Summary
여기에 제시된 확장 현미경(ExM)의 새로운 버전인 Magnify는 최대 11배 확장을 위해 수정되어 포괄적인 생체 분자 클래스 배열을 보존하고 광범위한 조직 유형과 호환됩니다. 이를 통해 기존의 회절 제한 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 크기 구성을 조사할 수 있습니다.
Abstract
생물학적 표본의 나노스케일 이미징은 질병 발병기전에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 팽창 현미경(ExM)은 광학 초고해상도 현미경에 대한 효과적이고 저렴한 대안으로 입증되었습니다. 그러나 겔 내에서 서로 다른 생체 분자 클래스를 유지하기 위한 특이적이고 종종 맞춤형 앵커링제의 필요성과 특히 더 큰 확장 인자 또는 보존된 단백질 에피토프가 필요한 경우 포르말린 고정 파라핀 포매 조직과 같은 표준 임상 샘플 형식을 확장하는 데 어려움이 있기 때문에 제한되었습니다. 여기에서는 다양한 조직 유형에서 최대 11배까지 강력하게 확장할 수 있는 새로운 ExM 방법인 Magnify에 대해 설명합니다. Magnify는 메타크롤레인을 조직과 겔 사이의 화학적 앵커로 사용함으로써 단백질, 지질 및 핵산과 같은 여러 생체 분자를 겔 내에 보유하므로 기존 광학 현미경에서 조직의 광범위한 나노 스케일 이미징이 가능합니다. 이 프로토콜은 견고하고 균열 없는 조직 확장을 보장하기 위한 모범 사례와 고도로 확장된 젤을 취급하고 이미징하기 위한 팁을 설명합니다.
Introduction
생물학적 시스템은 팔다리와 장기에서 나노 규모의 단백질 수준에 이르기까지 구조적 이질성을 나타냅니다. 따라서 이러한 시스템의 작동을 완전히 이해하려면 이러한 크기 척도에 대한 육안 검사가 필요합니다. 그러나 빛의 회절 한계는 기존 형광 현미경에서 ~200-300nm보다 작은 구조를 시각화하는 데 어려움을 야기합니다. 또한 STED(Stimulated Emission Depletion), PALM(Photo-Activated Localization Microscopy), STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 및 SIM(Structured Illumination Microscopy)과 같은 광학 초해상도 방법(1,2,3)은 강력하지만 값비싼 하드웨어와 시약이 필요하고 종종 획득 시간이 느리고 3D로 대량을 이미지화하는 능력이 떨어지기 때문에 고유한 문제를 제시합니다.
팽창 현미경4(ExM)는 생체 분자를 팽윤성 폴리머 겔에 공유 결합하고 물리적으로 분리하여 기존 광학 현미경에서 분해할 수 있도록 함으로써 빛의 회절 한계를 우회하는 대체 수단을 제공합니다. 10년 전 ExM이 처음 발표된 이후 다수의 ExM 프로토콜 변이체가 개발되었으며, 이러한 프로토콜은 단백질 5,6,7, RNA 8,9,10 또는 지질11,12,13의 직접적인 혼입을 가능하게 합니다 단일 단계(14) 또는 다중 반복 단계(15,16)에서 화학적 앵커를 변경하거나 샘플을 추가로 확장하여(따라서 유효 분리능을 개선시킴) 겔 네트워크 내로 유입시킨다. 최근까지 단일 ExM 프로토콜은 단일 확장 라운드에서 ~10배 확장할 수 있는 기계적으로 견고한 젤을 제공하면서 상업적으로 이용 가능한 단일 화학 앵커로 이 세 가지 생체 분자 클래스를 유지할 수 없었습니다.
여기에서는 메타크롤레인을 생체 분자 앵커로 사용하는 ExM 무기고에 최근 추가된 Magnify17을 소개합니다. 메타크롤레인은 파라포름알데히드와 같은 조직과 공유 결합을 형성하여 다양한 특정 또는 맞춤형 앵커링 에이전트 없이 여러 종류의 생체 분자를 겔 네트워크 내에 유지할 수 있도록 합니다. 또한 이 기술은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 임상 샘플과 같이 악명 높은 까다로운 샘플을 포함하여 광범위한 조직 스펙트럼을 최대 11배까지 확장할 수 있습니다. 이러한 기계적으로 단단한 샘플을 확장하기 위한 이전의 방법은 가혹한 프로테아제 분해가 필요했기 때문에 샘플이 확장된 후 관심 단백질의 항체 표지가 불가능했습니다. 대조적으로, 이 기술은 고온 변성 용액을 사용하여 FFPE 임상 샘플의 확장을 달성하여 겔 내에서 전체 단백질 에피토프를 보존하여 팽창 후 이미징을 목표로 할 수 있습니다(그림 1).
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Protocol
동물과 관련된 모든 실험 절차는 NIH(National Institutes of Health) 지침에 따라 수행되었으며 카네기 멜론 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 인간 조직 샘플을 상업적으로 입수하였다.
1. 원유 시약 및 용액의 준비
참고: 사용된 시약 목록은 재료 표를 참조하십시오.
- 겔화 원액을 준비합니다. 이들은 겔화 단계 직전에 결합됩니다.
- 단량체 원액(4g/100mL N,N-디메틸아크릴아미드산[DMAA], 50g/100mL 아크릴산나트륨[SA], 66.7g/100mL 아크릴아미드[AA], 0.10g/100mL N,N'-메틸렌비스아크릴아미드[Bis], 33g/100mL 염화나트륨[NaCl], 1x 인산염 완충 식염수; PBS)를 사용하여 표 1에 열거된 성분을 이용하였다. 모든 원액을 물에 녹이거나 희석하십시오. 단량체 원액은 4°C에서 최소 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 단량체가 조직으로 확산되는 동안 겔화를 억제하는 0.5%(w/w) 4-Hydroxy-TEMPO(4HT) 및 10%(w/w) 과황산암모늄(APS)에 의해 시작된 라디칼 생성을 가속화하고 10%(w/w)에서 제조되는 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED).
참고: 원액은 1-2mL 분취량으로 분배하고 4°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 그러나 APS는 겔화 용액을 준비하기 직전에 만들어집니다.
- SDS 1g, 요소 48.048g, EDTA 5mL(0.5M, pH 8), 10x PBS 20mL, Tris(2M) 25mL, 글리신 0.75g을 결합하여 균질화 완충액(1% w/v SDS, 8M 요소, 25mM EDTA, 2x PBS, pH 8, 실온[RT])을 준비합니다. 총 부피 100mL의 물을 추가합니다. 솔루션은 필요에 따라 확장 또는 축소할 수 있으며 R.T.에 저장할 수 있습니다.
2. 보관 및 새로 준비된 임상 조직 슬라이드를 위한 조직 준비
참고: 조직 전처리 단계는 표본 준비 방법에 따라 다릅니다.
- 포름알데히드 고정 파라핀 포매(FFPE) 임상 샘플의 경우 아래 단계를 따르십시오.
- 샘플을 일련의 순차적 용액(유리 슬라이드 염색 용기 또는 50mL 원뿔형 튜브를 사용할 수 있음)에 넣습니다: 크실렌, 95% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올, 이중 탈이온수. 각 용액을 매번 최소 3분 동안 두 번 사용하십시오. 집게를 사용하여 슬라이드를 용기에 넣고 각 용액 15mL를 추가합니다(샘플을 덮을 수 있을 만큼). 캡이 있는 원추형 튜브를 실온에서 셰이커에 수평으로 놓습니다.
- 영구 슬라이드에 염색되고 장착된 샘플의 경우 아래 단계를 따르십시오.
- 슬라이드를 자일렌에 잠깐 넣고 면도날과 같은 적절한 도구를 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 커버슬립이 계속 붙어 있으면 커버슬립이 느슨해질 때까지 자일렌 슬라이드를 실온으로 되돌립니다.
- 그런 다음 샘플을 FFPE 샘플로 처리합니다(단계 2.1.1).
참고: 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 슬라이드의 경우 헤마톡실린 및 에오신 염색은 팽창 과정에서 손실됩니다.
- 최적 절단 온도(OCT) 용액에 고정되지 않은 냉동 조직 슬라이드의 경우, 조직을 -20°C에서 10분 동안 아세톤에 고정한 후 실온에서 매번 10분 동안 1x PBS 용액으로 샘플을 3회 세척합니다.
- 미리 고정된 냉동된 임상조직 슬라이드의 경우, 상온에서 2분 동안 슬라이드를 배양하여 OCT를 녹인 후, 실온에서 매번 5분씩 1x PBS 용액으로 3회 세척한다.
3. 파라포름알데히드 고정 마우스 뇌를 위한 조직 준비
- 두께가 30-50μm인 마우스 뇌 섹션에 대해 이 프로토콜을 따르십시오.
참고: 더 큰 섹션에서 성공을 찾을 수 있지만 단량체 용액 확산 및 균질화에는 더 긴 시간이 필요할 수 있습니다. - 절편이 현재 1x PBS 용액에 저장되어 있지 않은 경우(예: 1x PBS의 30% [v/v] 글리세롤 및 30% [v/v] 에틸렌 글리콜 용액), 6-24웰 플레이트의 1x PBS로 실온에서 매번 최소 10분 동안 3회 세척합니다.
- 코팅되지 않은 유리 현미경 슬라이드를 얻습니다. 유리 슬라이드의 한 면이 코팅된 경우 젖은 페인트 브러시를 사용하여 코팅되지 않은 면을 확인합니다(종종 코팅된 면의 라벨은 분쇄 유리로 만들어지며 젖었을 때 덜 불투명해집니다).
- 페인트 브러시를 사용하여 코팅되지 않은 슬라이드를 적십니다. 페인트 브러시로 우물 판에서 마우스 뇌 조직을 제거하고 조직이 평평한지 확인하기 위해 롤링 동작을 사용하여 슬라이드에 조심스럽게 놓습니다. 모든 섹션이 장착될 때까지 과도한 PBS가 조직에 남아 있도록 합니다.
참고: 단일 유리 슬라이드를 여러 조직 절편에 사용할 수 있지만 한 번에 더 많은 조직 절편이 겔화되는 경우(별도의 슬라이드에서도) 완전히 건조되지 않도록 더 많은 주의를 기울여야 합니다. - 실험용 종이 천을 사용하여 슬라이드에서 초과 PBS의 대부분을 제거합니다. 각 조직 섹션 주위에 작은 액체 링을 남겨두고 나머지 슬라이드는 대부분 건조한 상태로 둡니다. 이 남은 액체는 겔 단량체 용액이 준비되는 동안 조직을 덮을 것입니다.
4. 겔화
참고: 이 프로토콜은 이 기술과 함께 사용하도록 준비된 모든 조직 유형에 적합합니다.
- 조직 압박을 방지하기 위해 조직 섹션(그림 2A)의 양쪽에 스페이서를 적용합니다. 이렇게 하려면 끝이 다이아몬드 펜으로 커버 유리 조각을 얇게 잘라 스페이서를 만든 다음 소량의 물 또는 1x PBS를 사용하여 슬라이드에 고정하거나 소량의 슈퍼 접착제를 사용하여 고정합니다. 그런 다음 스페이서를 티슈의 양쪽에 부드럽게 놓습니다.
- 최종 겔화 용액을 준비합니다. 일반적으로 조직 섹션당 ~200μL이면 충분하지만 부피는 슬라이드당 800μL를 초과해서는 안 됩니다. 더 이상 겔화 용액이 유출됩니다.
참고: 메타크롤레인은 생체 분자를 젤에 고정하는 데 사용됩니다. 그러나, 별도의 앵커링 단계가 필요하지 않으며, 메타크롤레인은 최종 겔화 용액에 직접 첨가될 수 있다.- 섹션별로 다음을 순서대로 결합하십시오. 단량체 용액 200μL, 0.5% 4HT 원액 0.5μL(1:400 희석), 메타크롤레인 0.2-0.5μL(조직 유형에 따라 1:400-1:1,000 희석, 일반적으로 파라포름알데히드[PFA] 고정 샘플의 경우 1:1,000 희석 사용, FFPE 임상 샘플의 경우 1:400 희석), 10% TEMED 원액 2μL(1:100 희석), 및 5 μL의 10 % APS 원액 (1:40 희석).
알림: 사용 직전에 최종 겔화 용액을 준비하십시오. 조기 겔화를 방지하려면 APS 솔루션을 마지막에 추가하십시오.
- 섹션별로 다음을 순서대로 결합하십시오. 단량체 용액 200μL, 0.5% 4HT 원액 0.5μL(1:400 희석), 메타크롤레인 0.2-0.5μL(조직 유형에 따라 1:400-1:1,000 희석, 일반적으로 파라포름알데히드[PFA] 고정 샘플의 경우 1:1,000 희석 사용, FFPE 임상 샘플의 경우 1:400 희석), 10% TEMED 원액 2μL(1:100 희석), 및 5 μL의 10 % APS 원액 (1:40 희석).
- 조직 섹션에서 과잉 용액을 제거하고 슬라이드를 페트리 접시에 놓습니다. 갓 제조된 모든 저온 겔화 용액을 샘플에 첨가하고, 조직 내로 확산될 수 있도록 4°C에서 30분 동안 조직 상에서 혼합물을 배양한다.
- 코팅되지 않은 두 번째 유리 슬라이드를 티슈와 젤 용액 위에 조심스럽게 놓습니다. 기포는 피해야 합니다(그림 2B).
알림: 기포가 티슈에 갇히면 유리 뚜껑을 조심스럽게 들어 올려 다시 내려놓을 수 있습니다. 또한, 유출되는 단량체 용액은 중합 후 제거될 수 있으며 조직에 문제를 일으키지 않습니다. - 중합이 완료되었는지 확인하십시오. 이 중합은 두 가지 방법으로 수행될 수 있으며, 각각 유사한 결과를 생성합니다. 먼저, 37°C에서 하룻밤 동안 가습 환경(예: 젖은 종이 타월로 닫힌 페트리 접시)에서 샘플을 배양합니다. 또는 보다 빠른 중합을 위해 가습 대기에서 샘플을 37°C에서 2시간 동안 배양한 다음 60°C에서 1시간 동안 배양합니다.
5. 시료 분해 및 조직 확장
참고: 이 프로토콜은 모든 조직 유형에 적합합니다.
- 보안경을 착용하고 겔화 챔버의 두 유리 슬라이드 사이에 면도날을 밀어 분리합니다.
알림: 유리 슬라이드는 매우 쉽게 분리되어야 합니다. 젤의 다른 부분이 두 슬라이드에 붙어 있는 경우 페인트 브러시를 사용하여 젤을 둘 중 하나로 안내할 수 있습니다. 겔이 중합 중에 특히 건조해지면 1x PBS를 겔 챔버 외부에 도포할 수 있지만 조직이 균질화되기 전에 겔이 팽창하여 균열이 발생하므로 겔을 완전히 담그지 마십시오. - 부피를 최소화하기 위해 조직 주위에 빈 젤을 다듬습니다. 겔을 비대칭으로 절단하면 샘플이 완전히 투명해지기 때문에 균질화 후 겔의 방향을 추적할 수 있습니다.
- 면도날로 슬라이드에서 조직 함유 젤을 부드럽게 들어 올리고 페인트 브러시로 2mL 원심분리기 튜브에 부드럽게 옮깁니다.
- 튜브를 80°C로 예열된 균질화 완충액(표 2)으로 상부에 채운다.
- 샘플을 80°C에서 8시간(PFA-고정된 마우스 뇌의 경우) 또는 60시간(대부분의 FFPE 임상 샘플; 표 3 참조) 동안 진탕하면서 인큐베이션합니다.
참고: 균질화 시간은 조직 유형 및 고정 방법에 따라 다릅니다. 이러한 조건 중 상당수는 이미 검증되었지만 다른 조건의 경우 최적화가 필요할 수 있습니다. - 원심분리기 튜브의 내용물을 6웰 플라스틱 세포 배양 플레이트의 단일 웰에 붓습니다.
- 이송 피펫으로 변성 완충액을 제거합니다.
- 하이드로겔로부터 잔존하는 SDS를 완전히 제거하기 위해, 샘플을 다음과 같이 1% 비이온성 계면활성제(C12E10) 용액으로 세척한다: 실온에서 매회10분 동안 적어도 3회; 60°C에서 60분 동안; 그런 다음 실온에서 매번 10 분 동안 3 번 더 씻습니다.
- 팽창 후 염색 및 이미징을 수행해야 할 때까지 4°C에서 1x PBS + 0.02% 아지드화나트륨에 샘플을 저장합니다.
참고: 이 시점에서 샘플은 조직 유형에 따라 각 치수에서 ~3-4.5배 더 커야 합니다.
6. 팽창 후 생체 분자 프로파일링
- 항체 염색
참고: 이는 일반적인 면역형광(IF)/면역조직화학(I.H.C.) 염색 프로토콜을 따릅니다. 사용되는 1차 및 2차 항체의 양은 제조업체가 제안한 농도 또는 특정 실험에 대한 최적화에 따라 다릅니다. 개별 버퍼는 사용자의 재량에 따라 대체될 수 있습니다.- 샘플을 6-웰 세포 배양 플레이트의 단일 웰에 넣고, 팽창된 샘플을 R.T.에서 1x PBS로 매번 10분 동안 3회 세척하고, 액체를 피펫으로 옮겼다.
- 선택적 차단 단계(예: 1x PBS에서 3% 소 혈청 알부민/0.1% Triton-X100)를 실온에서 최소 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 수행합니다.
- 37°C에서 하룻밤 동안 염색 완충액(예: 0.1% Triton-X100 1x PBS 또는 9x PBS/1% TritonX/10mg/L 헤파린)에서 1차 항체와 함께 배양합니다. 샘플 크기에 따라 0.5-2mL가 젤을 적절하게 덮어야 합니다.
- 샘플을 실온에서 1x PBS로 매번 최소 10분 동안 세 번 세척합니다.
- 상응하는 2차 항체를 선택의 염색 완충액에서 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
- 샘플을 실온에서 1x PBS로 매번 최소 10분 동안 세 번 세척합니다.
- NHS-ester pan-protein 염색
- 6웰 플레이트에 샘플을 넣고 1-2mL의 폴리에틸렌 글리콜(PEG 200)을 샘플에 붓습니다(완전히 덮을 수 있을 정도로).
알림: 조직은 수축되어 원래의 확장 전 크기(또는 그에 가까움)로 돌아가야 합니다. - 1-2mL의 염색 완충액(예: 1x PBS, 2x SSC 또는 100mM 중탄산나트륨 용액)에서 RT에서 3시간 동안 13.3-80μg/mL로 희석된 형광단 결합 NHS-에스테르가 있는 염색.
- 샘플을 실온에서 1x PBS로 매번 최소 10분 동안 세 번 세척합니다.
- 6웰 플레이트에 샘플을 넣고 1-2mL의 폴리에틸렌 글리콜(PEG 200)을 샘플에 붓습니다(완전히 덮을 수 있을 정도로).
- 지질 염색
참고: 팽창 후 지질 염색은 FFPE 임상 샘플에 효과적이지 않습니다.amp고정 과정에서 지질이 손실되기 때문입니다.- 샘플을 실온에서 1x PBS로 매번 최소 10분 동안 세 번 세척합니다.
- 실온에서 72-96시간 동안 0.1% TritonX-100/1x PBS 2mL에 200배 희석된 기존의 친유성 염료(DiO, DiI 또는 DiD)를 적용합니다.
- 1x PBS로 최소 3회 세척
- 형광 제자리 혼성화(FISH)
- 균질화된 겔 샘플을 30분 동안 60°C로 예열된 혼성화 완충액에 넣습니다.
- FISH에 대한 하이브리드화 완충액 준비: 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM 구연산 나트륨, pH 7.0), 10% (v/v) 덱스트란 설페이트, 20% (v/v) 에틸렌 카보네이트 및 0.1% (v/v) Tween20.
- 45°C에서 하룻밤 동안 표적 유전자(10kb당 최소 20개의 프로브)에 대해 10pM(올리고당)의 FISH 프로브를 함유하는 하이브리드화 완충액으로 겔 샘플을 인큐베이션합니다.
- 엄격한 세척 완충액(2x S.S.C. 및 0.1% Tween20)으로 45°C에서 매번 15분 동안 두 번 세척합니다.
- 엄격성 세척 완충액으로 37°C에서 매번 10분 동안 2회 더 세척한다.
- 마지막으로, 실온에서 1x PBS로 매회 10분 동안 최소 3회 세척한다.
- 샘플은 4°C에서 1x PBS + 0.02% 아지드화나트륨에 이미징 또는 보관할 준비가 되어 있습니다.
- 전체 조직 확장 및 형광 이미징
참고: Magnify로 얻을 수 있는 확장 계수는 조직 유형 및 확장 방법에 따라 다릅니다(전체 요약은 표 3에서 찾을 수 있음). 그러나 일반적인 추정치로 확대 샘플은 1x PBS에서 3-4.5배, ddH2O에서 1:50으로 희석된 PBS에서 5-7배, ddH2O에서 8-11배 확장됩니다. 이미징을 위한 최적의 팽창 계수는 각 실험의 요구 사항에 따라 다릅니다. 팽창 계수는 고도로 조정 가능하므로 다양한 스케일의 이미징을 위해 단일 샘플을 여러 번 확장 및 축소할 수 있습니다.- PBS에서 4배 팽창된 샘플을 페인트브러시를 사용하여 유리 바닥 6웰 이미징 플레이트로 옮깁니다. 더 작은 조각으로 자르거나 얇은 유연한 플라스틱 조각으로 큰 유리 바닥 이미징 플레이트에 부드럽게 넣어 더 확장된 샘플을 이동합니다.
- 기존의 광시야 현미경, 컨포칼 현미경 또는 선택한 다른 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다. 종이 실험실 천으로 젤 주변의 과도한 액체를 제거하면 이미징 중 젤 이동을 방지할 수 있습니다. 겔은 또한 이미징 전에 유리 표면에 0.1% 폴리-L-라이신을 적용하여 고정화할 수 있습니다.
참고: 폴리-L-라이신을 바르면 접촉 시 젤이 완전히 움직이지 않게 됩니다. 이러한 이유로 젤이 접히거나 늘어나지 않고 유리에 도포되도록주의해야합니다. 또한 폴리-L-라이신으로 코팅된 유리에서 젤을 완전히 건조시키면 제거가 어려울 수 있으며, 폴리-L-라이신으로 유리에 부착되어 있는 동안 PBS에서 젤을 수축해서는 안 됩니다., 이는 젤 또는 조직 손상을 일으킬 수 있기 때문입니다. - 이미징 후, 형광 신호의 분해로 인해ddH2O에 샘플을 장기간 보관하는 것은 권장되지 않으므로 매번 10분 동안 최소 3회 세척하여 1x PBS에서 샘플을 축소합니다. 특히, 친유성 염료로 염색된 완전 팽창 샘플은 물에서 염료가 해리되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 팽창 시점에 가깝게 이미지화해야 합니다.
- 샘플을 4°C에서 1x PBS + 0.02% 아지드화나트륨에 보관합니다.
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Representative Results
프로토콜이 성공적으로 완료되면(그림 1) sample은 열 변성 후 투명하고 평평하게 나타납니다. 접히거나 구겨지는 것은 불완전한 균질화를 나타냅니다. 성공적으로 확장된 샘플은 1x PBS에서 확장 전보다 3-4.5배 더 커지고 ddH2O에서 완전히 확장될 때 8-11배 더 커집니다. 그림 3은 이 프로토콜을 사용하여 처리되고 8배 이상 성공적으로 확장된 5μm 두께의 FFPE 인간 신장 샘플의 확장 전 및 확장 후 이미지의 예를 보여줍니다. 핵 DNA를 시각화하기 위해 먼저 DAPI와 함께 ACTN4에 대한 항체로 조직을 염색했습니다. 그런 다음 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 표본을 이미지화했습니다(그림 3A). 조직은 동일한 표적의 확장 후 염색을 포함하고, 재이미징 전에 물에서 완전히 확장(도 3B)을 포함하는 상기 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 열 변성 후, 단백질 이외의 생체 분자도 그림 4와 같이 염색되고 이미지화될 수 있습니다. 친유성 염료를 적용하여 마우스 뇌의 세포와 미토콘드리아 막 구조를 밝힐 수 있습니다(그림 4A). 추가적으로, 핵산은 도 4B,C에 도시된 FFPE 정상 인간 림프절 조직에서와 같이, FISH를 통해 이미지화될 수 있다.
그림 5는 샘플이 적절하게 균질화되지 않은 경우 발생할 수 있는 결과를 보여줍니다. 확장 후, 조직은 ACTN4 및 vimentin에 대한 항체와 DAPI와 함께 핵 DNA를 시각화하고 밀 배아 응집소 (WGA)를 시각화하여 탄수화물을 표시했습니다. 조직은 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징하기 전에 PBS에서 3.5배 확장되었습니다. 한 신장 부분(그림 5A,C)에서 사구체의 균열 없는 확장을 볼 수 있습니다. 별도의 섹션(그림 5B,D)에서 조직에서 균열을 명확하게 볼 수 있습니다.
그림 1: 확대 워크플로의 개략도. 임상적으로 보관된 조직 슬라이드의 전처리는 먼저 저장 형식을 기반으로 수행됩니다. 자유 부동 파라포름알데히드 고정 섹션은 PBS에서만 세척하면 됩니다. 그런 다음 샘플을 메타크롤레인을 포함한 겔 단량체 용액에서 배양하여 생체 분자를 하이드로겔에 고정합니다. In situ 중합은 요소, SDS 및 EDTA를 사용한 열 변성 전에 수행됩니다. 그런 다음 샘플을 철저히 세척하고 기존의 면역염색 프로토콜, FISH 프로토콜 또는 친유성 염료를 사용하여 염색합니다. 그런 다음 샘플을 이미징하기 전에 순수한 물에서 확장합니다. 이 수치는 Klimas et al.17에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 조직 샘플 겔화 챔버 . (A) 조직의 각 측면에, 두 개의 스페이서, 예를 들어 두 개의 #1.0 커버 유리를 겔 모노머 용액이 4°C에서 확산되기 전에 배치한다. 압박을 방지하려면 스페이서가 조직 조각보다 두꺼워야 합니다. (B) 제 2 유리 슬라이드와 같은 뚜껑은 37 °C에서 중합 전에 샘플을 덮는 데 사용됩니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 인간 신장 조직 절편의 확장 전 이미지 예. (A) 60x 배율(1.4 NA)에서 촬영한 이미지와 (B) 40x 배율(1.15 NA, 확장 계수: 8.15x)로 촬영한 확대 후 동일한 시야의 이미지와 비교한 이미지. 마젠타, DAPI; 옐로우, ACTN4. 확장 후 이미지의 최대 강도는 25프레임에 걸쳐 투사됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Magnify를 사용한 대체 생체 분자 염색 전략 . (A) (i 및 iv) 완전히 확장된 마우스 뇌 조직의 NHS-에스테르 범 단백질 표지. (ii 및 v) 동일한 마우스 뇌 조직의 친유성 염료(DiD) 라벨링. (iii 및 vi) 채널이 병합되었습니다. (B) FFPE 정상 인간 림프절 조직을 사용하여 확대하는 DNA FISH. 확장 계수: 1x PBS에서 3.5배. 화이트, DAPI; 마젠타, 세린/트레오닌 키나아제 1 유전자; 청색, APC/C 활성제 단백질 CDH1 유전자; 노란색, 인간 위성 시퀀스 S4. (C) B와 관련된 개별 채널. 모든 이미지는 40x 배율(1.15 NA)에서 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 얻었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 5μm 두께의 FFPE 신장 샘플의 대표적인 결과. (A) 균열 없는 확장. 화이트, DAPI; 옐로우, 비멘틴; 시안, 알파-액티닌 4; 마젠타, 밀 배아 응집소. (B) 균열을 나타내는 확장된 신장 섹션. 균열, 왜곡 및 라벨링된 타겟의 손실은 부적절한 앵커링 및/또는 균질화의 결과일 수 있습니다. (씨, 디) 각각 A와 B에 있는 박스 영역의 확대 이미지입니다. 모든 이미지는 10x(A,B; 0.45 NA) 또는 60x(C,D; 1.2 NA) 배율에서 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 얻었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 겔 단량체 용액 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 균질화 완충액 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 검증된 조직에 대한 메타크롤레인 및 균질화 조건 요약. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 단일 화학 앵커로 여러 생체 분자를 유지하고 열 변성으로 까다로운 FFPE 임상 표본을 최대 11배까지 확장할 수 있는 ExM 변이체인 Magnify 프로토콜17을 제시합니다. 다른 ExM 프로토콜과 구별되는 이 프로토콜의 주요 변경 사항에는 완전히 확장된 경우에도 기계적으로 견고하게 유지되는 재구성된 젤의 사용과 생체 분자 앵커로 메타크롤레인의 사용이 포함됩니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 최종 겔 용액의 조성; 2) 겔화 단계의 타이밍; 3) 겔화 챔버의 설정; 4) 시료 균질화를 위한 파라미터; 및 5) 팽창 후 염색 전에 샘플로부터 SDS의 충분한 세척.
이 프로토콜의 가장 중요한 파라미터는 최종 겔화 용액의 조성, 특히 생체분자 앵커 메타크롤레인의 농도입니다. 서로 다른 조직 유형을 확장하기 위해서는 서로 다른 메타크롤레인 농도가 필요하며(표 3), 이 값이 확장될 샘플과 잘 일치하도록 주의를 기울여야 합니다. 메타크롤레인을 과도하게 고정하면 팽창 계수가 감소하고 확장 후 염색에 사용할 수 있는 에피토프가 손실될 수 있는 반면, 특히 FFPE 임상 샘플에서 언더앵커링은 조직 균열 또는 왜곡을 초래할 수 있습니다. 따라서 메타크롤레인 농도는 검증되지 않은 조직 유형에 대해 최적화되어야 하지만 최적의 농도는 여기에 제시된 범위 근처 또는 범위 내에 있을 수 있습니다. 이 프로토콜은 아직 검증되지 않은 조직 유형을 포함하여 대부분의 조직 유형에서 작동할 것으로 예상하지만 뼈가 포함된 샘플에는 작동하지 않는 것으로 알려져 있습니다.
메타크롤레인 외에도 중요한 겔 성분(4HT 또는 TEMED)의 잘못된 농도를 사용하면 불완전하거나 겔화가 없는 경우(과도한 4HT) 또는 조기 겔화(과도한 TEMED, 4HT 감소 또는 다른 구성 요소 앞에 APS 추가)로 인해 실험이 완전히 실패할 수 있습니다. 조기 겔화를 방지하기 위해 샘플과 겔을 4°C에서 유지하고 30분 동안 공기에 노출시키고 확산 과정이 완료된 후 샘플만 덮고 37°C에서 가습 챔버에 넣어야 합니다.
코팅되지 않은 두 개의 유리 슬라이드 사이에 스페이서를 포함하여 겔 챔버를 구성할 때, 특히 PFA 고정 마우스 뇌와 같은 두꺼운 조직 절편의 경우 매우 중요합니다. 스페이서가 부족하면 조직 압박이 발생하여 이미지가 왜곡되고 데이터가 부정확해질 수 있습니다.
시료 균질화는 분해 완충액의 분해 시간, 분해 완충액의 온도 및 조성에 따라 달라집니다. 부적절한 균질화는 왜곡을 일으키고 주어진 조직 유형에 대해 보고된 값과 비교하여 확장 인자를 감소시킬 수 있습니다. 불완전한 균질화가 의심되는 경우, 특히 두꺼운 조직의 경우 소화 시간이 증가할 수 있습니다.
간단하면서도 중요한 단계는 균질화 단계 후 비이온성 계면활성제(예:C12E10)를 사용하여 샘플에서 SDS를 적절하게 세척하는 것입니다. 남은 SDS는 차선책이거나 완전히 방해받는 항체 결합을 초래할 수 있습니다. 다행스럽게도 이것이 의심되는 경우 추가 세척 및 항체 재적용이 종종 만족스러운 해결책이 될 것입니다.
이 프로토콜은 FFPE 임상 표본을 포함한 다양한 조직 샘플에서 나노 스케일 구조를 조사하기 위해 현재의 초고해상도 이미징 및 전자 현미경 기술에 대한 비용 효율적인 대안을 제공합니다. 메타크롤레인과 열 변성의 사용은 조직 고정 중에 보존되는 모든 생체 분자의 확장 후 프로파일링을 허용합니다(예를 들어, 이는 FFPE 샘플에서 지질의 이미징을 배제합니다). ExM 프레임워크의 확장인 당사의 프로토콜은 모듈식이며 광학 초해상도 방법(STED18, STORM 19) 또는 반복 확장 현미경(iExM)15과 같은 다른 기술과 호환될 수 있습니다. 그러나 이들은 아직 제시된 프로토콜로 테스트되지 않았으며 큰 팽창 인자는 특히 형광단 희석과 관련하여 문제를 일으킬 수 있습니다. 또한, 물에서 완전히 팽창한 후 샘플의 크기가 크기 때문에 취급 시 주의가 필요하며(여기에 사용된 겔은 10배 견고 팽창 현미경(TREx)과 같은 이전의 고팽창 인자 ExM 겔 제형보다 더 탄력적이지만, 취급 불량17), 이러한 완전히 확장된 겔을 전사하고 이미지화하기 위해 창의적인 솔루션이 때때로 필요합니다. 예를 들어, 페인트 브러시가 아닌 완전히 확장된 젤을 전사하기 위해 얇은 플라스틱 시트와 같은 넓은 기반 도구를 사용하거나 맞춤형 대형 이미징 플레이트를 사용합니다(우리 손에는 #1.5 커버글라스의 큰 조각이 바닥에 부착된 레이저 절단 또는 3D 프린팅 플레이트를 의미합니다. 이는 함께 제공되는 비디오에서 볼 수 있습니다). 가장 중요한 것은 이 방법이 기존의 광시야 또는 컨포칼 현미경에서 일반적인 생물학적 및 병리학적 샘플 준비의 나노스케일 이미징을 허용함으로써 나노스케일 이미징의 적용 가능성을 넓힌다는 것입니다.
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Disclosures
저자는 다음과 같은 경쟁적인 재정적 이익을 선언합니다: Y.Z., A.K., Z.C. 및 B.R.G.는 Magnify 및 ExM과 관련된 여러 발명품을 발명했습니다.
Acknowledgments
이 작업은 카네기 멜론 대학 (Carnegie Mellon University)과 DSF 자선 재단 (YZ 및 XR), 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01 및 Kauffman Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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