Summary
Apresentamos aqui uma nova versão da microscopia de expansão (ExM), Magnify, que é modificada para expansão de até 11 vezes, conservando uma ampla gama de classes de biomoléculas, e é compatível com uma ampla gama de tipos de tecidos. Ele permite a interrogação da configuração em nanoescala de biomoléculas usando microscópios convencionais limitados por difração.
Abstract
A obtenção de imagens em nanoescala de espécimes biológicos pode melhorar a compreensão da patogênese de doenças. Nos últimos anos, a microscopia de expansão (ExM) tem se mostrado uma alternativa eficaz e de baixo custo à microscopia óptica de super-resolução. No entanto, tem sido limitada pela necessidade de agentes de ancoragem específicos e muitas vezes personalizados para reter diferentes classes de biomoléculas dentro do gel e por dificuldades com a expansão de formatos de amostras clínicas padrão, como tecido fixado em formalina e embebido em parafina, especialmente se fatores de expansão maiores ou epítopos proteicos preservados forem desejados. Aqui, descrevemos o Magnify, um novo método ExM para expansão robusta de até 11 vezes em uma ampla gama de tipos de tecido. Ao usar a metacroleína como âncora química entre o tecido e o gel, o Magnify retém múltiplas biomoléculas, como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, dentro do gel, permitindo assim a obtenção de imagens em larga escala nanoescala dos tecidos em microscópios ópticos convencionais. Este protocolo descreve as melhores práticas para garantir uma expansão de tecido robusta e livre de rachaduras, bem como dicas para manuseio e geração de imagens de géis altamente expandidos.
Introduction
Os sistemas biológicos exibem heterogeneidade estrutural, desde os membros e órgãos até os níveis de proteínas na nanoescala. Portanto, uma compreensão completa do funcionamento desses sistemas requer um exame visual através dessas escalas de tamanho. No entanto, o limite de difração da luz causa desafios na visualização de estruturas menores que ~200-300 nm em um microscópio de fluorescência convencional. Além disso, os métodos ópticos de super-resolução 1,2,3, como a depleção de emissão estimulada (STED), a microscopia de localização fotoativada (PALM), a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e a microscopia de iluminação estruturada (SIM), embora poderosos, apresentam seus próprios desafios, pois requerem hardware e reagentes caros e, muitas vezes, têm tempos de aquisição lentos e baixa capacidade de obter imagens de grandes volumes em 3D.
A microscopia de expansão4 (ExM) fornece um meio alternativo de contornar o limite de difração da luz ancorando covalentemente biomoléculas em um gel de polímero intumescível em água e separando-as fisicamente, tornando-as resolúveis em microscópios ópticos convencionais. Uma infinidade de variantes do protocolo ExM foi desenvolvida desde a publicação original do ExM há menos de uma década, e esses protocolos permitem a incorporação direta de proteínas 5,6,7, RNA 8,9,10 ou lipídios11,12,13 na rede de gel, alterando a âncora química ou expandindo ainda mais a amostra (melhorando assim a resolução efetiva) em um único passo14 ou em vários passos iterativos15,16. Até recentemente, nenhum protocolo ExM poderia reter essas três classes de biomoléculas com uma única âncora química comercialmente disponível, fornecendo um gel mecanicamente resistente que poderia se expandir ~10 vezes em uma única rodada de expansão.
Aqui, apresentamos a Magnify17, uma adição recente ao arsenal ExM que usa metacroleína como âncora de biomolécula. A metacroleína forma ligações covalentes com tecidos como o do paraformaldeído, garantindo que várias classes de biomoléculas possam ser retidas dentro da rede de gel sem a necessidade de vários agentes de ancoragem específicos ou personalizados. Além disso, essa técnica pode expandir um amplo espectro de tecidos em até 11 vezes, incluindo amostras notoriamente desafiadoras, como amostras clínicas fixadas em formalina e emblocadas em parafina (FFPE). Métodos anteriores para expandir tais amostras mecanicamente rígidas exigiam digestão severa de proteases, tornando impossível a marcação de anticorpos de proteínas de interesse após a amostra ter sido expandida. Em contraste, esta técnica consegue a expansão de amostras clínicas FFPE usando uma solução desnaturante a quente, preservando assim epítopos de proteína inteira dentro do gel, que podem ser alvo de imagem pós-expansão (Figura 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Carnegie Mellon. Amostras de tecido humano foram obtidas comercialmente.
1. Preparação dos reagentes e soluções de estoque
NOTA: Consulte a Tabela de materiais para obter uma lista dos reagentes usados.
- Prepare as soluções-mãe gelificantes. Estes serão combinados imediatamente antes da etapa de gelificação.
- Preparar a solução-mãe de monómero (ácido n,n-dimetilacrilamida 4 g/100 mL [DMAA], 50 g/100 ml de acrilato de sódio [AS], 66,7 g/100 ml de acrilamida [AA], 0,10 g/100 mL N,N′-metilenobisacrilamida [Bis], 33 g/100 ml de cloreto de sódio [NaCl], 1x solução salina tamponada com fosfato; PBS) utilizando os componentes listados na Tabela 1. Dissolver ou diluir todas as soluções-mãe em água. A solução-mãe de monómero pode ser armazenada a 4 °C durante, pelo menos, 3 meses.
- Fazer separadamente em água as seguintes soluções-mãe: 0,5% (p/p) 4-Hidroxi-TEMPO (4HT), que inibe a gelificação durante a difusão do monômero nos tecidos, e 10% (p/p) tetrametiletilenodiamina (TEMED), que acelera a geração radical iniciada pelo persulfato de amônio (APS) e é preparada a 10% (p/p).
NOTA: As soluções-mãe podem ser distribuídas em alíquotas de 1-2 mL e armazenadas a 4 °C por até 3 meses; no entanto, a SAF é feita imediatamente antes de preparar a solução gelificante.
- Preparar o tampão de homogeneização (1% p/v S.D.S., 8 M de ureia, 25 mM de EDTA, 2x PBS, pH 8, à temperatura ambiente [R.T.]) combinando 1 g de SDS, 48,048 g de ureia, 5 mL de EDTA (0,5M, pH 8), 20 mL de 10x PBS, 25 mL de Tris (2 M) e 0,75 g de glicina. Adicionar água para um volume total de 100 mL. A solução pode ser ampliada ou reduzida conforme necessário e pode ser armazenada em R.T.
2. Preparo tecidual para lâminas de tecidos clínicos arquivados e recém-preparados
NOTA: As etapas de pré-processamento do tecido diferem com base em como os espécimes são preparados.
- Para amostras clínicas de FFPE (formaldeído-fixado em parafina), siga as etapas abaixo.
- Colocar as amostras em uma série sequencial de soluções (pode ser usado um frasco de coloração de lâmina de vidro ou tubo cônico de 50 mL): xileno, etanol 95%, etanol 70% e etanol 50%, seguidos de água duplamente deionizada. Use cada solução duas vezes por pelo menos 3 min de cada vez. Use a pinça para colocar a lâmina no recipiente e adicione 15 mL da respectiva solução (o suficiente para cobrir a amostra). Coloque o tubo cônico tampado horizontalmente em um agitador à temperatura ambiente.
- Para amostras coradas e montadas em lâminas permanentes, siga os passos abaixo.
- Coloque a lâmina brevemente em xileno e remova cuidadosamente as lamínulas usando uma ferramenta apropriada, como uma lâmina de barbear. Se a lamínula permanecer presa, devolva as lâminas em xileno à temperatura ambiente até que a lamínula se solte.
- Em seguida, processe as amostras como amostras FFPE (passo 2.1.1).
NOTA: Para lâminas coradas com hematoxilina e eosina (H&E), a coloração de hematoxilina e eosina é perdida durante o processo de expansão.
- Para lâminas de tecido congelado não fixadas em solução de temperatura de corte ótima (OCT), fixe os tecidos em acetona a -20 °C por 10 minutos antes de lavar as amostras com 1x solução de PBS três vezes por 10 min cada vez à temperatura ambiente.
- Para lâminas de tecido clínico congelado previamente fixadas, derreter o OCT incubando as lâminas por 2 min à temperatura ambiente e, em seguida, lavar com solução de PBS 1x três vezes por 5 min cada vez à temperatura ambiente.
3. Preparação tecidual para cérebro de camundongo fixado com paraformaldeído
- Siga este protocolo para seções cerebrais de camundongos com 30-50 μm de espessura.
NOTA: O sucesso pode ser encontrado com seções maiores, mas tempos mais longos podem ser necessários para a difusão e homogeneização da solução de monômero. - Se as seções não estiverem atualmente armazenadas em uma solução de PBS 1x (por exemplo, em uma solução de glicerol [v/v] a 30% e etilenoglicol a 30% [v/v] em 1x PBS), lave três vezes por pelo menos 10 min cada vez à temperatura ambiente em 1x PBS em uma placa de 6 a 24 poços.
- Obter uma lâmina de microscopia de vidro não revestida. Se um lado da lâmina de vidro for revestido, use um pincel molhado para verificar o lado não revestido (muitas vezes, a etiqueta do lado revestido será feita de vidro moído e se tornará menos opaca quando molhada).
- Use um pincel para molhar a lâmina sem revestimento. Remova o tecido cerebral do rato da placa do poço com o pincel e coloque-o cuidadosamente sobre a lâmina, usando um movimento de rolamento para garantir que o tecido esteja plano. Deixe o excesso de PBS permanecer no tecido até que todos os cortes sejam montados.
NOTA: Embora uma única lâmina de vidro possa ser usada para várias seções de tecido, quando mais seções de tecido são gelificadas ao mesmo tempo (mesmo em lâminas separadas), mais cuidado deve ser tomado para garantir que elas não sequem completamente. - Usando um pano de papel de laboratório, remova a maior parte do excesso de PBS da lâmina. Deixe um pequeno anel líquido ao redor de cada seção de tecido, mas deixe o resto da lâmina praticamente seca. Este líquido restante cobrirá o tecido enquanto a solução de monômero de gel estiver sendo preparada.
4. Geleixização
NOTA: Este protocolo é adequado para todos os tipos de tecidos preparados para uso com esta técnica.
- Aplicar espaçadores em cada lado do corte de tecido (Figura 2A) para evitar a compressão do tecido. Para fazer isso, faça os espaçadores cortando finamente pedaços de vidro de cobertura usando uma caneta com ponta de diamante e, em seguida, fixe-os na lâmina usando pequenas quantidades de água ou 1x PBS, ou fixe-os usando uma pequena quantidade de super cola. Em seguida, coloque delicadamente os espaçadores em cada lado do tecido.
- Prepare a solução gelificante final. Geralmente, ~200 μL é suficiente por corte de tecido, mas o volume não deve exceder 800 μL por lâmina. Qualquer solução gelificante mais resultará em transbordamento.
NOTA: A metacroleína é usada para ancorar biomoléculas no gel. No entanto, nenhuma etapa de ancoragem separada é necessária, e a metacroleína pode ser adicionada diretamente à solução gelificante final.- Por secção, combinar o seguinte por ordem: 200 μL de solução monomérica, 0,5 μL de solução-mãe 4HT a 0,5% (diluição 1:400), 0,2-0,5 μL de metacroleína (diluição 1:400-1:1.000, dependendo do tipo de tecido; geralmente, utilizar uma diluição 1:1.000 para amostras fixadas em paraformaldeído [PFA] e 1:400 para amostras clínicas FFPE), 2 μL de solução-mãe TEMED a 10% (diluição 1:100), e 5 μL de solução-estoque de A.P.S. a 10% (diluição de 1:40).
NOTA: Preparar a solução gelificante final imediatamente antes da utilização. Para evitar a gelificação prematura, adicione a solução de APS por último.
- Por secção, combinar o seguinte por ordem: 200 μL de solução monomérica, 0,5 μL de solução-mãe 4HT a 0,5% (diluição 1:400), 0,2-0,5 μL de metacroleína (diluição 1:400-1:1.000, dependendo do tipo de tecido; geralmente, utilizar uma diluição 1:1.000 para amostras fixadas em paraformaldeído [PFA] e 1:400 para amostras clínicas FFPE), 2 μL de solução-mãe TEMED a 10% (diluição 1:100), e 5 μL de solução-estoque de A.P.S. a 10% (diluição de 1:40).
- Retire o excesso de solução da seção de tecido e coloque a lâmina em uma placa de Petri. Adicionar à amostra toda a solução gelificante fresca e preparada recentemente e incubar a mistura no tecido durante 30 minutos a 4 °C para permitir a difusão para o tecido.
- Coloque uma segunda lâmina de vidro não revestida cuidadosamente sobre o tecido e a solução de gel. Bolhas de ar devem ser evitadas (Figura 2B).
NOTA: Se as bolhas de ar ficarem presas sobre o tecido, a tampa de vidro pode ser cuidadosamente levantada e colocada de volta para baixo. Além disso, qualquer solução de monômero que vaze pode ser cortada após a polimerização e não causará problemas para o tecido. - Certifique-se de que a polimerização seja concluída. Essa polimerização pode ser feita de duas formas, cada uma produzindo resultados semelhantes. Primeiro, incube as amostras a 37 °C em um ambiente umidificado (como uma placa de Petri fechada com uma toalha de papel úmida) durante a noite. Alternativamente, para uma polimerização mais rápida, incubar as amostras na atmosfera umidificada por 2 h a 37 °C seguido de 1 h a 60 °C.
5. Digestão da amostra e expansão do tecido
NOTA: Este protocolo é adequado para todos os tipos de tecido.
- Usando proteção ocular, deslize uma lâmina de barbear entre as duas lâminas de vidro da câmara gelificante para separá-las.
NOTA: As lâminas de vidro devem separar-se muito facilmente. Se diferentes partes do gel estiverem presas a ambas as lâminas, um pincel pode ser usado para guiar o gel para uma ou outra. Se o gel se tornou particularmente seco durante a polimerização, 1x PBS pode ser aplicado na parte externa da câmara de gel, mas não submerja o gel completamente, pois isso fará com que ele se expanda antes que o tecido seja homogeneizado, o que resultará em rachaduras. - Corte o gel em branco ao redor do tecido para minimizar o volume. O corte assimétrico do gel permite o rastreamento da orientação do gel após a homogeneização, pois a amostra ficará completamente transparente.
- Levante suavemente o gel que contém tecido da lâmina com uma lâmina de barbear e transfira-o suavemente para um tubo de centrífuga de 2 mL com um pincel.
- Encher o tubo até ao topo com tampão de homogeneização (Tabela 2) pré-aquecido a 80 °C.
- Incubar a amostra com agitação a 80 °C durante 8 h (para cérebro de ratinho fixado em PFA) ou 60 h (a maioria das amostras clínicas FFPE; ver Tabela 3).
OBS: O tempo de homogeneização é dependente do tipo de tecido e do método de fixação. Muitas dessas condições já foram validadas, mas para outras, a otimização pode ser necessária. - Despeje o conteúdo do tubo de centrífuga em um único poço de uma placa de cultura de células plásticas de 6 poços.
- Remova o tampão de desnaturação com um pipet de transferência.
- Para remover completamente o SDS restante do hidrogel, lavar a amostra numa solução de tensoactivo não iónico a 1% (C12E 10) da seguinte forma: pelo menos três vezes durante10 minutos de cada vez à temperatura ambiente; por 60 min a 60 °C; e, em seguida, mais três lavagens por 10 min cada vez em temperatura ambiente.
- Armazenar a amostra em 1x PBS + azida sódica a 0,02% a 4 °C até que a coloração pós-expansão e as imagens precisem ser realizadas.
NOTA: Neste ponto, a amostra deve ser ~3-4,5 vezes maior em cada dimensão, dependendo do tipo de tecido.
6. Perfil de biomoléculas pós-expansão
- Coloração de anticorpos
NOTA: Isso segue um protocolo típico de coloração de imunofluorescência (IF)/imunohistoquímica (I.H.C.). As quantidades de anticorpos primários e secundários utilizados dependem das concentrações sugeridas pelo fabricante ou pela otimização para o experimento específico. Buffers individuais podem ser substituídos a critério do usuário.- Com a amostra em um único poço de uma placa de cultura celular de 6 poços, lave as amostras expandidas três vezes por 10 min cada vez em 1x PBS em T.R., transferindo o líquido com uma pipeta.
- Executar uma etapa de bloqueio opcional (por exemplo, albumina de soro bovino a 3%/Triton-X100 a 0,1% em 1x PBS) por pelo menos 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
- Incubar com os anticorpos primários em tampão de coloração (por exemplo, 0,1% Triton-X100 1x PBS ou 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L heparina) durante a noite a 37 °C. Dependendo do tamanho da amostra, 0,5-2 mL deve cobrir adequadamente o gel.
- Lavar a amostra três vezes durante, pelo menos, 10 minutos de cada vez em 1x PBS à temperatura ambiente.
- Incubar nos anticorpos secundários correspondentes durante 3 h a 37 °C no tampão de coloração de escolha.
- Lavar a amostra três vezes durante, pelo menos, 10 minutos de cada vez em 1x PBS à temperatura ambiente.
- Coloração pan-proteína do NHS-éster
- Com a amostra em uma placa de 6 poços, despeje 1-2 mL de polietilenoglicol (PEG 200) sobre a amostra (o suficiente para cobri-la completamente).
NOTA: O tecido deve encolher e retornar ao seu tamanho original pré-expansão (ou próximo a ele). - Coloração com éster-NHS conjugado com fluoróforo diluído a 13,3-80 μg/mL por 3 h em T.R. em 1-2 mL de tampão de coloração (por exemplo, 1x PBS, 2x S.S.C. ou solução de bicarbonato de sódio 100 mM).
- Lavar a amostra três vezes durante, pelo menos, 10 minutos de cada vez em 1x PBS à temperatura ambiente.
- Com a amostra em uma placa de 6 poços, despeje 1-2 mL de polietilenoglicol (PEG 200) sobre a amostra (o suficiente para cobri-la completamente).
- Coloração lipídica
NOTA: A coloração lipídica pós-expansão não é eficaz em amostras clínicas FFPE, pois os lipídios são perdidos durante o processo de fixação.- Lavar a amostra três vezes durante, pelo menos, 10 minutos de cada vez em 1x PBS à temperatura ambiente.
- Aplicar um corante lipofílico convencional (DiO, DiI ou DiD) diluído 200 vezes em 2 mL de TritonX-100/1x PBS a 0,1% por 72-96 h à temperatura ambiente.
- Lave pelo menos três vezes com 1x PBS
- Hibridação in situ fluorescente (FISH)
- Colocar amostras de gel homogeneizado em tampão de hibridização pré-aquecido a 60 °C durante 30 min.
- Preparar o tampão de hibridização para FISH: Combinar 2x S.S.C. (NaCl 300 mM, citrato de sódio 30 mM, pH 7,0), sulfato de dextran a 10% (v/v), carbonato de etileno a 20% (v/v) e Tween a 0,1% (v/v)20.
- Incubar as amostras de gel com um tampão de hibridização contendo 10 pM (por oligo) de sondas FISH contra o gene alvo (pelo menos 20 sondas por 10 kb) a 45 °C durante a noite.
- Lavar com tampão de lavagem de rigor (2x S.S.C. e 0,1% Tween20) duas vezes por 15 min cada vez a 45 °C.
- Lavar com tampão de lavagem de rigor mais duas vezes durante 10 minutos de cada vez a 37 °C.
- Finalmente, lave com 1x PBS pelo menos três vezes por 10 min cada vez à temperatura ambiente.
- As amostras estão prontas para aquisição de imagens ou armazenamento em 1x PBS + azida sódica a 0,02% a 4 °C.
- Expansão tecidual completa e imagem de fluorescência
NOTA: O fator de expansão atingível com o Magnify varia de acordo com o tipo de tecido e o método de expansão (um resumo completo pode ser encontrado na Tabela 3). No entanto, como uma estimativa geral, uma amostra de ampliação se expandirá 3-4,5 vezes em 1x PBS, 5-7 vezes em PBS diluído para 1:50 em ddH 2 O e8-11 vezes em ddH2O. O fator de expansão ideal para aquisição de imagens depende das necessidades de cada experimento. O fator de expansão é altamente ajustável, de modo que uma única amostra pode ser expandida e encolhida muitas vezes para obtenção de imagens em várias escalas.- Mova as amostras expandidas 4 vezes em PBS para uma placa de imagem de 6 poços com fundo de vidro usando um pincel. Mova ainda mais qualquer amostra expandida cortando-a em pedaços menores ou colocando-a suavemente em uma grande placa de imagem com fundo de vidro com um pedaço fino de plástico flexível.
- Realize imagens de fluorescência usando um microscópio convencional de campo largo, um microscópio confocal ou outro sistema de imagem de sua escolha. Remover o excesso de líquido ao redor do gel com um pano de laboratório de papel pode impedir o movimento do gel durante a imagem. Os géis também podem ser imobilizados pela aplicação de poli-L-lisina a 0,1% na superfície do vidro antes da obtenção de imagens.
NOTA: A aplicação de poli-L-lisina tornará o gel totalmente imóvel após o contato. Por esta razão, deve-se tomar cuidado para que o gel seja aplicado no vidro sem dobrar ou esticar. Além disso, o gel não deve secar completamente em vidro revestido com poli-L-lisina, pois isso pode dificultar a remoção, e o gel não deve ser encolhido em PBS enquanto ainda estiver preso ao vidro com poli-L-lisina, pois isso pode causar danos ao gel ou tecido. - Após a obtenção de imagens, encolher as amostras em PBS 1x com pelo menos três lavagens por 10 min de cada vez, pois não é recomendado armazenar as amostras a longo prazo em ddH2O devido à degradação do sinal de fluorescência. Em particular, amostras totalmente expandidas coradas com corantes lipofílicos devem ser fotografadas o mais próximo possível do tempo de expansão para evitar a dissociação do corante na água.
- Conservar as amostras em 1x PBS + 0,02% de azida sódica a 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Se o protocolo tiver sido concluído com sucesso (Figura 1), a amostra aparecerá clara e plana após a desnaturação por calor; qualquer dobramento ou enrugamento indica homogeneização incompleta. Uma amostra expandida com sucesso será 3-4,5 vezes maior do que antes da expansão em 1x PBS e 8-11 vezes maior quando totalmente expandida em ddH2O. A Figura 3 mostra imagens de exemplo pré e pós-expansão de amostra de rim humano FFPE de 5 μm de espessura processada usando este protocolo e expandida com sucesso mais de 8 vezes. O tecido foi primeiramente corado com anticorpos para ACTN4 juntamente com DAPI para visualização do DNA nuclear. O espécime foi então fotografado usando um microscópio confocal de disco giratório (Figura 3A). O tecido foi tratado seguindo o protocolo acima, incluindo a coloração pós-expansão dos mesmos alvos, e totalmente expandido em água (Figura 3B) antes da re-imagem. Após a desnaturação térmica, outras biomoléculas além das proteínas também podem ser coradas e imageadas, como mostrado na Figura 4. Corantes lipofílicos podem ser aplicados para revelar as estruturas da membrana celular e mitocondrial no cérebro de camundongos (Figura 4A). Além disso, os ácidos nucléicos podem ser imageados através de FISH, como no tecido linfonodal humano normal FFPE mostrado na Figura 4B,C.
A Figura 5 demonstra um desfecho provável se a amostra não for homogeneizada adequadamente. Após a expansão, o tecido foi corado com anticorpos para ACTN4 e vimentina, juntamente com DAPI para visualização do DNA nuclear e aglutinina do germe de trigo (WGA) para marcar os carboidratos. O tecido foi expandido 3,5 vezes em PBS antes da obtenção de imagens usando um microscópio confocal de disco giratório. Em um corte renal (Figura 5A,C), observa-se a expansão livre de rachaduras de um glomérulo. Em um corte separado (Figura 5B,D), a fissuração pode ser claramente vista no tecido.
Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho Ampliar. O pré-processamento das lâminas de tecido arquivadas clinicamente é realizado primeiramente com base no formato de armazenamento. As seções fixas de paraformaldeído flutuantes só precisam ser lavadas em PBS. As amostras são então incubadas em uma solução de monômero em gel, incluindo metacroleína para ancorar as biomoléculas ao hidrogel. A polimerização in situ é realizada antes da desnaturação térmica com ureia, SDS e EDTA. As amostras são então cuidadosamente lavadas e coradas usando protocolos convencionais de imunomarcação, protocolos de FISH ou corantes lipofílicos. As amostras são então expandidas em água pura antes da obtenção de imagens. Esse valor foi modificado de Klimas et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Câmara de gelificação da amostra de tecido. (A) Em cada lado do tecido, dois espaçadores, como dois pedaços de vidro de cobertura #1.0, são colocados antes que a solução de monômero de gel seja difundida a 4 °C. Para evitar compressão, os espaçadores devem ser mais espessos que os cortes de tecido. (B) Uma tampa, como uma segunda lâmina de vidro, é usada para cobrir a amostra antes da polimerização a 37 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplo de imagens pré-expansão de uma secção de tecido renal humano. (A) Uma imagem tirada com aumento de 60x (1,4 NA) comparada a (B) uma imagem do mesmo campo de visão pós-expansão com ampliação tomada em aumento de 40x (1,15 NA, fator de expansão: 8,15x). Magenta, DAPI; Amarelo, ACTN4. A intensidade máxima das imagens pós-expansão é projetada em 25 quadros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Estratégias alternativas de coloração de biomoléculas com Magnify . (A) (i e iv) marcação pan-proteica do NHS-éster do tecido cerebral de camundongo totalmente expandido. (ii e v) Marcação de corante lipofílico (DiD) do mesmo tecido cerebral de camundongo. (iii e vi) Os canais se fundiram. (B) DNA FISH com Magnify usando tecido linfonodal humano FFPE normal. Fator de expansão: 3,5x em 1x PBS. Branco, DAPI; Magenta, gene da serina/treonina quinase 1; Azul, gene CDH1 da proteína ativadora APC/C; Amarelo, sequência de satélite humano S4. (C) Canais individuais associados a B. Todas as imagens foram obtidas em microscópio confocal de disco giratório com aumento de 40x (1,15 NA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos de amostras de rim FFPE de 5 μm de espessura. (A) Expansão livre de rachaduras. Branco, DAPI; Amarelo, vimentina; Ciano, alfa-actinina 4; Magenta, aglutinina do gérmen de trigo. (B) Secção de rim expandido exibindo fissuras. Fissuras, distorções e perda de alvos marcados podem ser o resultado de ancoragem e/ou homogeneização inadequadas. (C,D) Imagens ampliadas das regiões encaixotadas em A e B, respectivamente. Todas as imagens foram obtidas em microscópio confocal de disco giratório com aumento de 10x (A,B; 0,45 NA) ou 60x (C,D; 1,2 NA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição da solução de monômero em gel. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Composição do tampão de homogeneização. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Resumo das condições de metacroleína e homogeneização dos tecidos validados. Clique aqui para baixar esta tabela.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, apresentamos o protocolo Magnify 17, uma variante de ExM que pode reter múltiplas biomoléculas com uma única ancoragem química e expandir espécimes clínicos FFPE desafiadores até11 vezes com desnaturação térmica. As principais mudanças neste protocolo que o distinguem de outros protocolos ExM incluem o uso de um gel reformulado que permanece mecanicamente robusto mesmo quando totalmente expandido, bem como o uso de metacroleína como âncora da biomolécula. As etapas mais críticas desse protocolo são: 1) a composição da solução final de gel; 2) o tempo das etapas de gelificação; 3) a montagem da câmara de gelificação; 4) os parâmetros para homogeneização da amostra; e 5) lavagem suficiente do SDS da amostra antes da coloração pós-expansão.
O parâmetro mais crítico para este protocolo é a composição da solução gelificante final, particularmente a concentração da biomolécula âncora metacroleína. Diferentes concentrações de metacroleína são necessárias para expandir diferentes tipos de tecido (Tabela 3), e deve-se tomar cuidado para garantir que esse valor seja compatível com a amostra a ser expandida. A sobreancoragem com metacroleína pode resultar em um fator de expansão reduzido e uma perda de epítopos disponíveis para coloração pós-expansão, enquanto a subancoragem, especialmente em amostras clínicas FFPE, pode resultar em fissuras ou distorção tecidual. Portanto, a concentração de metacroleína deve ser otimizada para tipos de tecidos não validados, embora a concentração ótima provavelmente fique próxima ou dentro da faixa aqui apresentada. Embora esperemos que este protocolo funcione para a maioria dos tipos de tecidos, mesmo aqueles que ainda não validamos, sabe-se que não funciona para amostras contendo osso.
Além da metacroleína, o uso de uma concentração incorreta de um ingrediente crítico do gel (4HT ou TEMED) pode resultar no fracasso completo do experimento, seja devido à gelificação incompleta ou ausente (excesso de 4HT) ou gelificação prematura (TEMED excessivo, 4HT reduzido ou adição de SAF antes dos outros componentes). Para evitar a gelificação prematura, também é necessário manter a amostra e o gel a 4°C e expostos ao ar por 30 min e apenas cobrir a amostra e colocá-la a 37°C em uma câmara umidificada após o processo de difusão estar completo.
Ao construir a câmara de gel, incluir espaçadores entre as duas lâminas de vidro não revestidas é fundamental, especialmente para seções de tecido mais espesso, como cérebro de camundongo fixado em PFA. A falta de espaçadores pode causar compressão tecidual, resultando em imagens distorcidas e dados imprecisos.
A homogeneização da amostra depende do tempo de digestão com o tampão de digestão, bem como da temperatura e composição do tampão de digestão. A homogeneização inadequada pode causar distorções e redução dos fatores de expansão em relação ao valor relatado para um determinado tipo de tecido. Se houver suspeita de homogeneização incompleta, o tempo de digestão pode ser aumentado, particularmente no caso de tecidos mais espessos.
Uma etapa simples, mas crucial, é a lavagem adequada do SDS da amostra com um tensoativo não iônico (como C12E10) após a etapa de homogeneização. Qualquer SDS remanescente pode resultar em ligação de anticorpos subótima ou totalmente prejudicada. Felizmente, se houver suspeita disso, a lavagem adicional e a reaplicação dos anticorpos muitas vezes serão uma solução satisfatória.
O protocolo fornece uma alternativa custo-efetiva às técnicas atuais de imagem de super-resolução e microscopia eletrônica para interrogar estruturas em nanoescala em várias amostras de tecido, inclusive em espécimes clínicos FFPE. O uso de metacroleína e desnaturação térmica permite o perfil pós-expansão de quaisquer biomoléculas que são preservadas durante a fixação tecidual (isso impede a obtenção de imagens de lipídios em amostras de FFPE, por exemplo). Nosso protocolo, como uma extensão do framework ExM, é modular e provavelmente compatível com outras técnicas, como métodos ópticos de super-resolução (STED18, STORM19) ou microscopia de expansão iterativa (iExM)15. No entanto, estes ainda precisam ser testados com o protocolo apresentado, e os grandes fatores de expansão podem apresentar desafios, especialmente com a diluição do fluoróforo. Além disso, o grande tamanho das amostras após a expansão total em água requer cuidado ao manusear (embora o gel usado aqui seja mais resistente do que as formulações anteriores de gel ExM de alto fator de expansão, como microscopia de expansão robusta de dez vezes (TREx), para lidar com erros17), e soluções criativas são ocasionalmente necessárias para transferir e obter imagens desses géis totalmente expandidos. Por exemplo, usando implementos de base larga, como uma folha fina de plástico para transferir os géis totalmente expandidos em vez de um pincel, ou usando placas de imagem grandes feitas sob medida (em nossas mãos, isso significa placas cortadas a laser ou impressas em 3D com grandes pedaços de vidro de capa #1.5 aderidos ao fundo; estes podem ser vistos no vídeo que acompanha). Mais importante, este método amplia a aplicabilidade da imagem em nanoescala, permitindo a obtenção de imagens em nanoescala de preparações de amostras biológicas e patológicas comuns em microscópios convencionais de campo largo ou confocais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram o(s) seguinte(s) interesse(s) financeiro(s) concorrente(s): Y.Z., A.K., Z.C. e B.R.G. inventaram várias invenções relacionadas à Magnify e ExM.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Carnegie Mellon University e pela D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. e X.R.), pelo National Institutes of Health (N.I.H.) Prêmio Novo Inovador do Diretor DP2 OD025926-01 e Fundação Kauffman.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
