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Biology

Rétention moléculaire universelle avec microscopie à expansion 11 fois

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65338
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

Summary

Une nouvelle version de la microscopie à expansion (ExM), Magnify, modifiée pour une expansion allant jusqu’à 11 fois, conservant une gamme complète de classes de biomolécules et compatible avec un large éventail de types de tissus. Il permet d’interroger la configuration nanométrique de biomolécules à l’aide de microscopes conventionnels à diffraction limitée.

Abstract

L’imagerie à l’échelle nanométrique de spécimens biologiques peut améliorer la compréhension de la pathogenèse de la maladie. Au cours des dernières années, la microscopie à expansion (ExM) s’est avérée être une alternative efficace et peu coûteuse à la microscopie optique à superrésolution. Cependant, il a été limité par le besoin d’agents d’ancrage spécifiques et souvent personnalisés pour conserver différentes classes de biomolécules dans le gel et par les difficultés liées à l’expansion des formats d’échantillons cliniques standard, tels que les tissus incorporés dans la paraffine fixés au formol, en particulier si des facteurs d’expansion plus importants ou des épitopes de protéines préservés sont souhaités. Ici, nous décrivons Magnify, une nouvelle méthode ExM pour une expansion robuste jusqu’à 11 fois dans un large éventail de types de tissus. En utilisant la méthacroléine comme ancrage chimique entre le tissu et le gel, Magnify retient plusieurs biomolécules, telles que des protéines, des lipides et des acides nucléiques, dans le gel, permettant ainsi l’imagerie à grande échelle nanométrique des tissus sur des microscopes optiques conventionnels. Ce protocole décrit les meilleures pratiques pour assurer une expansion tissulaire robuste et sans fissures, ainsi que des conseils pour la manipulation et l’imagerie des gels hautement expansés.

Introduction

Les systèmes biologiques présentent une hétérogénéité structurelle, des membres et des organes jusqu’aux niveaux de protéines à l’échelle nanométrique. Par conséquent, une compréhension complète du fonctionnement de ces systèmes nécessite un examen visuel à travers ces échelles de taille. Cependant, la limite de diffraction de la lumière pose des problèmes de visualisation de structures inférieures à ~200-300 nm sur un microscope à fluorescence conventionnel. En outre, les méthodes optiques de super-résolution 1,2,3, telles que la déplétion par émission stimulée (STED), la microscopie de localisation photoactivée (PALM), la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie à illumination structurée (SIM), bien que puissantes, présentent leurs propres défis, car elles nécessitent du matériel et des réactifs coûteux et ont souvent des temps d’acquisition lents et une faible capacité à imager de grands volumes en 3D.

La microscopieà expansion 4 (ExM) fournit un moyen alternatif de contourner la limite de diffraction de la lumière en ancrant de manière covalente les biomolécules dans un gel polymère gonflable à l’eau et en les séparant physiquement, les rendant ainsi résolvables sur des microscopes optiques conventionnels. Une multitude de variantes du protocole ExM ont été développées depuis la publication originale d’ExM il y a moins d’une décennie, et ces protocoles permettent l’incorporation directe des protéines 5,6,7, ARN 8,9,10, ou lipides11,12,13 dans le réseau de gel en modifiant l’ancrage chimique ou en élargissant davantage l’échantillon (améliorant ainsi la résolution effective) soit en une seule étape14, soit en plusieurs étapes itératives15,16. Jusqu’à récemment, aucun protocole ExM ne pouvait conserver ces trois classes de biomolécules avec un seul ancrage chimique disponible dans le commerce tout en fournissant un gel mécaniquement robuste qui pouvait se dilater ~10 fois en un seul cycle d’expansion.

Ici, nous présentons Magnify17, un ajout récent à l’arsenal ExM qui utilise la méthacroléine comme ancrage de la biomolécule. La méthacroléine forme des liaisons covalentes avec les tissus comme celui du paraformaldéhyde, assurant que plusieurs classes de biomolécules peuvent être retenues dans le réseau de gel sans nécessiter divers agents d’ancrage spécifiques ou personnalisés. De plus, cette technique peut élargir un large spectre de tissus jusqu’à 11 fois, y compris des échantillons notoirement difficiles tels que les échantillons cliniques fixés au formol (FFPE). Les méthodes précédentes pour étendre de tels échantillons mécaniquement rigides nécessitaient une digestion sévère de la protéase, rendant impossible le marquage des anticorps des protéines d’intérêt après l’expansion de l’échantillon. En revanche, cette technique permet d’étendre des échantillons cliniques FFPE à l’aide d’une solution dénaturante à chaud, préservant ainsi les épitopes de protéines entières dans le gel, qui peuvent être ciblés pour l’imagerie post-expansion (Figure 1).

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Protocol

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Carnegie Mellon. Des échantillons de tissus humains ont été obtenus commercialement.

1. Préparation des réactifs et solutions mères

REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour obtenir la liste des réactifs utilisés.

  1. Préparer les solutions de gélifiant. Ceux-ci seront combinés immédiatement avant l’étape de gélification.
    1. Préparer la solution mère de monomères (4 g/100 mL d’acide n,n-diméthylacrylamide [DMAA], 50 g/100 mL d’acrylate de sodium [SA], 66,7 g/100 mL d’acrylamide [AA], 0,10 g/100 mL de N,N′-méthylènebisacrylamide [Bis], 33 g/100 mL de chlorure de sodium [NaCl], 1x solution saline tamponnée au phosphate; PBS) en utilisant les composantes énumérées dans le tableau 1. Dissoudre ou diluer toutes les solutions mères dans l’eau. La solution mère de monomère peut être conservée à 4 °C pendant au moins 3 mois.
    2. Préparer les solutions mères suivantes séparément dans l’eau : 0,5 % (p/p) de 4-hydroxy-TEMPO (4HT), qui inhibe la gélification pendant la diffusion du monomère dans les tissus, et 10 % (p/p) de tétraméthyléthylènediamine (TEMED), qui accélère la génération de radicaux initiée par le persulfate d’ammonium (APS) et est préparée à 10 % (p/p).
      REMARQUE : Les solutions mères peuvent être distribuées dans des aliquotes de 1 à 2 mL et conservées à 4 °C jusqu’à 3 mois; cependant, l’APS est fabriqué immédiatement avant la préparation de la solution gélifiante.
  2. Préparer le tampon d’homogénéisation (1 % p/v de S.D.S., 8 M d’urée, 25 mM d’EDTA, 2x PBS, pH 8, à température ambiante [R.T.]) en combinant 1 g de FDS, 48,048 g d’urée, 5 mL d’EDTA (0,5 M, pH 8), 20 mL de 10x PBS, 25 mL de Tris (2 M) et 0,75 g de glycine. Ajouter de l’eau pour un volume total de 100 mL. La solution peut être mise à l’échelle à la hausse ou à la baisse selon les besoins et peut être stockée chez R.T.

2. Préparation tissulaire pour lames de tissus cliniques archivées et fraîchement préparées

REMARQUE : Les étapes de prétraitement des tissus diffèrent selon la façon dont les échantillons sont préparés.

  1. Pour les échantillons cliniques fixés au formaldéhyde incorporés dans de la paraffine (FFPE), suivez les étapes ci-dessous.
    1. Placer les échantillons dans une série séquentielle de solutions (un pot de coloration en lames de verre ou un tube conique de 50 ml peut être utilisé) : xylène, éthanol à 95 %, éthanol à 70 % et éthanol à 50 %, suivis d’eau doublement désionisée. Utilisez chaque solution deux fois pendant au moins 3 minutes à chaque fois. Utilisez une pince pour placer la lame dans le récipient et ajoutez 15 ml de la solution respective (suffisante pour couvrir l’échantillon). Placer le tube conique coiffé horizontalement sur un agitateur à température ambiante.
  2. Pour les échantillons colorés et montés sur des lames permanentes, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Placez brièvement la lame dans du xylène et retirez délicatement les lamelles de couverture à l’aide d’un outil approprié, tel qu’une lame de rasoir. Si la lamelle de couverture reste coincée, remettez les lames dans le xylène à température ambiante jusqu’à ce que la lamelle de couverture se desserre.
    2. Ensuite, traitez les échantillons comme des échantillons FFPE (étape 2.1.1).
      REMARQUE: Pour les lames colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine est perdue pendant le processus d’expansion.
  3. Pour les lames de tissus congelés non fixées dans une solution à température de coupe optimale (OCT), fixer les tissus dans l’acétone à −20 °C pendant 10 minutes avant de laver les échantillons avec 1x solution de PBS trois fois pendant 10 minutes à chaque fois à température ambiante.
  4. Pour les lames de tissus cliniques congelés préalablement fixées, faire fondre l’OCT en incubant les lames pendant 2 min à température ambiante, puis laver avec 1x solution de PBS trois fois pendant 5 minutes à chaque fois à température ambiante.

3. Préparation tissulaire pour le cerveau de souris fixé au paraformaldéhyde

  1. Suivez ce protocole pour les coupes de cerveau de souris de 30 à 50 μm d’épaisseur.
    NOTE: Le succès peut être trouvé avec des sections plus grandes, mais des temps plus longs peuvent être nécessaires pour la diffusion de la solution monomère et l’homogénéisation.
  2. Si les sections ne sont pas actuellement stockées dans une solution de PBS 1x (par exemple, dans une solution de glycérol à 30 % [v/v] et de 30 % [v/v] d’éthylène glycol dans 1 x PBS), laver trois fois pendant au moins 10 minutes à chaque fois à température ambiante dans 1x PBS dans une plaque de 6 à 24 puits.
  3. Procurez-vous une lame de microscopie en verre non revêtu. Si un côté de la lame de verre est revêtu, utilisez un pinceau humide pour vérifier le côté non couché (souvent, l’étiquette du côté revêtu sera en verre dépoli et deviendra moins opaque lorsqu’il est mouillé).
  4. Utilisez un pinceau pour mouiller la lame non couchée. Retirez le tissu cérébral de la souris de la plaque de puits avec le pinceau et placez-le soigneusement sur la lame, en utilisant un mouvement de roulement pour vous assurer que le tissu est plat. Laissez l’excès de PBS rester sur le tissu jusqu’à ce que toutes les sections soient montées.
    REMARQUE: Bien qu’une seule lame de verre puisse être utilisée pour plusieurs sections de tissu, lorsque plusieurs sections de tissu sont gélifiées à la fois (même sur des lames séparées), il faut prendre plus de précautions pour s’assurer qu’elles ne sèchent pas complètement.
  5. À l’aide d’un chiffon en papier de laboratoire, retirez la majeure partie de l’excès de PBS de la lame. Laissez un petit anneau liquide autour de chaque section de tissu, mais laissez le reste de la lame presque sec. Ce liquide restant couvrira le tissu pendant la préparation de la solution de monomère de gel.

4. Gélification

NOTE: Ce protocole convient à tous les types de tissus préparés pour être utilisés avec cette technique.

  1. Appliquez des entretoises de chaque côté de la section tissulaire (figure 2A) pour empêcher la compression des tissus. Pour ce faire, fabriquez les entretoises en coupant finement des morceaux de verre de couverture à l’aide d’un stylo à pointe de diamant, puis fixez-les à la glissière à l’aide de petites quantités d’eau ou de 1x PBS, ou fixez-les à l’aide d’une petite quantité de super colle. Ensuite, placez doucement les entretoises de chaque côté du tissu.
  2. Préparer la solution gélifiante finale. En général, ~200 μL est suffisant par section de tissu, mais le volume ne doit pas dépasser 800 μL par lame. Toute solution gélifiante supplémentaire entraînera des débordements.
    REMARQUE: La méthacroléine est utilisée pour ancrer les biomolécules dans le gel. Cependant, aucune étape d’ancrage distincte n’est requise et la méthacroléine peut être ajoutée directement à la solution gélifiante finale.
    1. Par section, combiner les éléments suivants dans l’ordre : 200 μL de solution monomère, 0,5 μL de solution mère 4HT à 0,5 % (dilution 1:400), 0,2-0,5 μL de méthacroléine (dilution de 1:400-1:1 000 selon le type de tissu; généralement, utiliser une dilution de 1:1 000 pour les échantillons fixés au paraformaldéhyde [PFA] et 1:400 pour les échantillons cliniques FFPE), 2 μL de solution mère TEMED à 10 % (dilution 1:100), et 5 μL de solution mère A.P.S. à 10 % (dilution 1:40).
      NOTE: Préparer la solution gélifiante finale immédiatement avant utilisation. Pour éviter la gélification prématurée, ajoutez la solution APS en dernier.
  3. Retirez l’excès de solution de la section de tissu et placez la lame dans une boîte de Pétri. Ajouter toute la solution gélifiante froide fraîchement préparée à l’échantillon et incuber le mélange sur le tissu pendant 30 min à 4 °C pour permettre la diffusion dans le tissu.
  4. Placez soigneusement une deuxième lame de verre non couchée sur la solution de tissu et de gel. Les bulles d’air doivent être évitées (figure 2B).
    REMARQUE: Si des bulles d’air sont piégées sur le tissu, le couvercle en verre peut être soigneusement soulevé et replacé vers le bas. De plus, toute solution de monomère qui se répand peut être coupée après polymérisation et ne causera aucun problème pour le tissu.
  5. Assurez-vous que la polymérisation est terminée. Cette polymérisation peut se faire de deux manières, chacune produisant des résultats similaires. Tout d’abord, incuber les échantillons à 37 ° C dans un environnement humidifié (comme une boîte de Petri fermée avec une serviette en papier humide) pendant la nuit. Alternativement, pour une polymérisation plus rapide, incuber les échantillons dans l’atmosphère humidifiée pendant 2 h à 37 °C suivi de 1 h à 60 °C.

5. Digestion des échantillons et expansion tissulaire

REMARQUE: Ce protocole convient à tous les types de tissus.

  1. En portant une protection oculaire, glissez une lame de rasoir entre les deux lames de verre de la chambre gélifiante pour les séparer.
    REMARQUE: Les lames de verre doivent se séparer très facilement. Si différentes parties du gel sont collées aux deux lames, un pinceau peut être utilisé pour guider le gel vers l’une ou l’autre. Si le gel est devenu particulièrement sec pendant la polymérisation, 1x PBS peut être appliqué à l’extérieur de la chambre de gel, mais ne submergez pas complètement le gel, car cela le ferait se dilater avant que le tissu ne soit homogénéisé, ce qui entraînera des fissures.
  2. Coupez le gel blanc autour du tissu pour minimiser le volume. La découpe asymétrique du gel permet de suivre l’orientation du gel après homogénéisation, car l’échantillon sera complètement transparent.
  3. Soulevez doucement le gel contenant du tissu de la lame à l’aide d’une lame de rasoir et transférez-le doucement dans un tube centrifuge de 2 ml à l’aide d’un pinceau.
  4. Remplir le tube jusqu’au sommet avec un tampon d’homogénéisation (tableau 2) préchauffé à 80 °C.
  5. Incuber l’échantillon en agitant à 80 °C pendant 8 h (pour le cerveau de souris fixé aux PFA) ou 60 h (la plupart des échantillons cliniques FFPE ; voir Tableau 3).
    REMARQUE: Le temps d’homogénéisation dépend du type de tissu et de la méthode de fixation. Beaucoup de ces conditions ont déjà été validées, mais pour d’autres, l’optimisation peut être nécessaire.
  6. Versez le contenu du tube à centrifuger dans un seul puits d’une plaque de culture cellulaire en plastique à 6 puits.
  7. Retirez le tampon de dénaturation à l’aide d’une pipette de transfert.
  8. Pour éliminer complètement le reste de la FDS de l’hydrogel, laver l’échantillon dans une solution de tensioactif non ionique à 1 % (C12E 10) comme suit: au moins trois fois pendant10 minutes à chaque fois à température ambiante; pendant 60 min à 60 °C; puis trois autres lavages pendant 10 minutes à chaque fois à température ambiante.
  9. Conservez l’échantillon dans 1x PBS + 0,02% d’azoture de sodium à 4 °C jusqu’à ce qu’une coloration et une imagerie post-expansion soient nécessaires.
    REMARQUE: À ce stade, l’échantillon doit être ~ 3-4,5 fois plus grand dans chaque dimension, selon le type de tissu.

6. Profilage des biomolécules post-expansion

  1. Coloration des anticorps
    REMARQUE: Cela suit un protocole de coloration typique d’immunofluorescence (IF) / immunohistochimie (I.H.C.). Les quantités d’anticorps primaires et secondaires utilisées dépendent des concentrations suggérées par le fabricant ou de l’optimisation pour l’expérience spécifique. Des tampons individuels peuvent être remplacés à la discrétion de l’utilisateur.
    1. Avec l’échantillon dans un seul puits d’une plaque de culture cellulaire à 6 puits, laver les échantillons expansés trois fois pendant 10 minutes à chaque fois dans 1x PBS à R.T., en transférant le liquide avec une pipette.
    2. Effectuer une étape de blocage facultative (par exemple, 3 % d’albumine sérique bovine/0,1 % de Triton-X100 dans 1x PBS) pendant au moins 1 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
    3. Incuber avec les anticorps primaires dans un tampon de coloration (par exemple, 0,1 % Triton-X100 1x PBS ou 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L héparine) pendant une nuit à 37 °C. Selon la taille de l’échantillon, 0,5 à 2 mL devrait couvrir adéquatement le gel.
    4. Lavez l’échantillon trois fois pendant au moins 10 minutes à chaque fois dans 1x PBS à température ambiante.
    5. Incuber dans les anticorps secondaires correspondants pendant 3 h à 37 °C dans le tampon de coloration de votre choix.
    6. Lavez l’échantillon trois fois pendant au moins 10 minutes à chaque fois dans 1x PBS à température ambiante.
  2. Coloration pan-protéine NHS-ester
    1. Avec l’échantillon dans une plaque à 6 puits, verser 1-2 mL de polyéthylène glycol (PEG 200) sur l’échantillon (assez pour le couvrir complètement).
      REMARQUE: Le tissu doit rétrécir et revenir à sa taille d’avant l’expansion d’origine (ou presque).
    2. Coloration avec un ester NHS conjugué au fluorophore dilué à 13,3-80 μg/mL pendant 3 h à T.R. dans 1-2 mL de tampon de coloration (par exemple, 1x PBS, 2x S.S.C. ou 100 mM de solution de bicarbonate de sodium).
    3. Lavez l’échantillon trois fois pendant au moins 10 minutes à chaque fois dans 1x PBS à température ambiante.
  3. Coloration lipidique
    REMARQUE: La coloration lipidique post-expansion n’est pas efficace sur les échantillons cliniques FFPE, car les lipides sont perdus pendant le processus de fixation.
    1. Lavez l’échantillon trois fois pendant au moins 10 minutes à chaque fois dans 1x PBS à température ambiante.
    2. Appliquer un colorant lipophile conventionnel (DiO, DiI ou DiD) dilué 200 fois dans 2 mL de TritonX-100/1x PBS à 0,1 % pendant 72 à 96 h à température ambiante.
    3. Lavez au moins trois fois avec 1x PBS
  4. Hybridation in situ en fluorescence (FISH)
    1. Placer les échantillons de gel homogénéisés dans un tampon d’hybridation préchauffé à 60 °C pendant 30 min.
    2. Préparer le tampon d’hybridation pour FISH : Combiner 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM de citrate de sodium, pH 7,0), 10 % (v/v) sulfate de dextrane, 20 % (v/v) carbonate d’éthylène et 0,1 % (v/v) Tween20.
    3. Incuber les échantillons de gel avec un tampon d’hybridation contenant 10 pM (par oligo) de sondes FISH contre le gène cible (au moins 20 sondes par 10 kb) à 45 °C pendant une nuit.
    4. Laver avec un tampon de lavage rigoureux (2x S.S.C. et 0,1% Tween20) deux fois pendant 15 min à chaque fois à 45 °C.
    5. Laver avec un tampon de lavage rigoureux encore deux fois pendant 10 minutes à chaque fois à 37 °C.
    6. Enfin, laver avec 1x PBS au moins trois fois pendant 10 minutes à chaque fois à température ambiante.
    7. Les échantillons sont prêts pour l’imagerie ou le stockage dans 1x PBS + 0,02% d’azoture de sodium à 4 °C.
  5. Expansion tissulaire complète et imagerie par fluorescence
    REMARQUE : Le facteur d’expansion pouvant être atteint avec Magnify varie selon le type de tissu et la méthode d’expansion (un résumé complet se trouve dans le tableau 3). Cependant, selon une estimation générale, un échantillon grossi se multipliera par 3 à 4,5 dans 1 fois PBS, 5 à 7 fois par PBS dilué à 1:50 dans ddH 2 O et 8 à11 fois par ddH2O. Le facteur d’expansion optimal pour l’imagerie dépend des besoins de chaque expérience. Le facteur d’expansion est hautement réglable, de sorte qu’un seul échantillon peut être élargi et rétréci plusieurs fois pour l’imagerie à différentes échelles.
    1. Déplacez les échantillons élargis 4 fois dans PBS vers une plaque d’imagerie à 6 puits à fond de verre à l’aide d’un pinceau. Déplacez tout échantillon élargi davantage en le coupant en morceaux plus petits ou en le plaçant doucement dans une grande plaque d’imagerie à fond de verre avec un mince morceau de plastique flexible.
    2. Effectuez une imagerie par fluorescence à l’aide d’un microscope à grand champ conventionnel, d’un microscope confocal ou d’un autre système d’imagerie de votre choix. L’élimination de l’excès de liquide autour du gel avec un chiffon de laboratoire en papier peut empêcher le mouvement du gel pendant l’imagerie. Les gels peuvent également être immobilisés en appliquant 0,1% de poly-L-lysine sur la surface du verre avant l’imagerie.
      REMARQUE: L’application de poly-L-lysine rendra le gel entièrement immobile au contact. Pour cette raison, il faut veiller à ce que le gel soit appliqué sur le verre sans pliage ni étirement. De plus, le gel ne doit pas sécher complètement sur du verre enduit de poly-L-lysine, car cela pourrait rendre l’élimination difficile, et le gel ne doit pas être rétréci dans du PBS alors qu’il est encore attaché au verre avec de la poly-L-lysine, car cela pourrait causer des dommages au gel ou aux tissus.
    3. Après l’imagerie, rétrécir les échantillons dans 1x PBS avec au moins trois lavages pendant 10 minutes à chaque fois, car il n’est pas recommandé de stocker les échantillons à long terme dans ddH2O en raison de la dégradation du signal de fluorescence. En particulier, les échantillons complètement expansés colorés avec des colorants lipophiles doivent être imagés aussi près que possible du moment de l’expansion pour éviter la dissociation du colorant dans l’eau.
    4. Conserver les échantillons dans 1x PBS + 0,02% d’azoture de sodium à 4 °C.

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Representative Results

Si le protocole a été complété avec succès (figure 1), l’échantillon apparaîtra clair et plat après la dénaturation thermique; Tout pliage ou pli indique une homogénéisation incomplète. Un échantillon élargi avec succès sera 3 à 4,5 fois plus grand qu’avant l’expansion dans 1x PBS et 8-11 fois plus grand lorsqu’il sera complètement étendu dans ddH2O. La figure 3 montre des exemples d’images avant et après l’expansion d’un échantillon de rein humain FFPE de 5 μm d’épaisseur traité à l’aide de ce protocole et étendu avec succès plus de 8 fois. Le tissu a d’abord été coloré avec des anticorps pour ACTN4 avec DAPI pour visualiser l’ADN nucléaire. L’échantillon a ensuite été imagé à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif (Figure 3A). Le tissu a été traité selon le protocole ci-dessus, y compris la coloration post-expansion des mêmes cibles, et complètement dilaté dans l’eau (Figure 3B) avant la réimagerie. Après la dénaturation thermique, les biomolécules autres que les protéines peuvent également être colorées et imagées, comme le montre la figure 4. Des colorants lipophiles peuvent être appliqués pour révéler les structures membranaires cellulaires et mitochondriales dans le cerveau de la souris (Figure 4A). De plus, les acides nucléiques peuvent être imagés par FISH, comme dans le tissu ganglionnaire humain normal FFPE illustré à la figure 4B, C.

La figure 5 montre un résultat probable si l’échantillon n’est pas correctement homogénéisé. Après l’expansion, le tissu a été coloré avec des anticorps pour ACTN4 et vimentine, ainsi que DAPI pour visualiser l’ADN nucléaire et l’agglutinine de germe de blé (WGA) pour marquer les glucides. Le tissu a été multiplié par 3,5 dans le PBS avant l’imagerie à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif. Dans une section rénale (Figure 5A,C), on peut voir l’expansion sans fissure d’un glomérule. Dans une section séparée (Figure 5B, D), la fissuration peut être clairement visible dans le tissu.

Figure 1
Figure 1 : Schéma du flux de travail Agrandissement. Le prétraitement des lames de tissus archivées cliniquement est d’abord effectué en fonction du format de stockage. Les sections fixées au paraformaldéhyde flottant librement ne doivent être lavées que dans du PBS. Les échantillons sont ensuite incubés dans une solution de gel monomère, y compris la méthacroléine pour ancrer les biomolécules à l’hydrogel. La polymérisation in situ est effectuée avant la dénaturation thermique avec de l’urée, des FDS et de l’EDTA. Les échantillons sont ensuite soigneusement lavés et colorés à l’aide de protocoles d’immunomarquage conventionnels, de protocoles FISH ou de colorants lipophiles. Les échantillons sont ensuite expansés dans de l’eau pure avant l’imagerie. Cette figure a été modifiée à partir de Klimas et al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Chambre de gélification de l’échantillon de tissu. (A) De chaque côté du tissu, deux entretoises, telles que deux morceaux de verre de couverture #1.0, sont placés avant que la solution de monomère de gel ne soit autorisée à diffuser à 4 °C. Pour éviter la compression, les entretoises doivent être plus épaisses que les tranches de tissu. (B) Un couvercle, tel qu’une deuxième lame de verre, est utilisé pour couvrir l’échantillon avant polymérisation à 37 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemple d’images de pré-expansion d’une coupe de tissu rénal humain. (A) Une image prise à un grossissement de 60x (1,4 NA) par rapport à (B) une image du même champ de vision après expansion avec Agrandissement prise à un grossissement de 40x (1,15 NA, facteur d’expansion: 8,15x). Magenta, DAPI; Jaune, ACTN4. L’intensité maximale des images post-expansion est projetée sur 25 images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Stratégies alternatives de coloration des biomolécules avec Magnify. (A) (i et iv) Marquage pan-protéine NHS-ester du tissu cérébral de souris entièrement développé. (ii et v) Marquage par colorant lipophile (DiD) du même tissu cérébral de souris. iii et vi) Les canaux ont fusionné. (B) ADN FISH avec amplification en utilisant FFPE tissu ganglionnaire humain normal. Facteur d’expansion: 3,5x dans 1x PBS. Blanc, DAPI; Magenta, gène de la sérine/thréonine kinase 1; Bleu, protéine activatrice de l’APC/C gène CDH1; Jaune, séquence satellite humaine S4. (C) Canaux individuels associés à B. Toutes les images ont été obtenues à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif à un grossissement de 40x (1,15 NA). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats représentatifs d’échantillons de reins FFPE de 5 μm d’épaisseur. (A) Dilatation sans fissures. Blanc, DAPI; Jaune, vimentin; Cyan, alpha-actinine 4; Magenta, agglutinine de germe de blé. (B) Section rénale élargie présentant des fissures. La fissuration, les distorsions et la perte de cibles étiquetées peuvent être le résultat d’un ancrage et/ou d’une homogénéisation inadéquats. (C, D) Images agrandies des régions encadrées dans A et B, respectivement. Toutes les images ont été obtenues à l’aide d’un microscope confocal à disque rotatif à un grossissement de 10x (A, B; 0,45 NA) ou 60x (C, D; 1,2 NA). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition de la solution de monomère gel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Composition du tampon d’homogénéisation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Résumé des conditions de méthacroléine et d’homogénéisation pour les tissus validés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Ici, nous présentons le protocoleMagnify 17, une variante ExM qui peut retenir plusieurs biomolécules avec une seule ancre chimique et multiplier par 11 les échantillons cliniques FFPE difficiles grâce à la dénaturation thermique. Les principaux changements apportés à ce protocole qui le distinguent des autres protocoles ExM comprennent l’utilisation d’un gel reformulé qui reste mécaniquement robuste même lorsqu’il est complètement expansé, ainsi que l’utilisation de méthacroléine comme ancrage de biomolécule. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont les suivantes: 1) la composition de la solution de gel finale; 2) le moment des étapes de gélification; 3) la mise en place de la chambre de gélification; 4) les paramètres d’homogénéisation de l’échantillon; et 5) un lavage suffisant de la FDS de l’échantillon avant la coloration post-expansion.

Le paramètre le plus critique pour ce protocole est la composition de la solution gélifiante finale, en particulier la concentration de la biomolécule d’ancrage méthacroléine. Différentes concentrations de méthacroléine sont nécessaires pour élargir différents types de tissus (tableau 3), et il faut veiller à ce que cette valeur corresponde bien à l’échantillon à agrandir. Un ancrage excessif avec de la méthacroléine peut entraîner une réduction du facteur d’expansion et une perte d’épitopes disponibles pour la coloration post-expansion, tandis que le sous-ancrage, en particulier dans les échantillons cliniques FFPE, peut entraîner des fissures ou une distorsion des tissus. Par conséquent, la concentration de méthacroléine doit être optimisée pour les types de tissus non validés, bien que la concentration optimale se situera probablement près ou dans la plage présentée ici. Bien que nous nous attendions à ce que ce protocole fonctionne pour la plupart des types de tissus, même ceux que nous n’avons pas encore validés, il est connu pour ne pas fonctionner pour les échantillons contenant des os.

Au-delà de la méthacroléine, l’utilisation d’une concentration incorrecte d’un ingrédient de gel critique (4HT ou TEMED) peut entraîner l’échec complet de l’expérience, soit en raison d’une gélification incomplète ou nulle (4HT excessive) ou d’une gélification prématurée (MED excessive, 4HT réduite ou ajout d’APS avant les autres composants). Pour éviter une gélification prématurée, il est également nécessaire de conserver l’échantillon et le gel à 4 ° C et exposés à l’air pendant 30 minutes et de ne couvrir l’échantillon et de le placer à 37 ° C dans une chambre humidifiée qu’une fois le processus de diffusion terminé.

Lors de la construction de la chambre de gel, il est essentiel d’inclure des entretoises entre les deux lames de verre non revêtues, en particulier pour les sections de tissus plus épaisses telles que le cerveau de souris fixé au PFA. Un manque d’entretoises peut provoquer une compression des tissus, entraînant des images déformées et des données inexactes.

L’homogénéisation de l’échantillon dépend du temps de digestion avec le tampon de digestion, ainsi que de la température et de la composition du tampon de digestion. Une homogénéisation inadéquate peut entraîner des distorsions et une réduction des facteurs d’expansion par rapport à la valeur rapportée pour un type de tissu donné. Si une homogénéisation incomplète est suspectée, le temps de digestion peut être augmenté, en particulier dans le cas de tissus plus épais.

Une étape simple mais cruciale est le lavage adéquat de la FDS de l’échantillon avec un tensioactif non ionique (tel que C12E10) après l’étape d’homogénéisation. Toute FDS restante peut entraîner une liaison aux anticorps sous-optimale ou entièrement entravée. Heureusement, si cela est suspecté, un lavage supplémentaire et la réapplication des anticorps seront souvent une solution satisfaisante.

Le protocole offre une alternative rentable aux techniques actuelles d’imagerie à super-résolution et de microscopie électronique pour interroger les structures à l’échelle nanométrique dans divers échantillons de tissus, y compris dans les échantillons cliniques FFPE. L’utilisation de la méthacroléine et la dénaturation thermique permettent le profilage post-expansion de toutes les biomolécules conservées lors de la fixation tissulaire (ce qui exclut l’imagerie des lipides dans les échantillons FFPE, par exemple). Notre protocole, en tant qu’extension du cadre ExM, est modulaire et probablement compatible avec d’autres techniques telles que les méthodes optiques de super-résolution (STED18, STORM 19) ou la microscopie à expansion itérative (iExM)15. Cependant, ceux-ci n’ont pas encore été testés avec le protocole présenté, et les facteurs d’expansion importants peuvent présenter des défis, en particulier avec la dilution du fluorophore. De plus, la grande taille des échantillons après une expansion complète dans l’eau nécessite des précautions lors de la manipulation (bien que le gel utilisé ici soit plus résistant que les formulations précédentes de gel ExM à facteur d’expansion élevé, telles que la microscopie à expansion dix fois robuste (TREx), à la manipulationdes erreurs 17), et des solutions créatives sont parfois nécessaires pour transférer et imager ces gels entièrement expansés. Par exemple, utiliser des outils larges tels qu’une fine feuille de plastique pour transférer les gels entièrement expansés plutôt qu’un pinceau, ou utiliser de grandes plaques d’imagerie sur mesure (dans nos mains, cela signifie des plaques découpées au laser ou imprimées en 3D avec de gros morceaux de verre de couverture #1.5 collés au fond; ceux-ci peuvent être vus dans la vidéo d’accompagnement). Plus important encore, cette méthode élargit l’applicabilité de l’imagerie à l’échelle nanométrique en permettant l’imagerie à l’échelle nanométrique de préparations d’échantillons biologiques et pathologiques courants sur des microscopes conventionnels à grand champ ou confocaux.

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Disclosures

Les auteurs déclarent le(s) intérêt(s) financier(s) concurrent(s) suivant(s) : Y.Z., A.K., Z.C. et B.R.G. ont inventé plusieurs inventions liées à Magnify et ExM.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par l’Université Carnegie Mellon et la D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. et X.R.), les National Institutes of Health (N.I.H.) Prix du nouvel innovateur du réalisateur DP2 OD025926-01 et la Fondation Kauffman.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT) Sigma Aldrich 176141 Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) Cellvis P06-1.5H-N
Acrylamide Sigma Aldrich A8887 Gel Monomer component
Ammonium persulfate (APS)  Sigma Aldrich A3678 Initiatior
DAPI (1 mg/mL) Thermo Scientific 62248
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) Sigma Aldrich P9769 Non-ionic surfactant
Diamond knife No. 88 CM General Tools 31116
Ethanol Pharmco 111000200
Ethanol Pharmco 111000200
Ethylenediaminetetraacetic
acid (EDTA) 0.5 M		 VWR BDH7830-1 Homogenization Buffer Component
Forceps
Glycine Sigma Aldrich G8898 Homogenization Buffer Component
Heparin Sigma Aldrich H3393
Methacrolein Sigma Aldrich 133035 Anchoring Agent
Micro cover Glass #1 (24x60mm) VWR 48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) VWR 48393 251
N,N,N′,N′-
Tetramethylethylenediamine (TEMED)		 Sigma Aldrich T9281 Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) Sigma Aldrich M7279 Gel Monomer component
N,N-dimethylacrylamide (DMAA) Sigma Aldrich 274135 Gel Monomer component
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish Thermo Fisher 167063
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish Thermo Fisher 140675
Nunc™ 15mL Conical Thermo Fisher 339651
Nunc™ 50mL Conical Thermo Fisher 339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution Fischer Scientific BP399-1
Polyethylene glycol  200 Sigma Aldrich P-3015
Proteinase K (Molecular Biology Grade) Thermo Scientific EO0491
Razor blade Fischer Scientifc 12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Thermo Fisher 3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL Thermo Fisher 3459
Sodium acrylate (SA) AK Scientific R624 Gel Monomer component
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Sodium chloride Sigma Aldrich S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich C8532-1KG
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich L3771 Homogenization Buffer Component
Tris Base Fischer Scientific BP152-1 Homogenization Buffer Component
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
Urea Sigma Aldrich U5378 Homogenization Buffer Component
Xylenes Sigma Aldrich 214736
20x SSC Thermo Scientific AM9763
Tween20 Sigma Aldrich P1379
poly-L-lysine  Sigma Aldrich P8920

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References

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  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
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  10. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
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  19. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).

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Rétention moléculaire universelle avec microscopie à expansion 11 fois
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Gallagher, B. R., Klimas, A., Cheng, … More

Gallagher, B. R., Klimas, A., Cheng, Z., Zhao, Y. Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy. J. Vis. Exp. (200), e65338, doi:10.3791/65338 (2023).

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