Summary
Burada, 11 kata kadar genişleme için modifiye edilmiş, kapsamlı bir biyomolekül sınıfı dizisini koruyan ve çok çeşitli doku tipleriyle uyumlu olan genişleme mikroskobunun (ExM) yeni bir versiyonu olan Magnify sunulmaktadır. Konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanılarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun sorgulanmasını sağlar.
Abstract
Biyolojik örneklerin nano ölçekli görüntülenmesi, hastalık patogenezinin anlaşılmasını iyileştirebilir. Son yıllarda, genleşme mikroskobunun (ExM) optik süper çözünürlüklü mikroskopiye etkili ve düşük maliyetli bir alternatif olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, jel içinde farklı biyomolekül sınıflarını tutmak için spesifik ve genellikle özel ankraj ajanlarına duyulan ihtiyaç ve özellikle daha büyük genişleme faktörleri veya korunmuş protein epitopları isteniyorsa, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku gibi standart klinik numune formatlarının genişletilmesindeki zorluklarla sınırlandırılmıştır. Burada, çok çeşitli doku tiplerinde 11 kata kadar sağlam genişleme için yeni bir ExM yöntemi olan Magnify'ı açıklıyoruz. Magnify, doku ve jel arasındaki kimyasal çapa olarak metakrolein kullanarak, jel içinde proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi çoklu biyomolekülleri tutar ve böylece dokuların geleneksel optik mikroskoplarda geniş nano ölçekli görüntülenmesine olanak tanır. Bu protokol, sağlam ve çatlaksız doku genişlemesini sağlamak için en iyi uygulamaları ve ayrıca yüksek oranda genişlemiş jellerin işlenmesi ve görüntülenmesi için ipuçlarını açıklar.
Introduction
Biyolojik sistemler, uzuvlardan ve organlardan nano ölçekteki protein seviyelerine kadar yapısal heterojenlik sergiler. Bu nedenle, bu sistemlerin çalışmasının tam olarak anlaşılması, bu boyut ölçeklerinde görsel inceleme gerektirir. Bununla birlikte, ışığın kırınım sınırı, geleneksel bir floresan mikroskobunda ~200-300 nm'den daha küçük yapıların görselleştirilmesinde zorluklara neden olur. Ek olarak, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED), foto-aktif lokalizasyon mikroskobu (PALM), stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) gibi optik süper çözünürlük yöntemleri 1,2,3, güçlü olmalarına rağmen, pahalı donanım ve reaktifler gerektirdiğinden ve genellikle yavaş edinim sürelerine ve büyük hacimleri 3D olarak görüntüleme konusunda zayıf bir yeteneğe sahip olduklarından kendi zorluklarını ortaya koymaktadır.
Genleşme mikroskobu4 (ExM), biyomolekülleri suda şişebilen bir polimer jele kovalent olarak sabitleyerek ve fiziksel olarak ayırarak ışığın kırınım sınırını aşmanın alternatif bir yolunu sunar, böylece geleneksel optik mikroskoplarda çözülebilir hale getirir. On yıldan daha kısa bir süre önce ExM'nin orijinal yayınlanmasından bu yana çok sayıda ExM protokol varyantı geliştirilmiştir ve bu protokoller,proteinlerin 5,6,7, RNA 8,9,10 veya lipitlerin11,12,13 doğrudan dahil edilmesine izin verir kimyasal ankrajı değiştirerek veya numuneyi daha da genişleterek (böylece etkili çözünürlüğü iyileştirerek) tek bir adımda14 veya çoklu yinelemeli adımlarda15,16 jel ağına. Yakın zamana kadar, tek bir ExM protokolü, tek bir genişleme turunda ~ 10 kat genişleyebilen mekanik olarak sağlam bir jel sağlarken, ticari olarak temin edilebilen tek bir kimyasal çapa ile bu üç biyomolekül sınıfını koruyamadı.
Burada, biyomolekül çapası olarak metakrolein kullanan ExM cephaneliğine yeni eklenen Magnify17'yi sunuyoruz. Metakrolein, paraformaldehit gibi doku ile kovalent bağlar oluşturarak, çeşitli spesifik veya özel ankraj ajanları gerektirmeden jel ağı içinde birden fazla biyomolekül sınıfının tutulabilmesini sağlar. Ek olarak, bu teknik, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) klinik numuneler gibi zorlu numuneler de dahil olmak üzere geniş bir doku yelpazesini 11 kata kadar genişletebilir. Bu tür mekanik olarak sert numuneleri genişletmek için önceki yöntemler, sert proteaz sindirimi gerektiriyordu ve bu da numune genişletildikten sonra ilgilenilen proteinlerin antikor etiketlemesini imkansız hale getiriyordu. Buna karşılık, bu teknik, sıcak denatüre edici bir çözelti kullanarak FFPE klinik örneklerinin genişletilmesini sağlar, böylece genişleme sonrası görüntüleme için hedeflenebilen jel içindeki tüm protein epitoplarını korur (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine uygun olarak yürütüldü ve Carnegie Mellon Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. İnsan doku örnekleri ticari olarak elde edildi.
1. Stok reaktiflerinin ve çözeltilerinin hazırlanması
NOT: Kullanılan reaktiflerin listesi için Malzeme Tablosuna bakın.
- Jelleşme stok çözeltilerini hazırlayın. Bunlar jelleşme adımından hemen önce birleştirilecektir.
- Monomer stok çözeltisini hazırlayın (4 g/100 mL N,N- dimetilakrilamid asit [DMAA], 50 g/100 mL sodyum akrilat [SA], 66,7 g/100 mL akrilamid [AA], 0,10 g/100 mL N,N'-metilenbisakrilamid [Bis], 33 g/100 mL sodyum klorür [NaCl], 1x fosfat tamponlu salin; PBS) Tablo 1'de listelenen bileşenleri kullanarak. Tüm stok çözeltilerini suda çözün veya seyreltin. Monomer stok çözeltisi 4 °C'de en az 3 ay saklanabilir.
- Aşağıdaki stok çözeltilerini suda ayrı ayrı yapın: Dokulara monomer difüzyonu sırasında jelleşmeyi inhibe eden %0,5 (a/a) 4-Hidroksi-TEMPO (4HT) ve amonyum persülfat (APS) tarafından başlatılan radikal oluşumunu hızlandıran ve %10 (a/a) oranında hazırlanan %10 (a/a) tetrametiletilendiamin (TEMED).
NOT: Stok çözeltileri 1-2 mL alikotlara dağıtılabilir ve 4 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir; ancak APS, jelleşme çözeltisi hazırlanmadan hemen önce yapılır.
- 1 g SDS, 48.048 g üre, 5 mL EDTA (0.5M, pH 8), 20 mL 10x PBS, 25 mL Tris (2 M) ve 0.75 g glisin birleştirerek homojenizasyon tamponunu (%1 w/v S.D.S., 8 M üre, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, oda sıcaklığında [RT]) hazırlayın. Toplam 100 mL hacim için su ekleyin. Çözüm, gerektiğinde yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir ve R.T.'de depolanabilir.
2. Arşivlenmiş ve taze hazırlanmış klinik doku slaytları için doku hazırlama
NOT: Doku ön işleme adımları, numunelerin nasıl hazırlandığına bağlı olarak farklılık gösterir.
- Formaldehitle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) klinik numuneler için aşağıdaki adımları izleyin.
- Numuneleri sıralı bir çözelti serisine yerleştirin (bir cam slayt boyama kavanozu veya 50 mL konik tüp kullanılabilir): ksilen, %95 etanol, %70 etanol ve %50 etanol, ardından iki kat deiyonize su. Her çözeltiyi her seferinde en az 3 dakika boyunca iki kez kullanın. Slaytı kabın içine yerleştirmek için forseps kullanın ve ilgili çözeltiden 15 mL ekleyin (numuneyi kaplayacak kadar). Kapaklı konik boruyu oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerine yatay olarak yerleştirin.
- Lekeli ve kalıcı slaytlara monte edilmiş numuneler için aşağıdaki adımları izleyin.
- Slaytı kısa bir süre ksilene yerleştirin ve traş bıçağı gibi uygun bir alet kullanarak lamelleri dikkatlice çıkarın. Lamel sıkışmış kalırsa, lamel gevşeyene kadar slaytları ksilen içinde oda sıcaklığına getirin.
- Ardından, numuneleri FFPE numuneleri olarak işleyin (adım 2.1.1).
NOT: Hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyanmış slaytlar için, genişleme işlemi sırasında hematoksilen ve eozin boyası kaybolur.
- Optimum kesme sıcaklığı (OCT) çözeltisinde sabitlenmemiş donmuş doku slaytları için, numuneleri oda sıcaklığında her seferinde 10 dakika boyunca 1x PBS çözeltisi ile üç kez yıkamadan önce dokuları 10 dakika boyunca -20 ° C'de asetonda sabitleyin.
- Önceden sabitlenmiş donmuş klinik doku slaytları için, slaytları oda sıcaklığında 2 dakika inkübe ederek OCT'yi eritin ve ardından her seferinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca üç kez 1x PBS solüsyonu ile yıkayın.
3. Paraformaldehit ile sabitlenmiş fare beyni için doku hazırlığı
- 30-50 μm kalınlığındaki fare beyin bölümleri için bu protokolü izleyin.
NOT: Daha büyük kesitlerde başarı bulunabilir, ancak monomer çözelti difüzyonu ve homojenizasyonu için daha uzun süreler gerekebilir. - Bölümler şu anda 1x PBS çözeltisinde saklanmıyorsa (örneğin, 1x PBS'de %30 [h/h] gliserol ve %30 [h/h] etilen glikol çözeltisinde), her seferinde en az 10 dakika boyunca üç kez yıkayın 6 ila 24 oyuklu bir plakada 1x PBS'de oda sıcaklığında.
- Kaplanmamış bir cam mikroskopi lamı edinin. Cam sürgünün bir tarafı kaplanmışsa, kaplanmamış tarafı kontrol etmek için ıslak bir boya fırçası kullanın (genellikle kaplanmış tarafın etiketi buzlu camdan yapılır ve ıslandığında daha az opak hale gelir).
- Kaplanmamış slaytı ıslatmak için bir boya fırçası kullanın. Fare beyin dokusunu boya fırçasıyla kuyu plakasından çıkarın ve dokunun düz olduğundan emin olmak için yuvarlanma hareketi kullanarak dikkatlice slaydın üzerine yerleştirin. Tüm bölümler monte edilene kadar fazla PBS'nin doku üzerinde kalmasına izin verin.
NOT: Birden fazla doku kesiti için tek bir cam slayt kullanılabilirken, aynı anda daha fazla doku kesiti jelleştirildiğinde (ayrı slaytlarda bile), tamamen kurumamaları için daha fazla özen gösterilmelidir. - Bir laboratuvar kağıt bezi kullanarak, fazla PBS'nin çoğunu slayttan çıkarın. Her doku bölümünün etrafında küçük bir sıvı halkası bırakın, ancak slaytın geri kalanını çoğunlukla kuru bırakın. Kalan bu sıvı, jel monomer çözeltisi hazırlanırken dokuyu kaplayacaktır.
4. Jelleşme
NOT: Bu protokol, bu teknikle kullanılmak üzere hazırlanmış tüm doku tipleri için uygundur.
- Doku sıkışmasını önlemek için doku bölümünün her iki tarafına ara parçalar uygulayın (Şekil 2A). Bunu yapmak için, elmas uçlu bir kalem kullanarak kapak camı parçalarını ince bir şekilde keserek ara parçaları yapın ve ardından az miktarda su veya 1x PBS kullanarak slayta sabitleyin veya az miktarda süper yapıştırıcı kullanarak sabitleyin. Ardından, ara parçaları dokunun her iki tarafına yavaşça yerleştirin.
- Son jelleşme çözeltisini hazırlayın. Genel olarak, doku kesiti başına ~200 μL yeterlidir, ancak hacim slayt başına 800 μL'yi geçmemelidir. Daha fazla jelleştirici çözelti yayılmaya neden olacaktır.
NOT: Metakrolein, biyomolekülleri jele sabitlemek için kullanılır. Bununla birlikte, ayrı bir ankraj adımı gerekmez ve metakrolein doğrudan nihai jelleşme çözeltisine eklenebilir.- Bölüm başına aşağıdakileri sırayla birleştirin: 200 μL monomer çözeltisi, 0.5 μL %0.5 4HT stok çözeltisi (1:400 seyreltme), 0.2-0.5 μL metakrolein (doku tipine bağlı olarak 1:400-1:1.000 seyreltme; genel olarak, paraformaldehit [PFA] ile sabitlenmiş numuneler için 1:1.000 seyreltme ve FFPE klinik örnekleri için 1:400 seyreltme kullanın), 2 μL %10 TEMED stok çözeltisi (1:100 seyreltme), ve 5 μL %10 A.P.S. stok çözeltisi (1:40 seyreltme).
NOT: Kullanmadan hemen önce son jelleşme solüsyonunu hazırlayın. Erken jelleşmeyi önlemek için, APS solüsyonunu en son ekleyin.
- Bölüm başına aşağıdakileri sırayla birleştirin: 200 μL monomer çözeltisi, 0.5 μL %0.5 4HT stok çözeltisi (1:400 seyreltme), 0.2-0.5 μL metakrolein (doku tipine bağlı olarak 1:400-1:1.000 seyreltme; genel olarak, paraformaldehit [PFA] ile sabitlenmiş numuneler için 1:1.000 seyreltme ve FFPE klinik örnekleri için 1:400 seyreltme kullanın), 2 μL %10 TEMED stok çözeltisi (1:100 seyreltme), ve 5 μL %10 A.P.S. stok çözeltisi (1:40 seyreltme).
- Fazla çözeltiyi doku bölümünden çıkarın ve slaydı bir Petri kabına yerleştirin. Taze hazırlanmış tüm soğuk jelleşme solüsyonunu numuneye ekleyin ve dokuya difüzyona izin vermek için karışımı doku üzerinde 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Doku ve jel çözeltisinin üzerine dikkatlice ikinci bir kaplanmamış cam slayt yerleştirin. Hava kabarcıklarından kaçınılmalıdır (Şekil 2B).
NOT: Hava kabarcıkları doku üzerinde sıkışırsa, cam kapak dikkatlice kaldırılabilir ve tekrar aşağı yerleştirilebilir. Ek olarak, dökülen herhangi bir monomer çözeltisi polimerizasyondan sonra kesilebilir ve doku için herhangi bir soruna neden olmaz. - Polimerizasyonun tamamlandığından emin olun. Bu polimerizasyon, her biri benzer sonuçlar veren iki şekilde yapılabilir. İlk olarak, numuneleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir ortamda (nemli bir kağıt havlu ile kapalı bir Petri kabı gibi) gece boyunca inkübe edin. Alternatif olarak, daha hızlı polimerizasyon için, numuneleri nemlendirilmiş atmosferde 37 °C'de 2 saat, ardından 60 °C'de 1 saat inkübe edin.
5. Örnek sindirim ve doku genişlemesi
NOT: Bu protokol tüm doku tipleri için uygundur.
- Göz koruması takarak, onları ayırmak için jelleşme odasının iki cam sürgüsü arasına bir tıraş bıçağı kaydırın.
NOT: Cam kızaklar çok kolay ayrılmalıdır. Jelin farklı kısımları her iki slayta da yapışmışsa, jeli birine veya diğerine yönlendirmek için bir boya fırçası kullanılabilir. Polimerizasyon sırasında jel özellikle kurursa, jel odasının dışına 1x PBS uygulanabilir, ancak jeli tamamen batırmayın, çünkü bu, doku homojenize edilmeden önce genişlemesine neden olur ve bu da çatlamaya neden olur. - Hacmi en aza indirmek için boş jeli dokunun etrafına kesin. Jelin asimetrik olarak kesilmesi, numune tamamen şeffaf olacağından, homojenizasyondan sonra jelin oryantasyonunun izlenmesine izin verir.
- Doku içeren jeli bir jiletle slayttan yavaşça kaldırın ve bir boya fırçası ile yavaşça 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Tüpü önceden 80 °C'ye ısıtılmış homojenizasyon tamponu (Tablo 2) ile doldurun.
- Numuneyi 80 °C'de 8 saat (PFA ile sabitlenmiş fare beyni için) veya 60 saat (çoğu FFPE klinik numunesi; bakınız Tablo 3) çalkalayarak inkübe edin.
NOT: Homojenizasyon süresi doku tipine ve fiksasyon yöntemine bağlıdır. Bu koşulların çoğu zaten doğrulanmıştır, ancak diğerleri için optimizasyon gerekli olabilir. - Santrifüj tüpünün içeriğini 6 oyuklu plastik hücre kültürü plakasının tek bir kuyucuğuna dökün.
- Denatürasyon tamponunu bir transfer pipeti ile çıkarın.
- Kalan SDS'yi hidrojelden tamamen çıkarmak için, numuneyi %1'lik iyonik olmayan bir yüzey aktif madde (C12E 10) çözeltisinde aşağıdaki gibi yıkayın: oda sıcaklığında her seferinde10 dakika boyunca en az üç kez; 60 °C'de 60 dakika; ve daha sonra her seferinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç yıkama daha.
- Numuneyi, genleşme sonrası boyama ve görüntüleme yapılması gerekene kadar 4 °C'de 1x PBS +% 0.02 sodyum azid içinde saklayın.
NOT: Bu noktada, doku tipine bağlı olarak numune her boyutta ~3-4,5 kat daha büyük olmalıdır.
6. Genişleme sonrası biyomolekül profili oluşturma
- Antikor boyama
NOT: Bu, tipik bir immünofloresan (IF)/immünohistokimya (I.H.C.) boyama protokolünü takip eder. Kullanılan primer ve sekonder antikorların miktarları, üretici tarafından önerilen konsantrasyonlara veya spesifik deney için optimizasyona bağlıdır. Bireysel tamponlar, kullanıcının takdirine bağlı olarak değiştirilebilir.- Numune, 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasının tek bir oyuğundayken, genişletilmiş numuneleri her seferinde 10 dakika boyunca üç kez 10 dakika boyunca R.T.'de 1x PBS'de yıkayın ve sıvıyı bir pipetle aktarın.
- İsteğe bağlı bir engelleme adımı uygulayın (örneğin, oda sıcaklığında en az 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de% 3 sığır serum albümini ve% 0.1 Triton-X100).
- Boyama tamponundaki primer antikorlarla (örneğin, %0.1 Triton-X100 1x PBS veya 9x PBS/%1 TritonX/10 mg/L heparin) gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Numune büyüklüğüne bağlı olarak, 0.5-2 mL jeli yeterince örtmelidir.
- Numuneyi oda sıcaklığında 10x PBS'de her seferinde en az 1 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Karşılık gelen ikincil antikorlarda, tercih edilen boyama tamponunda 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
- Numuneyi oda sıcaklığında 10x PBS'de her seferinde en az 1 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- NHS-ester pan-protein boyama
- Numune 6 oyuklu bir plakadayken, numunenin üzerine 1-2 mL polietilen glikol (PEG 200) dökün (tamamen kaplayacak kadar).
NOT: Doku küçülmeli ve orijinal genişleme öncesi boyutuna (veya ona yakın) geri dönmelidir. - 1-2 mL boyama tamponunda (örneğin, 1x PBS, 2x SSC veya 100 mM sodyum bikarbonat çözeltisi) RT'de 3 saat boyunca 13.3-80 μg / mL'ye seyreltilmiş florofor konjuge NHS-ester ile boyayın.
- Numuneyi oda sıcaklığında 10x PBS'de her seferinde en az 1 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Numune 6 oyuklu bir plakadayken, numunenin üzerine 1-2 mL polietilen glikol (PEG 200) dökün (tamamen kaplayacak kadar).
- Lipid boyama
NOT: Ekspansiyon sonrası lipid boyama, fiksasyon işlemi sırasında lipitler kaybolduğu için FFPE klinik numunelerinde etkili değildir.- Numuneyi oda sıcaklığında 10x PBS'de her seferinde en az 1 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 72-96 saat boyunca 2 mL %0.1 TritonX-100/1x PBS içinde 200 kat seyreltilmiş geleneksel bir lipofilik boya (DiO, DiI veya DiD) uygulayın.
- 1x PBS ile en az üç kez yıkayın
- Floresan in situ hibridizasyon (FISH)
- Homojenize jel numunelerini 30 dakika boyunca 60 °C'ye ısıtılmış hibridizasyon tamponuna yerleştirin.
- FISH için hibridizasyon tamponunu hazırlayın: 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM sodyum sitrat, pH 7.0), %10 (h/h) dekstran sülfat, %20 (h/h) etilen karbonat ve %0.1 (h/h) Tween20.
- Jel örneklerini, gece boyunca 45 ° C'de hedef gene (10 kb başına en az 20 prob) karşı 10 pM (oligo başına) FISH probu içeren bir hibridizasyon tamponu ile inkübe edin.
- Sıkı yıkama tamponu (2x S.S.C. ve %0.1 Tween20) ile her seferinde 45 °C'de 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Her seferinde 37 °C'de 10 dakika boyunca iki kez daha sıkı yıkama tamponu ile yıkayın.
- Son olarak, oda sıcaklığında her seferinde 10 dakika boyunca en az üç kez 1x PBS ile yıkayın.
- Numuneler, 4 °C'de 1x PBS + %0,02 sodyum azid içinde görüntülenmeye veya saklanmaya hazırdır.
- Tam doku genişlemesi ve floresan görüntüleme
NOT: Magnify ile elde edilebilen genişleme faktörü, doku tipine ve genişleme yöntemine göre değişir (tam bir özet Tablo 3'te bulunabilir). Bununla birlikte, genel bir tahmin olarak, bir Büyütme numunesi 1x PBS'de 3-4,5 kat, ddH2O'da 1:50'ye seyreltilmiş PBS'de 5-7 kat ve ddH2O'da 8-11 kat genişleyecektir. Görüntüleme için en uygun genişleme faktörü, her deneyin ihtiyaçlarına bağlıdır. Genişleme faktörü oldukça ayarlanabilir, öyle ki tek bir numune çeşitli ölçeklerde görüntüleme için birçok kez genişletilebilir ve küçültülebilir.- PBS'de 4 kat genişletilmiş örnekleri bir boya fırçası kullanarak cam tabanlı 6 oyuklu bir görüntüleme plakasına taşıyın. Genişletilmiş herhangi bir numuneyi daha küçük parçalara ayırarak veya ince bir esnek plastik parçasıyla büyük bir cam tabanlı görüntüleme plakasına nazikçe yerleştirerek daha da genişletin.
- Geleneksel bir geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskop veya tercih edilen başka bir görüntüleme sistemi kullanarak floresan görüntüleme gerçekleştirin. Jelin etrafındaki fazla sıvının bir kağıt laboratuvar bezi ile çıkarılması, görüntüleme sırasında jel hareketini engelleyebilir. Jeller ayrıca görüntülemeden önce cam yüzeye% 0.1 poli-L-lizin uygulanarak hareketsiz hale getirilebilir.
NOT: Poli-L-lizin uygulaması, temas halinde jeli tamamen hareketsiz hale getirecektir. Bu nedenle jelin cama katlanmadan veya esnemeden uygulanmasına dikkat edilmelidir. Ek olarak, jelin poli-L-lizin kaplı cam üzerinde tamamen kurumasına izin verilmemelidir, çünkü bu çıkarılmasını zorlaştırabilir ve jel, poli-L-lizin ile cama tutturulurken PBS'de büzülmemelidir, çünkü bu jel veya doku hasarına neden olabilir. - Görüntülemeden sonra, floresan sinyalinin bozulması nedeniyle numunelerin ddH2O'da uzun süreli saklanması tavsiye edilmediğinden, numuneleri her seferinde en az 10 dakika boyunca en az üç yıkama ile 1x PBS'de küçültün. Özellikle, lipofilik boyalarla boyanmış tamamen genleşmiş numuneler, boyanın suda ayrışmasını önlemek için mümkün olduğunca genleşme zamanına yakın görüntülenmelidir.
- Numuneleri 4 °C'de 1x PBS +% 0.02 sodyum azid içinde saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol başarıyla tamamlanmışsa (Şekil 1), numune ısı denatürasyonundan sonra berrak ve düz görünecektir; Herhangi bir katlanma veya buruşma, eksik homojenizasyonu gösterir. Başarılı bir şekilde genişletilmiş bir numune, 1x PBS'de genişlemeden öncekinden 3-4,5 kat daha büyük ve ddH2O'da tamamen genişletildiğinde 8-11 kat daha büyük olacaktır. Şekil 3, bu protokol kullanılarak işlenen ve başarılı bir şekilde 8 kattan fazla genişletilen 5 μm kalınlığındaki FFPE insan böbrek örneğinin genişleme öncesi ve sonrası örnek görüntülerini göstermektedir. Doku ilk olarak nükleer DNA'yı görselleştirmek için DAPI ile birlikte ACTN4 antikorları ile boyandı. Numune daha sonra dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülendi (Şekil 3A). Doku, aynı hedeflerin genişleme sonrası boyanması da dahil olmak üzere yukarıdaki protokol izlenerek tedavi edildi ve yeniden görüntülemeden önce suda tamamen genişletildi (Şekil 3B). Isı denatürasyonunu takiben, Şekil 4'te gösterildiği gibi, proteinler dışındaki biyomoleküller de boyanabilir ve görüntülenebilir. Fare beynindeki hücre ve mitokondri zar yapılarını ortaya çıkarmak için lipofilik boyalar uygulanabilir (Şekil 4A). Ek olarak, nükleik asitler, Şekil 4B,C'de gösterilen FFPE normal insan lenf nodu dokusunda olduğu gibi FISH aracılığıyla görüntülenebilir.
Şekil 5, numunenin uygun şekilde homojenize edilmemesi durumunda olası bir sonucu göstermektedir. Genleşmeyi takiben, doku, karbonhidratları etiketlemek için nükleer DNA ve buğday tohumu aglütinini (WGA) görselleştirmek için DAPI ile birlikte ACTN4 ve vimentin için antikorlarla boyandı. Doku, dönen disk konfokal mikroskobu kullanılarak görüntülenmeden önce PBS'de 3.5 kat genişletildi. Bir böbrek kesitinde (Şekil 5A,C), bir glomerulusun çatlaksız genişlemesi görülebilir. Ayrı bir kesitte (Şekil 5B,D) dokuda çatlama net bir şekilde görülebilir.
Şekil 1: Büyüt iş akışının şeması. Klinik olarak arşivlenmiş doku slaytlarının ön işlemesi ilk olarak saklama formatına göre gerçekleştirilir. Serbest yüzen paraformaldehit ile sabitlenmiş bölümlerin yalnızca PBS'de yıkanması gerekir. Numuneler daha sonra biyomolekülleri hidrojele sabitlemek için metakrolein dahil olmak üzere bir jel monomer çözeltisi içinde inkübe edilir. Yerinde polimerizasyon, üre, SDS ve EDTA ile ısı denatürasyonundan önce gerçekleştirilir. Numuneler daha sonra geleneksel immün boyama protokolleri, FISH protokolleri veya lipofilik boyalar kullanılarak iyice yıkanır ve boyanır. Numuneler daha sonra görüntülemeden önce saf suda genişletilir. Bu rakam Klimas ve ark.17'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Doku örneği jelleşme odası . (A) Dokunun her iki tarafına, jel monomer çözeltisinin 4 ° C'de yayılmasına izin verilmeden önce iki parça # 1.0 kapak camı gibi iki ara parça yerleştirilir. Sıkıştırmayı önlemek için, ara parçalar doku dilimlerinden daha kalın olmalıdır. (B) 37 °C'de polimerizasyondan önce numuneyi örtmek için ikinci bir cam slayt gibi bir kapak kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir insan böbrek dokusu kesitinin genişleme öncesi görüntüleri örneği. (A) 60x büyütmede (1,4 NA) çekilen bir görüntü ile (B) 40x büyütmede (1,15 NA, genişletme faktörü: 8,15x) çekilen Büyütme ile genişletme sonrası aynı görüş alanına sahip bir görüntü karşılaştırıldığında. Eflatun, DAPI; Sarı, ACTN4. Genişletme sonrası görüntülerin maksimum yoğunluğu 25 kareye yansıtılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Büyütme ile alternatif biyomolekül boyama stratejileri . (A) (i ve iv) Tamamen genişlemiş fare beyin dokusunun NHS-ester pan-protein etiketlemesi. (ii ve v) Aynı fare beyin dokusunun lipofilik boya (DiD) etiketlemesi. (iii ve vi) Kanallar birleştirildi. (B) FFPE normal insan lenf nodu dokusu kullanılarak Büyütülmüş DNA BALIĞI. Genleşme faktörü: 1x PBS'de 3,5x. Beyaz, DAPI; Eflatun, serin/treonin kinaz 1 geni; Mavi, APC/C aktivatör protein CDH1 geni; Sarı, insan uydu dizisi S4. (C) B ile ilişkili münferit kanallar. Tüm görüntüler 40x büyütmede (1.15 NA) dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 5 μm kalınlığındaki FFPE böbrek örneklerinin temsili sonuçları. (A) Çatlaksız genişleme. Beyaz, DAPI; Sarı, vimentin; Camgöbeği, alfa-aktinin 4; Eflatun, buğday tohumu aglütinin. (B) Çatlama gösteren genişlemiş böbrek bölümü. Çatlama, bozulmalar ve etiketli hedeflerin kaybı, yetersiz ankraj ve/veya homojenizasyonun sonucu olabilir. (C,D) Sırasıyla A ve B'deki kutulu bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri. Tüm görüntüler 10x (A,B; 0.45 NA) veya 60x (C,D; 1.2 NA) büyütmede dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Jel monomer çözeltisi bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Homojenizasyon tamponu bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: Doğrulanmış dokular için metakrolein ve homojenizasyon koşullarının özeti. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, tek bir kimyasal ankraj ile birden fazla biyomolekülü tutabilen ve ısı denatürasyonu ile zorlu FFPE klinik örneklerini11 kata kadar genişletebilen bir ExM varyantı olan Magnify protokolünü sunuyoruz. Bu protokolü diğer ExM protokollerinden ayıran temel değişiklikler, tamamen genişletildiğinde bile mekanik olarak sağlam kalan yeniden formüle edilmiş bir jelin kullanımını ve ayrıca biyomolekül çapası olarak metakrolein kullanımını içerir. Bu protokoldeki en kritik adımlar aşağıdaki gibidir: 1) nihai jel çözeltisinin bileşimi; 2) jelleşme adımlarının zamanlaması; 3) jelleşme odasının kurulumu; 4) numune homojenizasyonu için parametreler; ve 5) genleşme sonrası boyamadan önce numuneden SDS'nin yeterli şekilde yıkanması.
Bu protokol için en kritik parametre, nihai jelleşme çözeltisinin bileşimi, özellikle biyomolekül çapa metakroleinin konsantrasyonudur. Farklı doku tiplerini genişletmek için farklı metakrolein konsantrasyonları gereklidir (Tablo 3) ve bu değerin genişletilecek numuneyle iyi eşleşmesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Metakrolein ile aşırı ankraj, genleşme faktörünün azalmasına ve genişleme sonrası boyama için mevcut epitopların kaybına neden olabilirken, özellikle FFPE klinik örneklerinde yetersiz ankraj, doku çatlaklarına veya bozulmasına neden olabilir. Bu nedenle, metakrolein konsantrasyonu, doğrulanmamış doku tipleri için optimize edilmelidir, ancak optimal konsantrasyon muhtemelen burada sunulan aralığa yakın veya içinde olacaktır. Bu protokolün çoğu doku tipi için, hatta henüz doğrulamadıklarımız için bile işe yarayacağını beklerken, kemik içeren numuneler için işe yaramadığı bilinmektedir.
Metakroleinin ötesinde, kritik bir jel bileşeninin (4HT veya TEMED) yanlış bir konsantrasyonunun kullanılması, eksik veya hiç jelleşme (aşırı 4HT) veya erken jelleşme (aşırı TEMED, azaltılmış 4HT veya diğer bileşenlerden önce APS eklenmesi) nedeniyle deneyin tamamen başarısız olmasına neden olabilir. Erken jelleşmeyi önlemek için, numunenin ve jelin 4°C'de tutulması ve 30 dakika boyunca havaya maruz bırakılması ve difüzyon işlemi tamamlandıktan sonra numunenin sadece üzerinin örtülmesi ve nemlendirilmiş bir odaya 37°C'de yerleştirilmesi gerekir.
Jel haznesini oluştururken, iki kaplanmamış cam slayt arasındaki ara parçaların dahil edilmesi, özellikle PFA ile sabitlenmiş fare beyni gibi daha kalın doku bölümleri için kritik öneme sahiptir. Ara parçaların olmaması doku sıkışmasına neden olarak bozuk görüntülere ve yanlış verilere neden olabilir.
Numune homojenizasyonu, parçalama tamponu ile parçalama süresinin yanı sıra parçalama tamponunun sıcaklığına ve bileşimine bağlıdır. Yetersiz homojenizasyon, belirli bir doku tipi için rapor edilen değere kıyasla bozulmalara ve azalmış genleşme faktörlerine neden olabilir. Eksik homojenizasyondan şüpheleniliyorsa, özellikle daha kalın dokular söz konusu olduğunda sindirim süresi artırılabilir.
Basit ama önemli bir adım, homojenizasyon adımından sonra SDS'nin numuneden iyonik olmayan bir yüzey aktif madde (C12E10 gibi) ile uygun şekilde yıkanmasıdır. Herhangi bir artık SDS, yetersiz veya tamamen engellenmiş antikor bağlanmasına neden olabilir. Neyse ki, bundan şüpheleniliyorsa, daha fazla yıkama ve antikorların yeniden uygulanması genellikle tatmin edici bir çözüm olacaktır.
Protokol, FFPE klinik örnekleri de dahil olmak üzere çeşitli doku örneklerinde nano ölçekli yapıları sorgulamak için mevcut süper çözünürlüklü görüntüleme ve elektron mikroskobu tekniklerine uygun maliyetli bir alternatif sunar. Metakrolein ve ısı denatürasyonunun kullanımı, doku fiksasyonu sırasında korunan herhangi bir biyomolekülün genişleme sonrası profillenmesine izin verir (bu, örneğin FFPE örneklerinde lipitlerin görüntülenmesini engeller). ExM çerçevesinin bir uzantısı olarak protokolümüz modülerdir ve muhtemelen optik süper çözünürlük yöntemleri (STED18, STORM 19) veya yinelemeli genişleme mikroskobu (iExM)15 gibi diğer tekniklerle uyumludur. Bununla birlikte, bunlar henüz sunulan protokolle test edilmemiştir ve büyük genleşme faktörleri, özellikle florofor seyreltmesinde zorluklar ortaya çıkarabilir. Ek olarak, suda tam genleşmeden sonra numunelerin büyük boyutu, kullanım sırasında dikkatli olunmasını gerektirir (burada kullanılan jel, on kat sağlam genleşme mikroskobu (TREx) gibi önceki yüksek genleşme faktörlü ExM jel formülasyonlarından daha esnek olmasına rağmen, yanlışlıkların işlenmesinekarşı 17) ve bu tamamen genleşmiş jelleri aktarmak ve görüntülemek için bazen yaratıcı çözümler gerekir. Örneğin, bir boya fırçası yerine tamamen genişlemiş jelleri aktarmak için ince bir plastik levha gibi geniş tabanlı aletler kullanmak veya özel yapım büyük görüntüleme plakaları kullanmak (bizim elimizde bu, lazerle kesilmiş veya 3D baskılı plakalar anlamına gelir. # 1.5 kapak camı parçaları yapıştırılmıştır; bunlar ekteki videoda görülebilir). En önemlisi, bu yöntem, yaygın biyolojik ve patolojik numune preparatlarının geleneksel geniş alan veya konfokal mikroskoplarda nano ölçekte görüntülenmesine izin vererek nano ölçekli görüntülemenin uygulanabilirliğini genişletir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar aşağıdaki rakip finansal çıkarları beyan eder: Y.Z., A.K., Z.C. ve B.R.G., Magnify ve ExM ile ilgili birkaç icat icat etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Carnegie Mellon Üniversitesi ve DSF Yardım Vakfı (YZ ve XR), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir. Yönetmenin Yeni Yenilikçi Ödülü DP2 OD025926-01 ve Kauffman Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
