e integridade estrutural. A espectrometria de massa (MS) de proteínas intactas ou subunidades proteicas fornece uma ferramenta analítica fácil para diferentes estágios do desenvolvimento biofarmacêutico. A identidade da proteína é confirmada quando a massa experimental de MS está dentro de uma faixa de erro de massa pré-definida da massa teórica. Embora existam várias ferramentas computacionais para o cálculo de pesos moleculares de proteínas e peptídeos, elas não foram projetadas para aplicação direta a entidades bioterapêuticas, têm limitações de acesso devido a licenças pagas ou exigem o upload de sequências de proteínas para servidores host.
Desenvolvemos uma rotina modular de cálculo de massa que permite a fácil determinação das massas médias ou monoisotópicas e composições elementares de glicoproteínas terapêuticas, incluindo anticorpos monoclonais (mAb), anticorpos biespecíficos (bsAb) e conjugados anticorpo-droga (ADC). A natureza modular desta estrutura de cálculo baseada em Python permitirá a extensão desta plataforma para outras modalidades, como vacinas, proteínas de fusão e oligonucleotídeos no futuro, e esta estrutura também pode ser útil para a interrogação de dados de espectrometria de massa de cima para baixo. Ao criar um aplicativo de desktop autônomo de código aberto com uma interface gráfica do usuário (GUI), esperamos superar as restrições em torno do uso em ambientes onde as informações proprietárias não podem ser carregadas em ferramentas baseadas na Web. Este artigo descreve os algoritmos e a aplicação dessa ferramenta, mAbScale, a diferentes modalidades terapêuticas baseadas em anticorpos.
Introduction
Nas últimas duas décadas, os bioterapêuticos evoluíram para se tornarem um pilar da indústria farmacêutica moderna. A pandemia de SARS-CoV2 e outras condições com risco de vida aumentaram ainda mais a necessidade de desenvolvimento mais rápido e mais amplo de moléculas biofarmacêuticas 1,2,3.
O peso molecular bioterapêutico é crítico para a identificação da molécula, em combinação com outros ensaios analíticos. As massas intactas e reduzidas das subunidades são utilizadas ao longo dos ciclos de vida de descoberta e desenvolvimento como parte das estratégias de controle que visam à manutenção da qualidade, conforme descrito no QTPP (Quality Target Product Profile)4.
O desenvolvimento analítico na indústria biofarmacêutica depende fortemente de medições de massa para análise de massa intacta e caracterização profunda usando mapeamento de peptídeos ou monitoramento de método multiatributo (MAM). No centro dessas técnicas que utilizam plataformas modernas de espectrometria de massa (MS) está a capacidade de fornecer medições de massa precisas de alta resolução (HR/AM). A maioria dos instrumentos HR/AM produz precisão de massa na faixa de 0,5-5 ppm, que escala com a faixa de massa. A capacidade de medir massas com precisão para moléculas grandes intactas permite a identificação rápida e confiável de terapias de moléculas grandes. Como a resolução isotópica não pode ser obtida usando condições experimentais típicas para moléculas grandes (>10 kDa), massas médias devem ser calculadas para comparação e identificação 5,6.
Um espectro de massa de proteína intacto ou subunidade típico representa o perfil proteoforme geral, que contém informações compostas sobre as várias formas moleculares resultantes de modificações pós-traducionais (PTM) e quaisquer diferenças de estrutura primária, como clipes ou variantes de sequência. A natureza relativamente fácil e de alto rendimento dessas medições as torna atraentes para caracterização e como controles de monitoramento em processo 7,8. A análise de dados para esses experimentos geralmente requer que o usuário defina o espaço de busca para formas moleculares (gama de PTMs ou outras formas moleculares). Para proteínas glicosiladas, esse espaço de busca é em grande parte impulsionado pela heterogeneidade de glicoformas. Combinações de múltiplos PTMs, configurações de ligações dissulfeto e outras variações ao longo da estrutura primária tornam o cálculo de todas as formas moleculares possíveis uma tarefa tediosa. Portanto, o cálculo manual das possíveis formas moleculares é um processo que consome tempo e recursos e com alto potencial de erro humano.
Aqui, apresentamos uma ferramenta de cálculo de massa que foi desenvolvida considerando as características mais importantes de moléculas bioterapêuticas, como mAbs, bsAbs, ADCs, etc. A ferramenta permite a fácil incorporação de variáveis do espaço de busca para o cálculo consistente de massas e composições elementares. A natureza modular desta ferramenta permitirá que ela seja desenvolvida e aplicada ao cálculo de massa e à correspondência de massa para outras modalidades.
O módulo GUI permite que o usuário especifique a entrada para o cálculo de massa, como mostrado na Figura 1; Especificamente, o usuário insere sequências de aminoácidos de letra única para cadeias de anticorpos leves e pesadas. Modificações comuns para ciclização de N-terminal de cadeia pesada e clipagem de lisina C-terminal estão incluídas como caixas de seleção. Além disso, a fórmula química/composição elementar pode ser adicionada/subtraída dessas cadeias proteicas através da respectiva caixa de texto Chem Mod . Isso permite ao usuário a flexibilidade de adicionar uma composição elementar que inclui várias modificações pós-traducionais ou uma carga útil de pequena molécula no caso de um ADC. Como a maioria dos mAbs terapêuticos são projetados para remover os locais de glicosilação na cadeia leve, a glicosilação na cadeia leve é opcional e pode ser especificada usando uma caixa de seleção na GUI.
Uma variação típica na análise de massa intacta para anticorpos é uma análise de massa de subunidade reduzida, onde a cadeia leve é destacada da cadeia pesada reduzindo as ligações dissulfeto entre cadeias. Dependendo da força do agente redutor utilizado, as ligações dissulfeto intrachain podem ou não ser clivadas. Os usuários têm a flexibilidade de inserir o número total de ligações dissulfeto dependendo do subtipo de IgG ou no caso de um ADC conjugado com cisteína9.
O aplicativo calcula massas de uma maneira ascendente, na qual as composições elementares são primeiro calculadas para as cadeias pesadas individuais e cadeias leves. Em seguida, a ciclização N-terminal de cadeia pesada (HC) Lys-clipping é contabilizada ajustando as composições elementares calculadas. Quaisquer modificações químicas especificadas são então aplicadas às cadeias pesadas e/ou leves. Dependendo do tipo de análise e dos padrões de ligação dissulfeto especificados pelo usuário, o número de hidrogênios é ajustado para as duas cadeias polipeptídicas. As massas de HC glicosilado e de cadeia leve (LC) (opcional) são calculadas com base na entrada do usuário. Finalmente, múltiplas massas HC e LC são combinadas, e os números de ligação dissulfeto são atualizados automaticamente para o cálculo da massa intacta.
Com moléculas maiores, como proteínas intactas, as massas monoisotópicas não podem ser medidas devido ao defeito de massa aditivo ao usar espectrômetros de massa com poder de resolução típico. Em vez disso, massas nominais ou médias são medidas ou relatadas 5,10,11,12,13. As massas elementares médias podem variar de acordo com a fonte utilizada para as massas curadas14,15. Embora as diferenças nas massas elementares possam ser pequenas, elas podem somar valores significativos para cálculos de peso molecular de moléculas grandes. As massas elementares médias usadas por padrão no aplicativo de software são mostradas na Tabela Suplementar 1. Para ambientes regulados, como o campo de pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico (P&D), é importante manter massas moleculares consistentes, pois mudanças nas massas podem implicar mudanças na entidade molecular durante os registros regulatórios. Para permitir a consistência no uso de massas elementares, um dicionário de massas elementares é incluído com a ferramenta de software como um arquivo de texto de valor separado por vírgula (csv): Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Da mesma forma, uma lista curada de composições de glicanos tipicamente vistas em mAbs está incluída: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Ambos os arquivos são salvos no mesmo local de pasta como um aplicativo executável e podem ser modificados pelo usuário para usar uma lista de massa elementar específica ou biblioteca glicana.
Figura 1: Interface GUI para o aplicativo mAbScale. O módulo GUI permite que o usuário especifique a entrada para o cálculo de massa. O usuário insere sequências de aminoácidos de letra única para as cadeias de anticorpos leves e pesadas. Modificações comuns para a ciclização N-terminal de cadeia pesada e clipagem de lisina C-terminal estão incluídas como caixas de seleção. Fórmulas químicas/composições elementares podem ser adicionadas/subtraídas através da respectiva caixa de texto Chem Mod . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
O fluxo de trabalho de alto nível para mAbScale é mostrado na Figura 2. Cada etapa tem ramificações de decisão internas mais sofisticadas, loops e combinatória. Um fluxo de trabalho algorítmico detalhado descrevendo o processo de cálculo é apresentado na Figura Suplementar 1. A saída do aplicativo é salva em um formato de planilha na pasta selecionada pelo usuário. O arquivo de saída consiste em várias planilhas separadas, que podem ser categorizadas como a entrada do usuário, cálculos de peso molecular e referências para as derivações de massa isotópica média (saída de exemplo é fornecida em tabelas suplementares). As planilhas de entrada do usuário incluem as sequências de aminoácidos proteicos e outras informações inseridas pelo usuário, massas elementares médias e massas glicanas, que são usadas para calcular a composição elementar e diferentes pesos moleculares. As folhas de cálculo de peso molecular incluem a composição química de várias formas, a massa reduzida com e sem glicosilação e modificação química, e a massa intacta com e sem glicosilação e modificação química. Folhas contendo massas de semianticorpos serão geradas automaticamente se o usuário inserir dois HCs diferentes e/ou dois LCs diferentes na página de entrada do usuário, uma vez que os meio-anticorpos são impurezas primárias que precisam ser identificadas e quantificadas em relação ao heterodímero desejado. O código-fonte do mAbScale pode ser acessado através do seguinte repositório: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
Figura 2: Visão geral das etapas envolvidas no cálculo de composições elementares e massas usando o aplicativo. A codificação de cores pode ser usada para vincular ao fluxo de processo descrito na Figura 1 Suplementar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Abrindo o aplicativo mAbscale
- Abra o aplicativo de software clicando duas vezes no ícone do arquivo executável.
2. Entrada de sequência
- Insira as sequências heavy-chain e light-chain nas respectivas caixas de texto marcadas com 1 sem espaços.
- Para bsAbs, adicione cadeias pesadas ou leves adicionais no segundo conjunto de caixas de texto marcadas como 2. Deixe 2 em branco para mAbs com correntes pesadas e correntes leves idênticas.
- Marque as caixas de seleção N-Terminal Cyclization e/ou C-Terminal Clipping , se essas variantes de terminal de cadeia pesada forem aplicáveis.
- Adicione quaisquer modificações químicas, incluindo linker e carga útil para moléculas ADC, às caixas de texto Heavy Chain Chem Mod e/ou Light Chain Chem Mod.
- Especifique modificações como composições elementares, como CaCl2. A modificação será adicionada à respectiva subunidade ou cadeia proteica.
NOTA: Uma composição química também pode ser subtraída de uma subunidade ou cadeia prefixando a composição elementar com um sinal -. Por exemplo, -H2O subtrairá uma molécula de água da composição e massa da subunidade.
- Especifique modificações como composições elementares, como CaCl2. A modificação será adicionada à respectiva subunidade ou cadeia proteica.
3. Especificação do número de ligações dissulfeto
- Especifique o número de ligações dissulfeto nas moléculas de proteína na caixa de texto marcada Número Total de Dissulfetos.
- Insira o número de dissulfetos de HC não reduzidos na caixa de texto Dissulfetos de HC não reduzidos e o número de dissulfetos de LC não reduzidos na caixa de texto Dissulfetos de LC não reduzidos , dependendo da extensão da redução (completa versus parcial).
NOTA: A análise de massa reduzida das subunidades mAb envolve a redução/separação das cadeias pesadas e leves ligadas ao dissulfeto. - Se a glicosilação estiver presente na cadeia leve mAb, marque a caixa de seleção Cadeia leve é glicosilada .
4. Definindo a pasta de saída e executando o aplicativo
- Clique no botão Procurar para selecionar uma pasta de saída para a caixa de texto Pasta de saída .
- Digite o nome do arquivo de saída sem uma extensão de arquivo (salva automaticamente como .xlsx) na caixa de texto Arquivo do Excel (sem ext).
- Clique no botão Enviar para iniciar o aplicativo. O arquivo de saída pode ser encontrado na pasta designada.
NOTA: As massas elementares e a lista de glicanos podem ser personalizadas editando os arquivos de texto delimitados Element_Mass.csv (Arquivo de Codificação Suplementar 1) e Glicano.csv (Arquivo de Codificação Suplementar 2), respectivamente. Esses arquivos devem ser colocados na mesma pasta que o arquivo executável mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) para que o aplicativo seja executado. O aplicativo será fechado automaticamente após uma execução. O usuário terá que iniciar o aplicativo novamente se um segundo cálculo for necessário.
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Representative Results
Uma variedade de mAbs foi selecionada para representar diferentes tipos de mAbs. Um padrão de mAb comercialmente disponível foi selecionado para representar um mAb convencional com cadeias pesadas idênticas, cadeias leves idênticas e um sítio de glicosilação N-ligado na região Fc. Um mAb com uma cadeia leve adicional N-glicosilação ligada, um mAb biespecífico e um mAb conjugado anticorpo-droga (ADC) também foram escolhidos para ampliar o uso da aplicação. A composição química, a massa calculada, a massa medida e o erro de massa desses exemplos de mAbs estão resumidos na Tabela 1. As composições químicas de proteínas e massas calculadas relatadas pelo mAbScale foram confirmadas pelo GPMAW16, um programa de análise de estrutura primária de proteínas e peptídeos.
Para a análise da massa intacta, as amostras de mAb foram diluídas a 1 mg/mL usando água grau LC-MS e injetadas para análise. Para a análise reduzida, as amostras foram primeiramente tratadas com diitreitol e incubadas a 37 °C por 15 min para clivar as ligações dissulfeto entre cadeias. Todas as amostras foram analisadas utilizando um sistema Acquity UPLC acoplado a um espectrômetro de massas. Uma coluna BEH 200 SEC foi empregada para dessalinização on-line e separação das cadeias pesada e leve usando um método isocrático com água/acetonitrila (65:35) e TFA 0,1% como fase móvel. O espectrômetro de massas foi operado no modo de íons positivos, e os dados foram adquiridos com uma faixa de varredura de 700-5.000 m/z.
Os fluxos de trabalho intactos e reduzidos da Protien Metrics, Inc (PMi) Byos foram usados para processar os espectros brutos intactos e reduzidos, respectivamente. A faixa de massa proteica foi ajustada para 143.000-163.000 Da para a deconvolução de massa intacta, 47.000-53.000 Da para a deconvolução de massa HC e 20.000-27.000 Da para a deconvolução de massa LC. Para o mapeamento automatizado massa/pico, a diferença mínima entre os picos de massa foi ajustada para 15 Da, e o número máximo de picos de massa foi limitado a 10. Uma lista de glicanos esperados foi inserida/selecionada para a guia de correspondência de massa, e o limite superior para a tolerância de correspondência de massa foi definido como 10 Da.
Os pequenos erros de massa entre as massas calculadas e as massas medidas estavam dentro dos critérios normais de aceitação do erro de massa (≤10 Da para mAbs intactos, ≤5 Da para cadeias pesadas reduzidas e cadeias leves, respectivamente), sugerindo que as massas calculadas foram precisas17.
Para o cálculo das massas teóricas de ADC, uma modificação química com a composição elementar do ligador/carga útil pode ser adicionada a subunidades específicas de mAb. No entanto, apenas o peso molecular de uma massa da razão de carga do fármaco será incluído na saída. A massa molecular composta de anticorpos com diferentes razões de carga de fármacos deve ser adicionada manualmente pelo usuário. Esses recursos poderiam ser adicionados em uma versão posterior do mAbScale ou poderiam ser modificados com o apoio da comunidade, dada a natureza de código aberto deste projeto.
Tabela 1: Comparação das massas calculadas e medidas para várias subunidades de mAb e formas moleculares. As composições químicas, massas calculadas, massas medidas e erros de massa de mAbs de exemplo são resumidos nesta tabela. Clique aqui para baixar esta tabela.
Figura suplementar 1: Fluxo de trabalho algorítmico detalhado para mAbScale. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: As massas elementares médias calculadas utilizadas na Escala mAb14,15. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de Codificação Suplementar 1: Lista de massas elementares. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 2: Lista de glicanos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 3: Aplicativo empacotado - executável mAbScale. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O mAbScale fornece uma interface de usuário intuitiva com a flexibilidade de alterar os blocos de construção para cálculos elementares e de massa. Espera-se que os usuários tenham uma compreensão básica da molécula-alvo para usar a aplicação, derivar massas corretas e interpretar os resultados. Por exemplo, a folha de saída de massa intacta ou reduzida pode ser esmagadora devido às numerosas fileiras de massas intactas ou reduzidas, uma vez que o banco de dados de glicanos padrão contém 88 glicanos ligados a N que são comumente encontrados na porção Fc de anticorpos terapêuticos, e o aplicativo calcula todas as massas glicoformes possíveis que estão incluídas no banco de dados18, 19º. Enquanto a maioria dos mAbs terapêuticos são projetados para remover a glicosilação na região de Fab, alguns mAbs podem reter esse local de glicosilação, e isso poderia aumentar ainda mais o número total de proteoformas glicosiladas. Recomenda-se que os usuários curem um banco de dados de glicanos que se concentre nas glicoformas mais apropriadas para uma determinada molécula para reduzir a complexidade da saída e alinhar melhor os resultados com as massas medidas para identificação do pico de massa.
O nível de complexidade aumenta ainda mais com os bsAbs devido à heterogeneidade das cadeias leve e pesada. Este software gera todas as permutações e combinações possíveis com as sequências e glicoformas LC e HC fornecidas para permitir a geração de todos os subprodutos potenciais a partir do pareamento incorreto ou emparelhamento incompleto das subunidades de anticorpos, como meios-anticorpos. Isso deixa a cargo do usuário filtrar os proteoformes mais adequados para seu uso. A saída do software divide as saídas glicosiladas e não glicosiladas em planilhas separadas, o que torna mais fácil para o usuário revisar. As massas moleculares intactas e reduzidas também são segregadas, e todas as combinações possíveis de meio-anticorpos para bsAbs são listadas em uma planilha dedicada para simplificar ainda mais a absorção dos resultados processados.
Uma limitação da versão atual do software é que o aplicativo calcula as massas de ADC com apenas uma relação fármaco/anticorpo ao mesmo tempo, uma vez que a estrutura química da carga útil é inserida nas caixas de texto Heavy Chain Chem Mod e Light Chain Chem Mod. Para cada relação fármaco/anticorpo (DAR), a composição elementar precisa ser inserida pelo usuário para recálculo.
A capacidade de calcular massas para proteínas intactas é fornecida por várias aplicações, mas elas requerem uma licença comercial para serem compradas ou são ferramentas baseadas na web que exigem que as sequências de proteínas sejam carregadas 16,20,21. Essas aplicações oferecem flexibilidade muito limitada ao usuário para adicionar modificações químicas personalizadas ou incorporar facilmente ligações intramoleculares, como dissulfetos. Além disso, o valor de aplicativos baseados na Web é limitado quando informações proprietárias e confidenciais estão envolvidas, como no desenvolvimento farmacêutico ou em outros ambientes controlados, porque as informações da sequência bioterapêutica não podem ser carregadas em servidores externos. Consequentemente, os pesquisadores devem confiar em cálculos manuais ou rotinas programáticas que são menos flexíveis, difíceis de disseminar e podem levar a inconsistências.
Desenvolvemos uma estrutura de código aberto para o cálculo de massa molecular e composição elementar com foco em aliviar as restrições associadas às aplicações existentes. O aplicativo de desktop autônomo com uma GUI superará as restrições associadas ao upload de informações proprietárias para servidores externos e permitirá fácil acesso para os usuários. Essa ferramenta pode ser usada para as modalidades bioterapêuticas mais comuns, incluindo mAbs, bsAbs e ADCs. Além disso, a gama de modificações e massas elementares de origem pode ser facilmente personalizada para atender às necessidades do usuário. A natureza flexível desse fluxo de trabalho permitirá que o desenvolvimento futuro inclua aplicações em outras modalidades terapêuticas, como terapias de proteínas não-mAb, vacinas de várias subunidades e oligonucleotídeos ou mRNA. Ao tornar este framework open-source, esperamos envolver a comunidade em maior desenvolvimento e adaptação a outras modalidades, bem como na adição de mais recursos, como o cálculo de fragmentos teóricos para interrogação de dados de EM de cima para baixo.
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Disclosures
Este software está sendo lançado sob a licença Apache 2.0. Direitos autorais (2022) da GlaxoSmithKline Research &Development Limited. Todos os direitos reservados. Licenciado sob a Licença Apache, Versão 2.0 (a "Licença"); você não pode usar este arquivo, exceto em conformidade com a Licença. Você pode obter uma cópia da Licença em http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. A menos que exigido pela lei aplicável ou acordado por escrito, o software distribuído sob a Licença é distribuído "no estado em que se encontra", sem garantias ou condições de qualquer tipo, expressas ou implícitas. Consulte a Licença para o idioma específico que rege as permissões e limitações sob a Licença. L.C. é funcionário da GlaxoSmithKline (GSK). T.H. e K.K. desenvolveram este software como funcionários da GSK e agora são associados da Merck e da Moderna, respectivamente.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Robert Schuster pela ajuda na verificação dos dados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
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