11倍膨張顕微鏡によるユニバーサル分子保持
Summary
ここでは、最大11倍の拡張に変更された拡張顕微鏡(ExM)の新しいバージョンであるMagnifyは、生体分子クラスの包括的な配列を保存し、幅広い組織タイプと互換性があります。これにより、従来の回折限界顕微鏡を使用して生体分子のナノスケール構造を調べることができます。
Abstract
生体試料のナノスケールイメージングは、疾患の病因の理解を深めることができます。近年、膨張顕微鏡(ExM)は、光学超解像顕微鏡法に代わる効果的で低コストの代替手段であることが実証されています。しかし、ゲル内で異なる生体分子クラスを保持するための特異的でしばしばカスタムのアンカー剤の必要性、および特により大きな拡張因子または保存されたタンパク質エピトープが望まれる場合、ホルマリン固定パラフィン包埋組織などの標準的な臨床サンプルフォーマットを拡張することの難しさによって制限されてきました。ここでは、幅広い組織タイプで最大11倍の堅牢な拡張を実現する新しいExMメソッドであるMagnifyについて説明します。組織とゲルの間の化学アンカーとしてメタクロレインを使用することにより、Magnifyはタンパク質、脂質、核酸などの複数の生体分子をゲル内に保持し、従来の光学顕微鏡で組織の広範なナノスケールイメージングを可能にします。このプロトコルでは、堅牢で亀裂のない組織拡張を確保するためのベストプラクティスと、高度に拡張されたゲルの取り扱いとイメージングのヒントについて説明します。
Introduction
生物学的システムは、手足や臓器からナノスケールのタンパク質レベルまで、構造的な不均一性を示します。したがって、これらのシステムの動作を完全に理解するには、これらのサイズスケール全体で目視検査が必要です。しかし、光の回折限界は、従来の蛍光顕微鏡で~200-300nmより小さい構造を可視化する際に課題を引き起こす。さらに、誘導放出空乏法(STED)、光活性化局在顕微鏡(PALM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、構造化照明顕微鏡法(SIM)などの光学超解像法1,2,3は強力ですが、高価なハードウェアと試薬を必要とし、取得時間が遅く、大量の画像を3Dで画像化する能力が低いことが多いため、独自の課題があります。
膨張顕微鏡4(ExM)は、生体分子を水膨潤性ポリマーゲルに共有結合で固定し、物理的に引き離して従来の光学顕微鏡で分解できるようにすることで、光の回折限界を回避する代替手段を提供します。10年足らず前にExMが最初に発表されて以来、多数のExMプロトコルバリアントが開発されており、これらのプロトコルにより、タンパク質5、6、7、RNA8、9、10、または脂質11、12、13を直接組み込むことができます単一のステップ14または複数の反復ステップ15、16のいずれかで、化学的アンカーを変更するか、サンプルをさらに拡張する(したがって、有効分離を改善する)ことにより、ゲルネットワークに導入します。最近まで、単一のExMプロトコルは、単一の市販のケミカルアンカーでこれら3つの生体分子クラスを保持しながら、1回の拡張ラウンドで~10倍に拡張できる機械的に頑丈なゲルを提供することはできませんでした。
ここでは、メタクロレインを生体分子アンカーとして使用するExM兵器庫に最近追加されたMagnify17を紹介します。メタクロレインは、パラホルムアルデヒドのような組織と共有結合を形成し、さまざまな特異的またはカスタムのアンカー剤を必要とせずに、複数のクラスの生体分子をゲルネットワーク内に保持できるようにします。さらに、この手法は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床サンプルなどの悪名高い困難なサンプルを含む、幅広い組織のスペクトルを最大11倍に拡張できます。このような機械的に硬いサンプルを増殖させる以前の方法では、過酷なプロテアーゼ消化が必要となり、サンプルが膨張した後は目的のタンパク質の抗体標識が不可能でした。対照的に、この手法では、高温変性溶液を使用してFFPE臨床サンプルの拡張を実現し、ゲル内の全タンパク質エピトープを保存し、拡張後のイメージングのターゲットにすることができます(図1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、単一の化学的アンカーで複数の生体分子を保持し、熱変性により困難なFFPE臨床検体を最大11倍まで拡張できるExMバリアントであるMagnifyプロトコル17を紹介します。このプロトコルを他のExMプロトコルと区別する主な変更点には、完全に拡張しても機械的に堅牢なままである再製剤化ゲルの使用、および生体分子アンカーとしてのメタクロレインの使用が含まれま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カーネギーメロン大学とD.S.F.慈善財団(Y.Z.およびX.R.)、国立衛生研究所(N.I.H.)の支援を受けました。ディレクターズニューイノベーターアワードDP2 OD025926-01、およびカウフマン財団。
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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