Summary
Aquí se presenta una nueva versión de microscopía de expansión (ExM), Magnify, que está modificada para una expansión de hasta 11 veces, conservando una amplia gama de clases de biomoléculas y es compatible con una amplia gama de tipos de tejidos. Permite la interrogación de la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios convencionales limitados por difracción.
Abstract
Las imágenes a nanoescala de especímenes biológicos pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. En los últimos años, se ha demostrado que la microscopía de expansión (ExM) es una alternativa eficaz y de bajo coste a la microscopía óptica de superresolución. Sin embargo, se ha visto limitado por la necesidad de agentes de anclaje específicos y, a menudo, personalizados para retener diferentes clases de biomoléculas dentro del gel y por las dificultades para expandir los formatos de muestras clínicas estándar, como el tejido fijado en formol e incluido en parafina, especialmente si se desean factores de expansión más grandes o epítopos de proteínas preservados. Aquí, describimos Magnify, un nuevo método ExM para una expansión robusta de hasta 11 veces en una amplia gama de tipos de tejidos. Al utilizar metacroleína como anclaje químico entre el tejido y el gel, Magnify retiene múltiples biomoléculas, como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, dentro del gel, lo que permite la obtención de imágenes a nanoescala de los tejidos en microscopios ópticos convencionales. Este protocolo describe las mejores prácticas para garantizar una expansión de tejido robusta y sin grietas, así como consejos para manipular y obtener imágenes de geles altamente expandidos.
Introduction
Los sistemas biológicos exhiben heterogeneidad estructural, desde las extremidades y los órganos hasta los niveles de proteínas a nanoescala. Por lo tanto, una comprensión completa del funcionamiento de estos sistemas requiere un examen visual a través de estas escalas de tamaño. Sin embargo, el límite de difracción de la luz causa desafíos en la visualización de estructuras más pequeñas que ~200-300 nm en un microscopio de fluorescencia convencional. Además, los métodos ópticos de superresolución 1,2,3, como el agotamiento de la emisión estimulada (STED), la microscopía de localización fotoactivada (PALM), la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de iluminación estructurada (SIM), aunque potentes, presentan sus propios desafíos, ya que requieren hardware y reactivos costosos y, a menudo, tienen tiempos de adquisición lentos y una capacidad deficiente para obtener imágenes de grandes volúmenes en 3D.
La microscopía de expansión4 (ExM) proporciona un medio alternativo para eludir el límite de difracción de la luz mediante el anclaje covalente de biomoléculas en un gel polimérico hinchable en agua y separarlas físicamente, lo que las hace resolubles en microscopios ópticos convencionales. Desde la publicación original de ExM hace menos de una década, se han desarrollado multitud de variantes del protocolo ExM, y estos protocolos permiten la incorporación directa de las proteínas 5,6,7, ARN 8,9,10 o lípidos11,12,13 en la red de gel alterando el anclaje químico o expandiendo aún más la muestra (mejorando así la resolución efectiva), ya sea en un solo paso14 o en múltiples pasos iterativos15,16. Hasta hace poco, ningún protocolo ExM podía retener estas tres clases de biomoléculas con un solo anclaje químico disponible comercialmente, al tiempo que proporcionaba un gel mecánicamente resistente que podía expandirse ~ 10 veces en una sola ronda de expansión.
Aquí, presentamos Magnify17, una adición reciente al arsenal de ExM que utiliza metacroleína como ancla de biomolécula. La metacroleína forma enlaces covalentes con el tejido como el del paraformaldehído, lo que garantiza que se puedan retener múltiples clases de biomoléculas dentro de la red de gel sin necesidad de varios agentes de anclaje específicos o personalizados. Además, esta técnica puede expandir un amplio espectro de tejidos hasta 11 veces, incluidas muestras notoriamente desafiantes, como las muestras clínicas fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE). Los métodos anteriores para expandir muestras mecánicamente rígidas requerían una digestión dura de las proteasas, lo que hacía imposible el marcaje de anticuerpos de las proteínas de interés después de que la muestra se había expandido. Por el contrario, esta técnica logra la expansión de muestras clínicas FFPE utilizando una solución desnaturalizante en caliente, preservando así los epítopos de proteínas enteras dentro del gel, que pueden ser dirigidos para la obtención de imágenes posteriores a la expansión (Figura 1).
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Carnegie Mellon. Se obtuvieron muestras de tejido humano de forma comercial.
1. Preparación de los reactivos y soluciones madre
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los reactivos utilizados.
- Prepare las soluciones madre gelificantes. Estos se combinarán inmediatamente antes del paso de gelificación.
- Preparar la solución madre monómera (4 g/100 mL DE ÁCIDO N,N-dimetilacrilamida [DMAA], 50 g/100 ml de acrilato de sodio [SA], 66,7 g/100 ml de acrilamida [AA], 0,10 g/100 ml de N,N′-metilenebisacrilamida [Bis], 33 g/100 ml de cloruro de sodio [NaCl], 1x solución salina tamponada con fosfato; PBS) utilizando los componentes enumerados en la Tabla 1. Disolver o diluir todas las soluciones madre en agua. La solución madre de monómero puede almacenarse a 4 °C durante al menos 3 meses.
- Envasar las siguientes soluciones madre por separado en agua: 4-Hidroxi-TEMPO (4HT) al 0,5% (p/p), que inhibe la gelificación durante la difusión del monómero en los tejidos, y tetrametilenilendiamina (TEMED) al 10% (p/p), que acelera la generación de radicales iniciada por el persulfato de amonio (APS) y se prepara al 10% (p/p).
NOTA: Las soluciones madre pueden distribuirse en alícuotas de 1-2 ml y almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses; sin embargo, el APS se realiza inmediatamente antes de preparar la solución gelificante.
- Prepare el tampón de homogeneización (1% p/v de S.D.S., 8 M de urea, 25 mM de EDTA, 2x PBS, pH 8, a temperatura ambiente [R.T.]) combinando 1 g de SDS, 48,048 g de urea, 5 mL de EDTA (0,5M, pH 8), 20 mL de 10x PBS, 25 mL de Tris (2 M) y 0,75 g de glicina. Agregue agua hasta obtener un volumen total de 100 ml. La solución se puede ampliar o reducir según sea necesario y se puede almacenar en R.T.
2. Preparación de tejidos para portaobjetos de tejidos clínicos archivados y recién preparados
NOTA: Los pasos de preprocesamiento de tejidos difieren según la forma en que se preparen las muestras.
- En el caso de las muestras clínicas incluidas en parafina fijadas en formaldehído (FFPE), siga los pasos que se indican a continuación.
- Coloque las muestras en una serie secuencial de soluciones (se puede usar un frasco de tinción de vidrio o un tubo cónico de 50 ml): xileno, etanol al 95%, etanol al 70% y etanol al 50%, seguido de agua doblemente desionizada. Use cada solución dos veces durante al menos 3 minutos cada vez. Use fórceps para colocar el portaobjetos en el recipiente y agregue 15 ml de la solución respectiva (suficiente para cubrir la muestra). Coloque el tubo cónico tapado horizontalmente en un agitador a temperatura ambiente.
- Para muestras teñidas y montadas en portaobjetos permanentes, siga los pasos a continuación.
- Coloque el portaobjetos brevemente en xileno y retire con cuidado los cubreobjetos con una herramienta adecuada, como una cuchilla de afeitar. Si el cubreobjetos permanece atascado, vuelva a colocar los portaobjetos en xileno a temperatura ambiente hasta que se afloje.
- A continuación, procese las muestras como muestras FFPE (paso 2.1.1).
NOTA: En el caso de los portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina (H&E), la tinción de hematoxilina y eosina se pierde durante el proceso de expansión.
- Para portaobjetos de tejido congelado no fijados en solución de temperatura óptima de corte (OCT), fije los tejidos en acetona a -20 °C durante 10 min antes de lavar las muestras con 1x solución de PBS tres veces durante 10 min cada vez a temperatura ambiente.
- En el caso de los portaobjetos de tejido clínico congelados previamente fijados, derrita la OCT incubando los portaobjetos durante 2 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, lávelos con 1 solución de PBS tres veces durante 5 minutos cada vez a temperatura ambiente.
3. Preparación de tejidos para cerebro de ratón fijado en paraformaldehído
- Siga este protocolo para secciones de cerebro de ratón de 30-50 μm de grosor.
NOTA: Se puede tener éxito con secciones más grandes, pero es posible que se requieran tiempos más largos para la difusión y homogeneización de la solución de monómero. - Si las secciones no están almacenadas actualmente en una solución de 1x PBS (por ejemplo, en una solución de glicerol al 30% [v/v] y etilenglicol al 30% [v/v] en 1x PBS), lávese tres veces durante al menos 10 minutos cada vez a temperatura ambiente en 1x PBS en una placa de 6 a 24 pocillos.
- Obtenga un portaobjetos de microscopía de vidrio sin recubrimiento. Si un lado del portaobjetos de vidrio está recubierto, use un pincel húmedo para verificar el lado no recubierto (a menudo, la etiqueta del lado recubierto estará hecha de vidrio esmerilado y se volverá menos opaca cuando esté mojada).
- Usa un pincel para humedecer el portaobjetos sin recubrimiento. Retire el tejido cerebral del ratón de la placa de pocillos con el pincel y colóquelo con cuidado en el portaobjetos, con un movimiento giratorio para asegurarse de que el tejido esté plano. Deje que el exceso de PBS permanezca en el tejido hasta que todas las secciones estén montadas.
NOTA: Si bien se puede usar un solo portaobjetos de vidrio para múltiples secciones de tejido, cuando se gelifican más secciones de tejido a la vez (incluso en portaobjetos separados), se debe tener más cuidado para asegurarse de que no se sequen por completo. - Con un paño de papel de laboratorio, retire la mayor parte del exceso de PBS del portaobjetos. Deja un pequeño anillo líquido alrededor de cada sección de tejido, pero deja el resto del portaobjetos casi seco. Este líquido restante cubrirá el tejido mientras se prepara la solución de monómero en gel.
4. Gelificación
NOTA: Este protocolo es adecuado para todos los tipos de tejidos preparados para su uso con esta técnica.
- Aplique espaciadores a ambos lados de la sección de tejido (Figura 2A) para evitar la compresión del tejido. Para hacerlo, haga los espaciadores cortando finamente trozos de cubreobjetos con un bolígrafo con punta de diamante, y luego asegúrelos al portaobjetos con pequeñas cantidades de agua o 1x PBS, o fíjelos con una pequeña cantidad de superpegamento. A continuación, coloque suavemente los espaciadores a ambos lados del pañuelo.
- Preparar la solución gelificante final. Generalmente, ~200 μL es suficiente por sección de tejido, pero el volumen no debe exceder los 800 μL por portaobjetos. Cualquier solución gelificante adicional provocará derrames.
NOTA: La metacroleína se utiliza para anclar biomoléculas en el gel. Sin embargo, no se requiere ningún paso de anclaje por separado, y la metacroleína se puede agregar directamente a la solución gelificante final.- Por sección, combine lo siguiente en orden: 200 μL de solución de monómero, 0,5 μL de solución madre 4HT al 0,5% (dilución 1:400), 0,2-0,5 μL de metacroleína (dilución 1:400-1:1.000 dependiendo del tipo de tejido; generalmente, utilice una dilución 1:1.000 para muestras fijadas con paraformaldehído [PFA] y 1:400 para muestras clínicas FFPE), 2 μL de solución madre TEMED al 10% (dilución 1:100), y 5 μL de solución madre de A.P.S. al 10% (dilución 1:40).
NOTA: Prepare la solución gelificante final inmediatamente antes de usarla. Para evitar la gelificación prematura, agregue la solución APS al final.
- Por sección, combine lo siguiente en orden: 200 μL de solución de monómero, 0,5 μL de solución madre 4HT al 0,5% (dilución 1:400), 0,2-0,5 μL de metacroleína (dilución 1:400-1:1.000 dependiendo del tipo de tejido; generalmente, utilice una dilución 1:1.000 para muestras fijadas con paraformaldehído [PFA] y 1:400 para muestras clínicas FFPE), 2 μL de solución madre TEMED al 10% (dilución 1:100), y 5 μL de solución madre de A.P.S. al 10% (dilución 1:40).
- Retire el exceso de solución de la sección de tejido y coloque el portaobjetos en una placa de Petri. Añadir a la muestra toda la solución gelificante fría recién preparada e incubar la mezcla en el tejido durante 30 min a 4 °C para permitir su difusión en el tejido.
- Coloque un segundo portaobjetos de vidrio sin recubrimiento con cuidado sobre el pañuelo y la solución de gel. Deben evitarse las burbujas de aire (Figura 2B).
NOTA: Si las burbujas de aire quedan atrapadas sobre el pañuelo, la tapa de vidrio puede levantarse con cuidado y volver a colocarse. Además, cualquier solución de monómero que se derrame puede recortarse después de la polimerización y no causará ningún problema para el tejido. - Asegúrese de que se complete la polimerización. Esta polimerización se puede realizar de dos maneras, cada una de las cuales produce resultados similares. En primer lugar, incubar las muestras a 37 °C en un ambiente humidificado (como una placa de Petri cerrada con una toalla de papel húmeda) durante la noche. Alternativamente, para una polimerización más rápida, incubar las muestras en la atmósfera humidificada durante 2 h a 37 °C seguido de 1 h a 60 °C.
5. Digestión de la muestra y expansión del tejido
NOTA: Este protocolo es adecuado para todo tipo de tejidos.
- Con protección para los ojos, deslice una hoja de afeitar entre los dos portaobjetos de vidrio de la cámara de gelificación para separarlos.
NOTA: Los portaobjetos de vidrio deben separarse muy fácilmente. Si diferentes partes del gel están pegadas a ambos portaobjetos, se puede usar un pincel para guiar el gel hacia uno u otro. Si el gel se ha vuelto particularmente seco durante la polimerización, se puede aplicar 1x PBS en el exterior de la cámara de gel, pero no sumerja el gel por completo, ya que esto hará que se expanda antes de que el tejido se homogeneice, lo que provocará grietas. - Recorta el gel en blanco alrededor del pañuelo para minimizar el volumen. Cortar el gel de forma asimétrica permite el seguimiento de la orientación del gel después de la homogeneización, ya que la muestra será completamente transparente.
- Levante suavemente el gel que contiene pañuelos del portaobjetos con una cuchilla de afeitar y transfiéralo suavemente a un tubo de centrífuga de 2 ml con una brocha.
- Llene el tubo hasta la parte superior con tampón de homogeneización (Tabla 2) precalentado a 80 °C.
- Incubar la muestra agitándola a 80 °C durante 8 h (para el cerebro de ratón fijado con PFA) o 60 h (la mayoría de las muestras clínicas FFPE; ver Tabla 3).
NOTA: El tiempo de homogeneización depende del tipo de tejido y del método de fijación. Muchas de estas condiciones ya han sido validadas, pero para otras, la optimización puede ser necesaria. - Vierta el contenido del tubo de centrífuga en un solo pocillo de una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos.
- Retire el tampón de desnaturalización con una pipeta de transferencia.
- Para eliminar completamente la FDS restante del hidrogel, lavar la muestra en una solución de tensioactivo no iónico al 1% (C12E 10) de la siguiente manera: al menos tres veces durante10 minutos cada vez a temperatura ambiente; durante 60 min a 60 °C; y luego otros tres lavados durante 10 minutos cada vez a temperatura ambiente.
- Almacene la muestra en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C hasta que sea necesario realizar la tinción posterior a la expansión y la obtención de imágenes.
NOTA: En este punto, la muestra debe ser ~3-4.5 veces más grande en cada dimensión, dependiendo del tipo de tejido.
6. Perfil de biomoléculas post-expansión
- Tinción de anticuerpos
NOTA: Esto sigue un protocolo típico de tinción de inmunofluorescencia (FI)/inmunohistoquímica (IHC). Las cantidades de anticuerpos primarios y secundarios utilizados dependen de las concentraciones sugeridas por el fabricante o de la optimización para el experimento específico. Los búferes individuales pueden ser sustituidos a discreción del usuario.- Con la muestra en un solo pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos, lavar las muestras expandidas tres veces durante 10 minutos cada vez en 1x PBS en R.T., transfiriendo el líquido con una pipeta.
- Realice un paso de bloqueo opcional (por ejemplo, 3 % de albúmina sérica bovina/0,1 % de Triton-X100 en 1x PBS) durante al menos 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
- Incubar con los anticuerpos primarios en tampón de tinción (por ejemplo, Triton-X100 al 0,1 % 1x PBS o 9 veces PBS/TritonX al 1 %/10 mg/L de heparina) durante la noche a 37 °C. Dependiendo del tamaño de la muestra, 0,5-2 ml deberían cubrir adecuadamente el gel.
- Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.
- Incubar en los anticuerpos secundarios correspondientes durante 3 h a 37 °C en el tampón de tinción de elección.
- Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.
- Tinción de panproteína de éster NHS
- Con la muestra en una placa de 6 pocillos, vierta 1-2 ml de polietilenglicol (PEG 200) sobre la muestra (lo suficiente para cubrirla por completo).
NOTA: El tejido debe encogerse y volver a su tamaño original antes de la expansión (o cerca de él). - Manchar con éster NHS conjugado con fluoróforos diluido a 13,3-80 μg/ml durante 3 h a R.T. en 1-2 ml de tampón de tinción (por ejemplo, 1x PBS, 2x S.S.C. o 100 mM de solución de bicarbonato de sodio).
- Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.
- Con la muestra en una placa de 6 pocillos, vierta 1-2 ml de polietilenglicol (PEG 200) sobre la muestra (lo suficiente para cubrirla por completo).
- Tinción lipídica
NOTA: La tinción lipídica posterior a la expansión no es eficaz en muestras clínicas FFPE, ya que los lípidos se pierden durante el proceso de fijación.- Lave la muestra tres veces durante al menos 10 minutos cada vez en 1x PBS a temperatura ambiente.
- Aplicar un colorante lipofílico convencional (DiO, DiI o DiD) diluido 200 veces en 2 ml de TritonX-100/1x PBS al 0,1% durante 72-96 h a temperatura ambiente.
- Lavar al menos tres veces con 1x PBS
- Hibridación fluorescente in situ (FISH)
- Colocar las muestras de gel homogeneizadas en un tampón de hibridación precalentado a 60 °C durante 30 min.
- Prepare el tampón de hibridación para FISH: Combine 2x S.S.C. (300 mM de NaCl, 30 mM de citrato de sodio, pH 7,0), 10% (v/v) de sulfato de dextrano, 20% (v/v) de carbonato de etileno y 0,1% (v/v) de Tween20.
- Incubar las muestras de gel con un tampón de hibridación que contenga 10 pM (por oligo) de sondas FISH contra el gen diana (al menos 20 sondas por 10 kb) a 45 °C durante la noche.
- Lavar con tampón de lavado estricto (2x S.S.C. y 0,1% Tween20) dos veces durante 15 min cada vez a 45 °C.
- Lavar con tampón de lavado estricto otras dos veces durante 10 minutos cada vez a 37 °C.
- Finalmente, lavar con 1x PBS al menos tres veces durante 10 minutos cada vez a temperatura ambiente.
- Las muestras están listas para la obtención de imágenes o el almacenamiento en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C.
- Expansión tisular completa e imágenes de fluorescencia
NOTA: El factor de expansión que se puede obtener con Magnify varía según el tipo de tejido y el método de expansión (se puede encontrar un resumen completo en la Tabla 3). Sin embargo, como estimación general, una muestra de Magnify se expandirá de 3 a 4,5 veces en 1x PBS, de 5 a 7 veces en PBS diluido a 1:50 en ddH 2O y de 8 a 11 veces en ddH2O. El factor de expansión óptimo para la obtención de imágenes depende de las necesidades de cada experimento. El factor de expansión es altamente ajustable, de modo que una sola muestra puede expandirse y reducirse muchas veces para obtener imágenes a varias escalas.- Mueva las muestras expandidas 4 veces en PBS a una placa de imágenes de 6 pocillos con fondo de vidrio con un pincel. Mueva cualquier muestra expandida cortándola en trozos más pequeños o colocándola suavemente en una placa grande de imágenes con fondo de vidrio con un trozo delgado de plástico flexible.
- Realice imágenes de fluorescencia utilizando un microscopio convencional de campo amplio, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección. Eliminar el exceso de líquido alrededor del gel con un paño de papel de laboratorio puede impedir el movimiento del gel durante la toma de imágenes. Los geles también se pueden inmovilizar aplicando poli-L-lisina al 0,1% a la superficie del vidrio antes de la obtención de imágenes.
NOTA: La aplicación de poli-L-lisina hará que el gel quede completamente inmóvil al contacto. Por esta razón, se debe tener cuidado de que el gel se aplique al vidrio sin doblarse ni estirarse. Además, no se debe permitir que el gel se seque completamente en el vidrio recubierto de poli-L-lisina, ya que esto podría dificultar la extracción, y el gel no debe encogerse en PBS mientras aún está unido al vidrio con poli-L-lisina, ya que esto podría causar daños en el gel o en los tejidos. - Después de la obtención de imágenes, reduzca las muestras en 1x PBS con al menos tres lavados durante 10 minutos cada vez, ya que no se recomienda almacenar las muestras a largo plazo en ddH2O debido a la degradación de la señal de fluorescencia. En particular, las muestras completamente expandidas teñidas con colorantes lipofílicos deben tomarse imágenes lo más cerca posible del momento de la expansión para evitar la disociación del colorante en agua.
- Almacenar las muestras en 1x PBS + azida sódica al 0,02% a 4 °C.
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Representative Results
Si el protocolo se ha completado con éxito (Figura 1), la muestra aparecerá clara y plana después de la desnaturalización por calor; Cualquier pliegue o arruga indica una homogeneización incompleta. Una muestra expandida con éxito será de 3 a 4,5 veces más grande que antes de la expansión en 1x PBS y de 8 a 11 veces más grande cuando esté completamente expandida en ddH2O. La Figura 3 muestra imágenes de ejemplo antes y después de la expansión de una muestra de riñón humano FFPE de 5 μm de espesor procesada con este protocolo y expandida con éxito más de 8 veces. El tejido se tiñó primero con anticuerpos para ACTN4 junto con DAPI para visualizar el ADN nuclear. A continuación, se obtuvieron imágenes del espécimen utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Figura 3A). El tejido se trató siguiendo el protocolo anterior, incluida la tinción posterior a la expansión de las mismas dianas, y se expandió completamente en agua (Figura 3B) antes de volver a tomar imágenes. Después de la desnaturalización por calor, las biomoléculas distintas de las proteínas también pueden teñirse y obtener imágenes, como se muestra en la Figura 4. Se pueden aplicar colorantes lipofílicos para revelar las estructuras de la membrana celular y mitocondrial en el cerebro del ratón (Figura 4A). Además, se pueden obtener imágenes de los ácidos nucleicos a través de FISH, como en el tejido de ganglios linfáticos humanos normales FFPE que se muestra en la Figura 4B, C.
La Figura 5 muestra un resultado probable si la muestra no se homogeneiza adecuadamente. Después de la expansión, el tejido se tiñó con anticuerpos para ACTN4 y vimentina, junto con DAPI para visualizar el ADN nuclear y la aglutinina de germen de trigo (WGA) para marcar los carbohidratos. El tejido se expandió 3,5 veces en PBS antes de obtener imágenes con un microscopio confocal de disco giratorio. En una sección del riñón (Figura 5A, C), se puede ver la expansión sin grietas de un glomérulo. En una sección separada (Figura 5B, D), se puede ver claramente el agrietamiento en el tejido.
Figura 1: Esquema del flujo de trabajo de Magnify. El preprocesamiento de los portaobjetos de tejido clínicamente archivados se realiza primero en función del formato de almacenamiento. Las secciones fijadas con paraformaldehído de flotación libre solo necesitan lavarse en PBS. A continuación, las muestras se incuban en una solución de monómero en gel, que incluye metacroleína para anclar las biomoléculas al hidrogel. La polimerización in situ se realiza antes de la desnaturalización por calor con urea, SDS y EDTA. A continuación, las muestras se lavan a fondo y se tiñen utilizando protocolos convencionales de inmunotinción, protocolos FISH o colorantes lipofílicos. A continuación, las muestras se expanden en agua pura antes de obtener imágenes. Esta figura ha sido modificada a partir de Klimas et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cámara de gelificación de muestras de tejido. (A) A cada lado del tejido, se colocan dos espaciadores, como dos piezas de cubreobjetos #1.0, antes de permitir que la solución de monómero en gel se difunda a 4 °C. Para evitar la compresión, los espaciadores deben ser más gruesos que las rodajas de tejido. (B) Se utiliza una tapa, como un segundo portaobjetos de vidrio, para cubrir la muestra antes de la polimerización a 37 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de imágenes previas a la expansión de una sección de tejido renal humano. (A) Una imagen tomada con un aumento de 60x (1,4 NA) en comparación con (B) una imagen del mismo campo de visión después de la expansión con Magnify tomada con un aumento de 40x (1,15 NA, factor de expansión: 8,15x). Magenta, DAPI; Amarillo, ACTN4. La intensidad máxima de las imágenes posteriores a la expansión se proyecta en 25 fotogramas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estrategias alternativas de tinción de biomoléculas con Magnify . (A) (i y iv) Marcaje panproteico de éster NHS de tejido cerebral de ratón completamente expandido. (ii y v) Marcaje con colorante lipofílico (DiD) del mismo tejido cerebral de ratón. (iii y vi) Los canales se fusionaron. (B) ADN FISH con Magnify utilizando tejido de ganglios linfáticos humanos normales FFPE. Factor de expansión: 3.5x en 1x PBS. Blanco, DAPI; Magenta, gen de la serina/treonina quinasa 1; Azul, gen CDH1 de la proteína activadora de APC/C; Amarillo, secuencia de satélites humanos S4. (C) Canales individuales asociados con B. Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con un aumento de 40x (1,15 NA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos de muestras de riñón FFPE de 5 μm de espesor. (A) Expansión sin grietas. Blanco, DAPI; Amarillo, vimentina; cian, alfa-actinina 4; Magenta, aglutinina de germen de trigo. (B) Sección de riñón expandido que exhibe agrietamiento. El agrietamiento, las distorsiones y la pérdida de objetivos marcados pueden ser el resultado de un anclaje y/u homogeneización inadecuados. (C,D) Imágenes ampliadas de las regiones en caja en A y B, respectivamente. Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con un aumento de 10x (A,B; 0,45 NA) o 60x (C,D; 1,2 NA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Composición de la solución de monómero en gel. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Composición del tampón de homogeneización. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Resumen de las condiciones de metacroleína y homogeneización de los tejidos validados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Aquí, presentamos el protocolo Magnify 17, una variante ExM que puede retener múltiples biomoléculas con un solo anclaje químico y expandir muestras clínicas FFPE desafiantes hasta11 veces con desnaturalización por calor. Los cambios clave en este protocolo que lo distinguen de otros protocolos ExM incluyen el uso de un gel reformulado que permanece mecánicamente robusto incluso cuando está completamente expandido, así como el uso de metacroleína como anclaje de la biomolécula. Los pasos más críticos de este protocolo son los siguientes: 1) la composición de la solución de gel final; 2) el momento de los pasos de gelificación; 3) la configuración de la cámara de gelificación; 4) los parámetros para la homogeneización de la muestra; y 5) el lavado suficiente de SDS de la muestra antes de la tinción posterior a la expansión.
El parámetro más crítico para este protocolo es la composición de la solución gelificante final, en particular la concentración de la biomolécula de anclaje metacroleína. Se requieren diferentes concentraciones de metacroleína para expandir diferentes tipos de tejido (Tabla 3), y se debe tener cuidado para garantizar que este valor coincida bien con la muestra que se va a expandir. El anclaje excesivo con metacroleína puede dar lugar a un factor de expansión reducido y a una pérdida de epítopos disponibles para la tinción posterior a la expansión, mientras que el anclaje insuficiente, especialmente en muestras clínicas FFPE, puede provocar grietas o distorsión en los tejidos. Por lo tanto, la concentración de metacroleína debe optimizarse para los tipos de tejido no validados, aunque es probable que la concentración óptima se encuentre cerca o dentro del rango presentado aquí. Si bien esperamos que este protocolo funcione para la mayoría de los tipos de tejidos, incluso aquellos que aún no hemos validado, se sabe que no funciona para muestras que contienen hueso.
Más allá de la metacroleína, el uso de una concentración incorrecta de un ingrediente crítico del gel (4HT o TEMED) puede resultar en el fracaso completo del experimento, ya sea debido a una gelificación incompleta o nula (4HT excesiva) o a una gelificación prematura (TEMED excesiva, 4HT reducida o adición de APS antes de los otros componentes). Para evitar la gelificación prematura, también es necesario mantener la muestra y el gel a 4 °C y expuestos al aire durante 30 minutos y solo cubrir la muestra y colocarla a 37 °C en una cámara humidificada una vez finalizado el proceso de difusión.
Al construir la cámara de gel, es fundamental incluir espaciadores entre los dos portaobjetos de vidrio sin recubrimiento, especialmente para secciones de tejido más gruesas, como el cerebro de ratón fijado con PFA. La falta de espaciadores puede causar compresión del tejido, lo que da como resultado imágenes distorsionadas y datos inexactos.
La homogeneización de la muestra depende del tiempo de digestión con el tampón de digestión, así como de la temperatura y composición del tampón de digestión. Una homogeneización inadecuada puede causar distorsiones y reducir los factores de expansión en comparación con el valor informado para un tipo de tejido determinado. Si se sospecha una homogeneización incompleta, se puede aumentar el tiempo de digestión, especialmente en el caso de tejidos más gruesos.
Un paso simple pero crucial es el lavado adecuado de la FDS de la muestra con un tensioactivo no iónico (como C12E10) después del paso de homogeneización. Cualquier SDS sobrante puede dar lugar a una unión de anticuerpos subóptima o totalmente obstaculizada. Afortunadamente, si se sospecha de esto, el lavado adicional y la reaplicación de los anticuerpos a menudo serán una solución satisfactoria.
El protocolo proporciona una alternativa rentable a las técnicas actuales de microscopía electrónica y de imágenes de superresolución para interrogar estructuras a nanoescala en varias muestras de tejido, incluidas las muestras clínicas FFPE. El uso de metacroleína y la desnaturalización por calor permite el perfil posterior a la expansión de cualquier biomolécula que se conserve durante la fijación tisular (esto excluye la obtención de imágenes de lípidos en muestras de FFPE, por ejemplo). Nuestro protocolo, como extensión del marco ExM, es modular y probablemente compatible con otras técnicas como los métodos ópticos de superresolución (STED18, STORM 19) o la microscopía de expansión iterativa (iExM)15. Sin embargo, estos aún no se han probado con el protocolo presentado, y los grandes factores de expansión pueden presentar desafíos, especialmente con la dilución de fluoróforos. Además, el gran tamaño de las muestras después de la expansión completa en agua requiere cuidado al manipular (aunque el gel utilizado aquí es más resistente que las formulaciones anteriores de gel ExM de alto factor de expansión, como la microscopía de expansión diez veces robusta (TREx), para manipular errores17), y ocasionalmente se requieren soluciones creativas para transferir y obtener imágenes de estos geles completamente expandidos. Por ejemplo, el uso de implementos de base ancha, como una lámina delgada de plástico, para transferir los geles completamente expandidos en lugar de un pincel, o el uso de placas de imagen grandes hechas a medida (en nuestras manos, esto significa placas cortadas con láser o impresas en 3D con grandes trozos de cubreobjetos # 1.5 adheridos a la parte inferior; estos se pueden ver en el video adjunto). Y lo que es más importante, este método amplía la aplicabilidad de las imágenes a nanoescala al permitir la obtención de imágenes a nanoescala de preparaciones de muestras biológicas y patológicas comunes en microscopios convencionales de campo amplio o confocal.
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Disclosures
Los autores declaran los siguientes intereses financieros contrapuestos: Y.Z., A.K., Z.C. y B.R.G. inventaron varias invenciones relacionadas con Magnify y ExM.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Universidad Carnegie Mellon y la Fundación Benéfica D.S.F. (Y.Z. y X.R.), los Institutos Nacionales de Salud (N.I.H.) Premio al Nuevo Innovador del Director DP2 OD025926-01, y la Fundación Kauffman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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