Summary
Questo articolo descrive l'uso di un'applicazione software, mAbScale, per il calcolo delle masse per terapie proteiche basate su anticorpi monoclonali.
Abstract
Le masse bioterapeutiche sono un mezzo per verificare l'identità e l'integrità strutturale. La spettrometria di massa (MS) di proteine intatte o subunità proteiche fornisce un semplice strumento analitico per le diverse fasi dello sviluppo biofarmaceutico. L'identità della proteina è confermata quando la massa sperimentale della MS è all'interno di un intervallo di errore di massa predefinito della massa teorica. Sebbene esistano diversi strumenti computazionali per il calcolo dei pesi molecolari di proteine e peptidi, non sono stati progettati per l'applicazione diretta a entità bioterapeutiche, hanno limitazioni di accesso a causa di licenze a pagamento o richiedono il caricamento di sequenze proteiche su server host.
Abbiamo sviluppato una routine modulare di calcolo della massa che consente di determinare facilmente le masse medie o monoisotopiche e le composizioni elementari delle glicoproteine terapeutiche, compresi gli anticorpi monoclonali (mAb), gli anticorpi bispecifici (bsAb) e i coniugati anticorpo-farmaco (ADC). La natura modulare di questo framework di calcolo basato su Python consentirà in futuro l'estensione di questa piattaforma ad altre modalità come vaccini, proteine di fusione e oligonucleotidi, e questo framework potrebbe anche essere utile per l'interrogazione di dati di spettrometria di massa top-down. Creando un'applicazione desktop autonoma open source con un'interfaccia utente grafica (GUI), speriamo di superare le restrizioni relative all'uso in ambienti in cui le informazioni proprietarie non possono essere caricate su strumenti basati sul Web. Questo articolo descrive gli algoritmi e l'applicazione di questo strumento, mAbScale, a diverse modalità terapeutiche basate su anticorpi.
Introduction
Negli ultimi due decenni, la bioterapia si è evoluta fino a diventare un pilastro della moderna industria farmaceutica. La pandemia di SARS-CoV2 e altre condizioni potenzialmente letali hanno ulteriormente aumentato la necessità di uno sviluppo più rapido e più ampio di molecole biofarmaceutiche 1,2,3.
Il peso molecolare bioterapeutico è fondamentale per l'identificazione della molecola, in combinazione con altri saggi analitici. Le masse delle subunità intatte e ridotte sono utilizzate durante tutto il ciclo di vita della scoperta e dello sviluppo come parte delle strategie di controllo volte a mantenere la qualità, come descritto nel QTPP (Quality Target Product Profile)4.
Lo sviluppo analitico nell'industria biofarmaceutica si basa in larga misura sulle misurazioni di massa per l'analisi della massa intatta e la caratterizzazione profonda utilizzando la mappatura dei peptidi o il monitoraggio con il metodo multi-attributo (MAM). Al centro di queste tecniche che utilizzano le moderne piattaforme di spettrometria di massa (MS) c'è la capacità di fornire misurazioni di massa accurate ad alta risoluzione (HR/AM). La maggior parte degli strumenti HR/AM produce precisioni di massa nell'intervallo di 0,5-5 ppm, che scalano con l'intervallo di massa. La capacità di misurare con precisione le masse per le grandi molecole intatte consente l'identificazione rapida e sicura delle terapie a grandi molecole. Poiché la risoluzione isotopica non può essere raggiunta utilizzando le condizioni sperimentali tipiche per molecole di grandi dimensioni (>10 kDa), è necessario calcolare le masse medie per il confronto e l'identificazione 5,6.
Un tipico spettro di massa di proteine intatte o subunità rappresenta il profilo complessivo della proteoforma, che contiene informazioni composite sulle varie forme molecolari risultanti da modificazioni post-traduzionali (PTM) e da eventuali differenze di struttura primarie, come clip o varianti di sequenza. La natura relativamente semplice e ad alta produttività di queste misure le rende interessanti per la caratterizzazione e come controlli di monitoraggio in-process 7,8. L'analisi dei dati per questi esperimenti di solito richiede all'utente di definire lo spazio di ricerca per le forme molecolari (gamma di PTM o altre forme molecolari). Per le proteine glicosilate, questo spazio di ricerca è in gran parte guidato dall'eterogeneità dei glicoformi. Le combinazioni di più PTM, le configurazioni del legame disolfuro e altre variazioni lungo la struttura primaria rendono il calcolo di tutte le possibili forme molecolari un compito noioso. Pertanto, il calcolo manuale delle possibili forme molecolari è un processo che richiede tempo e risorse con un alto potenziale di errore umano.
Qui presentiamo uno strumento di calcolo della massa che è stato sviluppato considerando le caratteristiche più importanti delle molecole bioterapeutiche, come mAbs, bsAbs, ADC, ecc. Lo strumento consente di incorporare facilmente le variabili dello spazio di ricerca per il calcolo coerente delle masse e delle composizioni elementari. La natura modulare di questo strumento consentirà di svilupparlo ulteriormente e di applicarlo al calcolo della massa e alla corrispondenza della massa per altre modalità.
Il modulo GUI consente all'utente di specificare l'input per il calcolo della massa, come mostrato in Figura 1; In particolare, l'utente inserisce sequenze di amminoacidi di una sola lettera per catene di anticorpi leggeri e pesanti. Le modifiche comuni per la ciclizzazione N-terminale a catena pesante e il clipping della lisina con terminale C sono incluse come caselle di controllo. Inoltre, la formula chimica/composizione elementare può essere aggiunta/sottratta da queste catene proteiche attraverso la rispettiva casella di testo Chem Mod . Ciò consente all'utente la flessibilità di aggiungere una composizione elementare che include più modifiche post-traduzionali o un carico utile di piccole molecole nel caso di un ADC. Poiché la maggior parte degli anticorpi monoclonali terapeutici sono progettati per rimuovere i siti di glicosilazione nella catena leggera, la glicosilazione nella catena leggera è lasciata facoltativa e può essere specificata utilizzando una casella di controllo sulla GUI.
Una variante tipica dell'analisi della massa intatta per gli anticorpi è un'analisi di massa a subunità ridotte, in cui la catena leggera viene staccata dalla catena pesante riducendo i legami disolfuro intercatena. A seconda della forza dell'agente riducente utilizzato, i legami disolfuro intracatena possono essere scissi o meno. Gli utenti hanno la flessibilità di inserire il numero totale di legami disolfuro a seconda del sottotipo di IgG o nel caso di un ADC9 coniugato con cisteina.
L'applicazione calcola le masse in modo bottom-up, in cui le composizioni elementari vengono prima calcolate per le singole catene pesanti e catene leggere. Successivamente, la ciclizzazione N-terminale della catena pesante (HC) Lys-clipping viene presa in considerazione regolando le composizioni elementari calcolate. Eventuali modifiche chimiche specificate vengono quindi applicate alle catene pesanti e/o leggere. A seconda del tipo di analisi e dei modelli di legame disolfuro specificati dall'utente, il numero di idrogeni viene regolato per le due catene polipeptidiche. Le masse glicosilate HC e catene leggere (LC) (facoltative) vengono calcolate in base all'input dell'utente. Infine, vengono combinate più masse HC e LC e i numeri di legame disolfuro vengono aggiornati automaticamente per il calcolo della massa intatta.
Con molecole più grandi come le proteine intatte, le masse monoisotopiche non possono essere misurate a causa del difetto di massa additivo quando si utilizzano spettrometri di massa con il tipico potere risolutivo. Invece, le masse nominali o medie sono misurate o riportate 5,10,11,12,13. Le masse elementari medie possono variare in base alla fonte utilizzata per le masse curate14,15. Sebbene le differenze nelle masse elementari possano essere piccole, possono sommarsi a valori significativi per i calcoli del peso molecolare di grandi molecole. Le masse elementari medie utilizzate per impostazione predefinita nell'applicazione software sono mostrate nella Tabella supplementare 1. Per gli ambienti regolamentati come il campo della ricerca e sviluppo biofarmaceutico (R&S), è importante mantenere masse molecolari coerenti perché le variazioni delle masse possono implicare modifiche all'entità molecolare durante i depositi normativi. Per garantire la coerenza nell'uso delle masse elementari, un dizionario delle masse elementari è incluso nello strumento software come file di testo con valori separati da virgole (csv): Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Allo stesso modo, è incluso un elenco curato di composizioni di glicani tipicamente viste sugli anticorpi monoclonali: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Entrambi i file vengono salvati nella stessa cartella di un'applicazione eseguibile e possono essere modificati dall'utente per utilizzare uno specifico elenco di masse elementari o una libreria di glicani.
Figura 1: Interfaccia GUI per l'applicazione mAbScale. Il modulo GUI consente all'utente di specificare l'input per il calcolo della massa. L'utente inserisce sequenze di amminoacidi di una sola lettera per le catene di anticorpi leggeri e pesanti. Le modifiche comuni per la ciclizzazione N-terminale a catena pesante e il clipping della lisina C-terminale sono incluse come caselle di controllo. Le formule chimiche/composizioni elementari possono essere aggiunte/sottratte tramite la rispettiva casella di testo Chem Mod . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Il flusso di lavoro di alto livello per mAbScale è illustrato nella Figura 2. Ogni fase ha rami decisionali interni più sofisticati, cicli e combinatoria. Un flusso di lavoro algoritmico dettagliato che descrive il processo di calcolo è presentato nella Figura 1 supplementare. L'output dell'applicazione viene salvato in formato foglio di calcolo nella cartella selezionata dall'utente. Il file di output è costituito da più fogli di lavoro separati, che possono essere classificati come input dell'utente, calcoli del peso molecolare e riferimenti per le derivazioni di massa isotopiche medie (l'output di esempio è fornito in tabelle supplementari). I fogli di lavoro di input dell'utente includono le sequenze di amminoacidi proteici e altre informazioni inserite dall'utente, le masse elementari medie e le masse dei glicani, che vengono utilizzate per calcolare la composizione elementare e i diversi pesi molecolari. I fogli di calcolo del peso molecolare includono la composizione chimica di varie forme, la massa ridotta con e senza glicosilazione e modificazione chimica e la massa intatta con e senza glicosilazione e modificazione chimica. I fogli contenenti le masse di semi-anticorpi verranno generati automaticamente se l'utente inserisce due diversi HC e/o due diversi LC nella pagina di input dell'utente, poiché i semianticorpi sono impurezze primarie che devono essere identificate e quantificate rispetto all'eterodimero desiderato. È possibile accedere al codice sorgente di mAbScale tramite il seguente repository: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
Figura 2: Panoramica dei passaggi coinvolti nel calcolo delle composizioni elementari e delle masse utilizzando l'applicazione. La codifica a colori può essere utilizzata per collegarsi al flusso di processo descritto nella Figura 1 supplementare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Apertura dell'applicazione mAbscale
- Aprire l'applicazione software facendo doppio clic sull'icona del file eseguibile.
2. Inserimento della sequenza
- Immettere le sequenze di catene pesanti e catene leggere nelle rispettive caselle di testo contrassegnate con 1 senza spazi.
- Per i bsAbs, aggiungi altre catene pesanti o leggere nella seconda serie di caselle di testo contrassegnate con 2. Lasciare 2 vuoti per gli anticorpi monoclonali con catene pesanti identiche e catene leggere.
- Selezionare le caselle di controllo N-Terminal Cyclization e/o C-Terminal Clipping , se queste varianti di terminali a catena pesante sono applicabili.
- Aggiungere eventuali modifiche chimiche, inclusi linker e payload per le molecole ADC, alle caselle di testo Heavy Chain Chem Mod e/o Light Chain Chem Mod.
- Specificate le modifiche come composizioni elementari, ad esempio CaCl2. La modifica verrà aggiunta alla rispettiva subunità o catena proteica.
NOTA: Una composizione chimica può anche essere sottratta da una subunità o catena anteponendo alla composizione elementare un segno -. Ad esempio, -H2O sottrarrà una molecola d'acqua dalla composizione e dalla massa della subunità.
- Specificate le modifiche come composizioni elementari, ad esempio CaCl2. La modifica verrà aggiunta alla rispettiva subunità o catena proteica.
3. Specificare il numero di legami disolfuro
- Specificare il numero di legami disolfuro nelle molecole proteiche nella casella di testo Numero totale di disolfuri.
- Immettere il numero di disolfuri di HC non ridotti nella casella di testo Disolfuri di HC non ridotti e il numero di disolfuri LC non ridotti nella casella di testo Disolfuri LC non ridotti, a seconda dell'entità della riduzione (completa o parziale).
NOTA: L'analisi della massa ridotta delle subunità di anticorpi monoclonali comporta la riduzione/separazione delle catene pesanti e leggere legate al disolfuro. - Se la glicosilazione è presente sulla catena leggera mAb, selezionare la casella di controllo La catena leggera è glicosilata .
4. Impostazione della cartella di output ed esecuzione dell'applicazione
- Fare clic sul pulsante Sfoglia per selezionare una cartella di output per la casella di testo Cartella di output .
- Immettere il nome del file di output senza estensione (viene salvato automaticamente come .xlsx) nella casella di testo File Excel (no ext).
- Fare clic sul pulsante Invia per avviare l'applicazione. Il file di output si trova nella cartella designata.
NOTA: Le masse elementari e l'elenco dei glicani possono essere personalizzati modificando i file di testo delimitati Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1) e Glycan.csv (Supplementary Coding File 2), rispettivamente. Questi file devono essere inseriti nella stessa cartella del file eseguibile mAbScale.exe (Supplementary Coding File 3) per l'esecuzione dell'applicazione. L'applicazione verrà chiusa automaticamente dopo un'esecuzione. L'utente dovrà riavviare l'app se è necessario un secondo calcolo.
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Representative Results
È stata selezionata una varietà di anticorpi monoclonali per rappresentare diversi tipi di anticorpi monoclonali. È stato selezionato uno standard di anticorpi monoclonali disponibile in commercio per rappresentare un anticorpo monoclonale convenzionale con catene pesanti identiche, catene leggere identiche e un sito di glicosilazione legato all'N nella regione Fc. Per ampliare l'utilizzo dell'applicazione sono stati scelti anche un anticorpo monoclonale con un'ulteriore glicosilazione legata all'azoto a catena leggera, un anticorpo monoclonale bispecifico e un anticorpo monoclonale coniugato anticorpo-farmaco (ADC). La composizione chimica, la massa calcolata, la massa misurata e l'errore di massa di questi anticorpi monoclonali di esempio sono riassunti nella Tabella 1. Le composizioni chimiche delle proteine e le masse calcolate riportate da mAbScale sono state confermate da GPMAW16, un programma per l'analisi della struttura primaria di proteine e peptidi.
Per l'analisi della massa intatta, i campioni di anticorpi monoclonali sono stati diluiti a 1 mg/mL utilizzando acqua di grado LC-MS e iniettati per l'analisi. Per l'analisi ridotta, i campioni sono stati prima trattati con dititreitolo e incubati a 37 °C per 15 minuti per scindere i legami disolfuro intercatena. Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando un sistema Acquity UPLC accoppiato ad uno spettrometro di massa. Una colonna BEH 200 SEC è stata impiegata per la desalinizzazione in linea e la separazione delle catene pesanti e leggere utilizzando un metodo isocratico con acqua/acetonitrile (65:35) e 0,1% TFA come fase mobile. Lo spettrometro di massa è stato utilizzato in modalità a ioni positivi e i dati sono stati acquisiti con un intervallo di scansione di 700-5.000 m/z.
I flussi di lavoro intatti e ridotti di Protien Metrics, Inc. (PMi) Byos sono stati utilizzati per elaborare rispettivamente gli spettri grezzi intatti e ridotti. L'intervallo di massa della proteina è stato impostato a 143.000-163.000 Da per la deconvoluzione di massa intatta, 47.000-53.000 Da per la deconvoluzione di massa HC e 20.000-27.000 Da per la deconvoluzione di massa LC. Per il prelievo automatico di massa/picco, la differenza minima tra i picchi di massa è stata impostata a 15 Da e il numero massimo di picchi di massa è stato limitato a 10. È stato inserito/selezionato un elenco di glicani attesi per la scheda di corrispondenza della massa e il limite superiore per la tolleranza di corrispondenza della massa è stato impostato su 10 Da.
I piccoli errori di massa tra le masse calcolate e le masse misurate erano all'interno dei normali criteri di accettazione dell'errore di massa (≤10 Da per gli anticorpi monoclonali intatti, ≤5 Da per le catene pesanti ridotte e le catene leggere, rispettivamente), suggerendo che le masse calcolate erano accurate17.
Per il calcolo delle masse teoriche dell'ADC, è possibile aggiungere una modifica chimica con la composizione elementare del linker/payload a specifiche subunità di anticorpi monoclonali. Tuttavia, solo il peso molecolare di una massa del rapporto di carico del farmaco sarà incluso nell'output. La massa molecolare composita degli anticorpi con diversi rapporti di carico del farmaco deve essere aggiunta manualmente dall'utente. Queste funzionalità potrebbero essere aggiunte in una versione successiva di mAbScale o potrebbero essere modificate con il supporto della comunità, data la natura open source di questo progetto.
Tabella 1: Confronto delle masse calcolate e misurate per varie subunità e forme molecolari di anticorpi monoclonali. Le composizioni chimiche, le masse calcolate, le masse misurate e gli errori di massa degli anticorpi monoclonali di esempio sono riepilogati in questa tabella. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Figura 1 supplementare: Flusso di lavoro algoritmico dettagliato per mAbScale. Fare clic qui per scaricare il file.
Tabella supplementare 1: Le masse elementari medie calcolate utilizzate in mAbScale14,15. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 1: Elenco delle masse elementari. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 2: Elenco dei glicani. Fare clic qui per scaricare il file.
File di codifica supplementare 3: applicazione in bundle - eseguibile mAbScale. Fare clic qui per scaricare il file.
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Discussion
mAbScale fornisce un'interfaccia utente intuitiva con la flessibilità di modificare gli elementi costitutivi per i calcoli di massa ed elementari. Ci si aspetta che gli utenti abbiano una conoscenza di base della molecola bersaglio per utilizzare l'applicazione, derivare le masse corrette e interpretare i risultati. Ad esempio, il foglio di uscita di massa intatto o ridotto può essere travolgente a causa delle numerose file di masse intatte o ridotte, poiché il database predefinito dei glicani contiene 88 glicani legati all'N che si trovano comunemente nella porzione Fc degli anticorpi terapeutici e l'applicazione calcola tutte le possibili masse glicoformi incluse nel database18, Ore 19. Mentre la maggior parte degli anticorpi monoclonali terapeutici sono progettati per rimuovere la glicosilazione nella regione Fab, alcuni anticorpi monoclonali potrebbero mantenere questo sito di glicosilazione e questo potrebbe aumentare ulteriormente il numero totale di proteoforme glicosilate. Si raccomanda agli utenti di curare un database di glicani che si concentri sulle glicoforme più appropriate per una determinata molecola per ridurre la complessità dell'output e per allineare meglio i risultati con le masse misurate per l'identificazione dei picchi di massa.
Il livello di complessità aumenta ulteriormente con i bsAbs a causa dell'eterogeneità delle catene leggere e pesanti. Questa applicazione software genera tutte le possibili permutazioni e combinazioni con le sequenze e le glicoforme LC e HC fornite per consentire la generazione di tutti i potenziali sottoprodotti dal disaccoppiamento o dall'accoppiamento incompleto delle subunità anticorpali, come i semi-anticorpi. Questo lascia all'utente il compito di filtrare le proteoforme più appropriate per il loro utilizzo. L'output del software divide gli output glicosilati e non glicosilati in fogli di lavoro separati, il che facilita la revisione da parte dell'utente. Anche le masse molecolari intatte e ridotte sono segregate e tutte le possibili combinazioni di semianticorpi per i bsAbs sono elencate in un foglio di lavoro dedicato per semplificare ulteriormente l'assorbimento dei risultati elaborati.
Una limitazione dell'attuale versione del software è che l'applicazione calcola le masse dell'ADC con un solo rapporto farmaco/anticorpo alla volta, poiché la struttura chimica del carico utile viene immessa nelle caselle di testo Heavy Chain Chem Mod e Light Chain Chem Mod. Per ogni rapporto farmaco/anticorpo (DAR), la composizione elementare deve essere inserita dall'utente per il ricalcolo.
La capacità di calcolare le masse per le proteine intatte è fornita da diverse applicazioni, ma richiedono una licenza commerciale per essere acquistate o sono strumenti basati sul web che richiedono il caricamento delle sequenze proteiche 16,20,21. Queste applicazioni offrono all'utente una flessibilità molto limitata per l'aggiunta di modifiche chimiche personalizzate o per incorporare facilmente legami intramolecolari, come i disolfuri. Inoltre, il valore delle applicazioni basate sul Web è limitato quando sono coinvolte informazioni proprietarie e riservate, come nello sviluppo farmaceutico o in altri ambienti controllati, perché le informazioni sulla sequenza bioterapeutica non possono essere caricate su server esterni. Di conseguenza, i ricercatori devono fare affidamento su calcoli manuali o routine programmatiche che sono meno flessibili, difficili da diffondere e potrebbero portare a incongruenze.
Abbiamo sviluppato un framework open-source per il calcolo della massa molecolare e della composizione elementare con l'obiettivo di alleviare le restrizioni associate alle applicazioni esistenti. L'applicazione desktop standalone con una GUI supererà le restrizioni associate al caricamento di informazioni proprietarie su server esterni e consentirà un facile accesso per gli utenti. Questo strumento può essere utilizzato per le modalità bioterapeutiche più comuni, tra cui mAb, bsAbs e ADC. Inoltre, la gamma di modifiche e masse elementari di origine può essere facilmente personalizzata per soddisfare le esigenze dell'utente. La natura flessibile di questo flusso di lavoro consentirà lo sviluppo futuro di includere applicazioni ad altre modalità terapeutiche, come le terapie proteiche non mAb, i vaccini a subunità multipla e gli oligonucleotidi o l'mRNA. Rendendo questo framework open-source, speriamo di coinvolgere la comunità in un ulteriore sviluppo e adattamento ad altre modalità, nonché nell'aggiunta di ulteriori funzionalità, come il calcolo di frammenti teorici per l'interrogazione top-down dei dati MS.
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Disclosures
Questo software viene rilasciato sotto la licenza Apache 2.0. Copyright (2022) di GlaxoSmithKline Research & Development Limited. Tutti i diritti riservati. Concesso in licenza ai sensi della Licenza Apache, Versione 2.0 (la "Licenza"); non è possibile utilizzare questo file se non in conformità con la Licenza. È possibile ottenere una copia della Licenza all'indirizzo http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. A meno che non sia richiesto dalla legge applicabile o concordato per iscritto, il software distribuito ai sensi della Licenza viene distribuito "così com'è", senza garanzie o condizioni di alcun tipo, esplicite o implicite. Vedere la Licenza per la lingua specifica che regola le autorizzazioni e le limitazioni ai sensi della Licenza. L.C. è un dipendente di GlaxoSmithKline (GSK). T.H. e K.K. hanno sviluppato questo software come dipendenti di GSK e ora sono soci rispettivamente di Merck e Moderna.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Robert Schuster per l'assistenza nella verifica dei dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
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