Summary
يظهر هنا إصدار جديد من الفحص المجهري التوسعي (ExM) ، Magnify ، والذي تم تعديله لتوسع يصل إلى 11 ضعفا ، مع الحفاظ على مجموعة شاملة من فئات الجزيئات الحيوية ، وهو متوافق مع مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. إنه يتيح استجواب التكوين النانوي للجزيئات الحيوية باستخدام المجاهر التقليدية المحدودة الحيود.
Abstract
يمكن للتصوير النانوي للعينات البيولوجية تحسين فهم التسبب في المرض. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن الفحص المجهري التوسعي (ExM) بديل فعال ومنخفض التكلفة للفحص المجهري البصري فائق الدقة. ومع ذلك ، فقد تم تقييده بسبب الحاجة إلى عوامل تثبيت محددة وغالبا ما تكون مخصصة للاحتفاظ بفئات مختلفة من الجزيئات الحيوية داخل الجل وبسبب الصعوبات في توسيع تنسيقات العينات السريرية القياسية ، مثل الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين ، خاصة إذا كانت عوامل التمدد الأكبر أو حوامل البروتين المحفوظة مطلوبة. هنا ، نصف Magnify ، وهي طريقة ExM جديدة للتوسع القوي حتى 11 ضعفا في مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. باستخدام الميثاكرولين كمرساة كيميائية بين الأنسجة والهلام ، يحتفظ Magnify بجزيئات حيوية متعددة ، مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية ، داخل الهلام ، مما يسمح بالتصوير النانوي الواسع للأنسجة على المجاهر الضوئية التقليدية. يصف هذا البروتوكول أفضل الممارسات لضمان تمدد الأنسجة القوي والخالي من التشققات ، بالإضافة إلى نصائح للتعامل مع المواد الهلامية الموسعة للغاية وتصويرها.
Introduction
تظهر الأنظمة البيولوجية عدم تجانس هيكلي ، من الأطراف والأعضاء وصولا إلى مستويات البروتينات على المستوى النانوي. لذلك ، يتطلب الفهم الكامل لتشغيل هذه الأنظمة فحصا بصريا عبر مقاييس الحجم هذه. ومع ذلك ، فإن حد حيود الضوء يسبب تحديات في تصور الهياكل الأصغر من ~ 200-300 نانومتر على مجهر مضان تقليدي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الطرق البصرية فائقة الدقة1،2،3 ، مثل استنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، والمجهر التعريبي المنشط بالصور (PALM) ، ومجهر إعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، والمجهر الضوئي للإضاءة الهيكلية (SIM) ، على الرغم من قوتها ، تمثل تحدياتها الخاصة ، لأنها تتطلب أجهزة وكواشف باهظة الثمن وغالبا ما يكون لها أوقات اكتساب بطيئة وقدرة ضعيفة على تصوير كميات كبيرة في 3D.
يوفر الفحص المجهري التوسعي4 (ExM) وسيلة بديلة للتحايل على حد حيود الضوء عن طريق تثبيت الجزيئات الحيوية تساهميا في هلام بوليمر قابل للانتفاخ بالماء وسحبها جسديا ، مما يجعلها قابلة للحل على المجاهر الضوئية التقليدية. تم تطوير العديد من متغيرات بروتوكول ExM منذ النشر الأصلي ل ExM قبل أقل من عقد من الزمان ، وتسمح هذه البروتوكولات بالدمج المباشر للبروتينات5،6،7 أو RNA8،9،10 أو الدهون11،12،13 في شبكة الهلام عن طريق تغيير المرساة الكيميائية أو توسيع العينة بشكل أكبر (وبالتالي تحسين الدقة الفعالة) إما في خطوة واحدة14 أو خطوات تكرارية متعددة15,16. حتى وقت قريب ، لا يمكن لأي بروتوكول ExM واحد الاحتفاظ بهذه الفئات الثلاث من الجزيئات الحيوية مع مرساة كيميائية واحدة متاحة تجاريا مع توفير هلام قوي ميكانيكيا يمكن أن يتوسع ~ 10 أضعاف في جولة توسع واحدة.
هنا ، نقدم Magnify17 ، وهي إضافة حديثة إلى ترسانة ExM التي تستخدم الميثاكرولين كمرساة للجزيء الحيوي. يشكل الميثاكرولين روابط تساهمية مع أنسجة مثل تلك الموجودة في بارافورمالدهيد ، مما يضمن إمكانية الاحتفاظ بفئات متعددة من الجزيئات الحيوية داخل شبكة الهلام دون الحاجة إلى عوامل تثبيت محددة أو مخصصة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية توسيع نطاق واسع من الأنسجة حتى 11 ضعفا ، بما في ذلك العينات الصعبة المعروفة مثل العينات السريرية المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE). تطلبت الطرق السابقة لتوسيع مثل هذه العينات الصلبة ميكانيكيا هضم البروتياز القاسي ، مما يجعل وضع علامات على الأجسام المضادة للبروتينات ذات الأهمية مستحيلا بعد توسيع العينة. في المقابل ، تحقق هذه التقنية توسيع العينات السريرية FFPE باستخدام محلول تغيير الطبيعة الساخن ، وبالتالي الحفاظ على حوائط البروتين الكاملة داخل الجل ، والتي يمكن استهدافها للتصوير بعد التمدد (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة كارنيجي ميلون. تم الحصول على عينات الأنسجة البشرية تجاريا.
1. إعداد كواشف المخزون والمحاليل
ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على قائمة بالكواشف المستخدمة.
- تحضير حلول مخزون التبلور. سيتم الجمع بين هذه مباشرة قبل خطوة التبلور.
- تحضير محلول مخزون المونومر (4 جم / 100 مل N ، N- حمض ثنائي ميثيل أكريلاميد [DMAA] ، 50 جم / 100 مل أكريلات الصوديوم [SA] ، 66.7 جم / 100 مل أكريلاميد [AA] ، 0.10 جم / 100 مل N ، N′-ميثيلين بيساكريلاميد [مكرر] ، 33 جم / 100 مل كلوريد الصوديوم [NaCl] ، 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ PBS) باستخدام المكونات المدرجة في الجدول 1. حل أو تمييع جميع حلول الأسهم في الماء. يمكن تخزين محلول مخزون المونومر عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر على الأقل.
- اصنع محاليل المخزون التالية بشكل منفصل في الماء: 0.5٪ (وزن / وزن) 4-هيدروكسي-تيمبو (4HT) ، الذي يمنع الهلام أثناء انتشار المونومر في الأنسجة ، و 10٪ (وزن / وزن) رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) ، مما يسرع الجيل الجذري الذي بدأه بيرسلفات الأمونيوم (APS) ويتم تحضيره بنسبة 10٪ (وزن / وزن).
ملاحظة: يمكن توزيع محاليل المخزون في 1-2 مل من القسامات وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر ؛ ومع ذلك، APS يتم مباشرة قبل تحضير محلول التبلور.
- قم بإعداد المخزن المؤقت للتجانس (1٪ وزن / وزن SDS ، 8 ميجا يوريا ، 25 مللي متر EDTA ، 2x PBS ، درجة الحموضة 8 ، في درجة حرارة الغرفة [RT]) عن طريق الجمع بين 1 جم من SDS ، 48.048 جم من اليوريا ، 5 مل من EDTA (0.5 م ، درجة الحموضة 8) ، 20 مل من 10x PBS ، 25 مل من Tris (2 M) ، و 0.75 جم من الجلايسين. أضف الماء لحجم كلي قدره 100 مل. يمكن توسيع نطاق الحل أو تقليله حسب الحاجة ويمكن تخزينه في R.T.
2. تحضير الأنسجة لشرائح الأنسجة السريرية المؤرشفة والمحضرة حديثا
ملاحظة: تختلف خطوات المعالجة المسبقة للأنسجة بناء على كيفية تحضير العينات.
- بالنسبة للعينات السريرية المضمنة بالبارافين المثبت بالفورمالديهايد (FFPE) ، اتبع الخطوات أدناه.
- ضع العينات في سلسلة متسلسلة من المحاليل (يمكن استخدام جرة تلطيخ منزلقة زجاجية أو أنبوب مخروطي سعة 50 مل): زيلين ، 95٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، و 50٪ إيثانول ، متبوعا بماء مضاعف منزوع الأيونات. استخدم كل محلول مرتين لمدة 3 دقائق على الأقل في كل مرة. استخدم ملقط لوضع الشريحة في الحاوية ، وأضف 15 مل من المحلول المعني (يكفي لتغطية العينة). ضع الأنبوب المخروطي المغطى أفقيا على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
- بالنسبة للعينات الملطخة والمثبتة على شرائح دائمة ، اتبع الخطوات أدناه.
- ضع الشريحة لفترة وجيزة في الزيلين ، وقم بإزالة أغطية الغطاء بعناية باستخدام أداة مناسبة ، مثل شفرة الحلاقة. إذا ظل غطاء الغطاء عالقا ، فأعد الشرائح الموجودة في الزيلين إلى درجة حرارة الغرفة حتى ترتخي شريحة الغطاء.
- بعد ذلك، قم بمعالجة العينات كعينات FFPE (الخطوة 2.1.1).
ملاحظة: بالنسبة للشرائح الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) ، يتم فقد صبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين أثناء عملية التمدد.
- بالنسبة لشرائح الأنسجة المجمدة غير الثابتة في محلول درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، ثبت الأنسجة في الأسيتون عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل غسل العينات بمحلول 1x PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
- بالنسبة لشرائح الأنسجة السريرية المجمدة التي تم إصلاحها مسبقا ، قم بإذابة OCT عن طريق احتضان الشرائح لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسلها بمحلول 1x PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
3. تحضير الأنسجة لدماغ الفأر الثابت بارافورمالدهايد
- اتبع هذا البروتوكول لأقسام دماغ الفأر التي يبلغ سمكها 30-50 ميكرومتر.
ملاحظة: يمكن العثور على النجاح مع أقسام أكبر ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى أوقات أطول لنشر محلول المونومر والتجانس. - إذا لم يتم تخزين الأقسام حاليا في محلول 1x PBS (على سبيل المثال ، في 30٪ [v / v] جلسرين و 30٪ [v / v] محلول جلايكول الإيثيلين في 1x PBS) ، اغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في درجة حرارة الغرفة في 1x PBS في لوحة من 6 إلى 24 بئرا.
- احصل على شريحة مجهرية زجاجية غير مطلية. إذا كان جانب واحد من الشريحة الزجاجية مطليا ، فاستخدم فرشاة طلاء مبللة للتحقق من الجانب غير المطلي (غالبا ما يكون ملصق الجانب المطلي مصنوعا من الزجاج الأرضي وسيصبح أقل عتامة عند البلل).
- استخدم فرشاة الرسم لتبليل الشريحة غير المطلية. قم بإزالة أنسجة دماغ الفأر من لوحة البئر باستخدام فرشاة الرسم ، وضعها بعناية على الشريحة ، باستخدام حركة متدحرجة للتأكد من أن الأنسجة مسطحة. اسمح ل PBS الزائد بالبقاء على الأنسجة حتى يتم تركيب جميع الأقسام.
ملاحظة: بينما يمكن استخدام شريحة زجاجية واحدة لأقسام الأنسجة المتعددة ، عندما يتم تبلور المزيد من أقسام الأنسجة في وقت واحد (حتى على شرائح منفصلة) ، يجب توخي المزيد من الحذر لضمان عدم جفافها تماما. - باستخدام قطعة قماش ورقية معملية ، قم بإزالة غالبية PBS الزائدة من الشريحة. اترك حلقة سائلة صغيرة حول كل قسم من الأنسجة ، لكن اترك بقية الشريحة جافة في الغالب. سيغطي هذا السائل المتبقي الأنسجة أثناء تحضير محلول مونومر الهلام.
4. التبلور
ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب لجميع أنواع الأنسجة المعدة للاستخدام مع هذه التقنية.
- ضع فواصل على جانبي قسم الأنسجة (الشكل 2 أ) لمنع ضغط الأنسجة. للقيام بذلك ، اصنع الفواصل عن طريق قطع رقيقة من زجاج الغطاء باستخدام قلم ذو رأس ماسي ، ثم قم بتثبيتها على الشريحة باستخدام كميات صغيرة من الماء أو 1x PBS ، أو قم بتثبيتها باستخدام كمية صغيرة من الغراء الفائق. بعد ذلك ، ضع الفواصل برفق على جانبي المنديل.
- تحضير حل التبلور النهائي. بشكل عام ، ~ 200 ميكرولتر كافية لكل قسم من الأنسجة ، ولكن يجب ألا يتجاوز الحجم 800 ميكرولتر لكل شريحة. أي محلول تبلور آخر سيؤدي إلى امتداد.
ملاحظة: يستخدم الميثاكرولين لتثبيت الجزيئات الحيوية في الجل. ومع ذلك ، لا يلزم وجود خطوة تثبيت منفصلة ، ويمكن إضافة الميثاكرولين مباشرة إلى محلول التبلور النهائي.- لكل قسم ، اجمع ما يلي بالترتيب: 200 ميكرولتر من محلول المونومر ، 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون 4HT 0.5٪ (1: 400 تخفيف) ، 0.2-0.5 ميكرولتر من الميثاكرولين (1: 400-1: 1000 تخفيف حسب نوع الأنسجة ؛ بشكل عام ، استخدم تخفيف 1: 1000 للعينات الثابتة بارافورمالدهايد [PFA] و 1: 400 للعينات السريرية FFPE) ، 2 ميكرولتر من محلول مخزون TEMED بنسبة 10٪ (تخفيف 1: 100) ، و 5 ميكرولتر من محلول مخزون APS بنسبة 10٪ (تخفيف 1:40).
ملاحظة: تحضير محلول التبلور النهائي مباشرة قبل الاستخدام. لمنع التبلور المبكر ، أضف APS الحل أخيرا.
- لكل قسم ، اجمع ما يلي بالترتيب: 200 ميكرولتر من محلول المونومر ، 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون 4HT 0.5٪ (1: 400 تخفيف) ، 0.2-0.5 ميكرولتر من الميثاكرولين (1: 400-1: 1000 تخفيف حسب نوع الأنسجة ؛ بشكل عام ، استخدم تخفيف 1: 1000 للعينات الثابتة بارافورمالدهايد [PFA] و 1: 400 للعينات السريرية FFPE) ، 2 ميكرولتر من محلول مخزون TEMED بنسبة 10٪ (تخفيف 1: 100) ، و 5 ميكرولتر من محلول مخزون APS بنسبة 10٪ (تخفيف 1:40).
- قم بإزالة المحلول الزائد من قسم الأنسجة ، وضع الشريحة في طبق بتري. أضف كل محلول التبلور البارد المحضر حديثا إلى العينة، واحتضن الخليط على المنديل لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية للسماح بالانتشار في الأنسجة.
- ضع شريحة زجاجية ثانية غير مطلية بعناية فوق محلول الأنسجة والهلام. يجب تجنب فقاعات الهواء (الشكل 2 ب).
ملاحظة: إذا أصبحت فقاعات الهواء محاصرة فوق المنديل ، فقد يتم رفع الغطاء الزجاجي بعناية ووضعه مرة أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم قطع أي محلول مونومر ينسكب بعد البلمرة ولن يسبب أي مشاكل للأنسجة. - تأكد من اكتمال البلمرة. يمكن إجراء هذه البلمرة بطريقتين ، ينتج عن كل منهما نتائج مماثلة. أولا ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة (مثل طبق بتري مغلق بمنشفة ورقية مبللة) طوال الليل. بدلا من ذلك ، لمزيد من البلمرة السريعة ، احتضان العينات في الغلاف الجوي المرطب لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية تليها 1 ساعة عند 60 درجة مئوية.
5. عينة الهضم وتوسيع الأنسجة
ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب لجميع أنواع الأنسجة.
- عند ارتداء واقي العين ، حرك شفرة حلاقة بين الشريحتين الزجاجيتين لغرفة التبلور لفصلهما.
ملاحظة: يجب فصل الشرائح الزجاجية بسهولة بالغة. إذا كانت أجزاء مختلفة من الجل عالقة في كلتا الشريحتين ، فيمكن استخدام فرشاة رسم لتوجيه الجل إلى أحدهما أو الآخر. إذا أصبح الجل جافا بشكل خاص أثناء البلمرة ، فيمكن تطبيق 1x PBS على الجزء الخارجي من حجرة الهلام ، ولكن لا تغمر الجل بالكامل ، لأن هذا سيؤدي إلى تمدده قبل تجانس الأنسجة ، مما يؤدي إلى التشقق. - قم بقص الجل الفارغ حول المنديل لتقليل الحجم. يسمح قطع الجل بشكل غير متماثل بتتبع اتجاه الجل بعد التجانس ، حيث ستكون العينة شفافة تماما.
- ارفع الجل المحتوي على الأنسجة برفق من الشريحة بشفرة حلاقة ، وانقله برفق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل باستخدام فرشاة رسم.
- املأ الأنبوب إلى الأعلى بمخزن مؤقت للتجانس (الجدول 2) مسخن مسبقا إلى 80 درجة مئوية.
- احتضان العينة مع الاهتزاز عند 80 درجة مئوية لمدة 8 ساعات (لدماغ الفأر الثابت PFA) أو 60 ساعة (معظم العينات السريرية FFPE ؛ انظر الجدول 3).
ملاحظة: يعتمد وقت التجانس على نوع الأنسجة وطريقة التثبيت. تم التحقق من صحة العديد من هذه الشروط بالفعل ، ولكن بالنسبة للآخرين ، قد يكون التحسين ضروريا. - صب محتويات أنبوب الطرد المركزي في بئر واحد من لوحة زراعة الخلايا البلاستيكية ذات 6 آبار.
- قم بإزالة المخزن المؤقت للتمسخ باستخدام ماصة نقل.
- لإزالة SDS المتبقية تماما من الهيدروجيل ، اغسل العينة في محلول خافض للتوتر السطحي غير أيوني بنسبة 1٪ (C12E 10) على النحو التالي: ثلاث مرات على الأقل لمدة10 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة ؛ لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية ؛ ثم ثلاث غسلات أخرى لمدة 10 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتخزين العينة في 1x PBS + 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية حتى يلزم إجراء التلوين والتصوير بعد التوسع.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تكون العينة أكبر ~ 3-4.5 أضعاف في كل بعد ، اعتمادا على نوع الأنسجة.
6. التنميط الجزيئي الحيوي بعد التوسع
- تلطيخ الأجسام المضادة
ملاحظة: يتبع هذا بروتوكول تلطيخ نموذجي للتألق المناعي (IF) / الكيمياء الهيستولوجية المناعية (I.H.C). تعتمد كميات الأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة على التركيزات المقترحة من قبل الشركة المصنعة أو عن طريق التحسين للتجربة المحددة. يمكن استبدال المخازن المؤقتة الفردية وفقا لتقدير المستخدم.- مع العينة في بئر واحد من لوحة زراعة الخلايا ذات 6 آبار ، اغسل العينات الموسعة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة في 1x PBS في RT ، مع نقل السائل باستخدام ماصة.
- قم بإجراء خطوة حظر اختيارية (على سبيل المثال ، 3٪ ألبومين مصل بقري / 0.1٪ Triton-X100 في 1x PBS) لمدة ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في العازلة تلطيخ (على سبيل المثال، 0.1٪ Triton-X100 1x PBS أو 9x PBS / 1٪ TritonX / 10 ملغ / لتر الهيبارين) طوال الليل عند 37 درجة مئوية. اعتمادا على حجم العينة ، يجب أن يغطي 0.5-2 مل الجل بشكل كاف.
- اغسل العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان في الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية في المخزن المؤقت للتلطيخ المفضل.
- اغسل العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
- NHS-استر عموم تلطيخ البروتين
- مع العينة في لوحة من 6 آبار ، صب 1-2 مل من البولي إيثيلين جلايكول (PEG 200) على العينة (يكفي لتغطيتها بالكامل).
ملاحظة: يجب أن يتقلص النسيج ويعود إلى حجمه الأصلي قبل التمدد (أو بالقرب منه). - بقعة مع الفلوروفور مترافق NHS-استر مخفف إلى 13.3-80 ميكروغرام / مل لمدة 3 ساعات في R.T. في 1-2 مل من المخزن المؤقت للتلطيخ (على سبيل المثال ، 1x PBS ، 2x SSC ، أو 100 mM محلول بيكربونات الصوديوم).
- اغسل العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
- مع العينة في لوحة من 6 آبار ، صب 1-2 مل من البولي إيثيلين جلايكول (PEG 200) على العينة (يكفي لتغطيتها بالكامل).
- تلطيخ الدهون
ملاحظة: تلطيخ الدهون بعد التمدد غير فعال على العينات السريرية FFPE ، حيث يتم فقدان الدهون أثناء عملية التثبيت.- اغسل العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق على الأقل في كل مرة في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
- ضع صبغة تقليدية محبة للدهون (DiO أو DiI أو DiD) مخففة 200 ضعف في 2 مل من 0.1٪ TritonX-100 / 1x PBS لمدة 72-96 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل ثلاث مرات على الأقل باستخدام 1x PBS
- التهجين الفلوري في الموقع (FISH)
- ضع عينات الجل المتجانسة في مخزن مؤقت للتهجين مسخن مسبقا إلى 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تحضير المخزن المؤقت للتهجين ل FISH: الجمع بين 2x S.S.C. (300 mM كلوريد الصوديوم ، 30 mM سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.0) ، 10٪ (v / v) كبريتات ديكستران ، 20٪ (v / v) كربونات الإيثيلين ، و 0.1٪ (v / v) Tween20.
- احتضان عينات الهلام بمخزن مؤقت تهجين يحتوي على 10 pM (لكل oligo) من مجسات FISH ضد الجين المستهدف (20 مجسا على الأقل لكل 10 كيلو بايت) عند 45 درجة مئوية طوال الليل.
- اغسل بمحلول غسيل صارم (2x S.S.C. و 0.1٪ Tween20) مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة عند 45 درجة مئوية.
- يغسل بعازل غسيل صارم مرتين أخريين لمدة 10 دقائق في كل مرة عند 37 درجة مئوية.
- أخيرا ، اغسل باستخدام 1x PBS ثلاث مرات على الأقل لمدة 10 دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة.
- العينات جاهزة للتصوير أو التخزين في 1x PBS + 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
- تمدد الأنسجة بالكامل والتصوير الفلوري
ملاحظة: يختلف عامل التمدد الذي يمكن تحقيقه باستخدام التكبير باختلاف نوع الأنسجة وطريقة التمدد (يمكن العثور على ملخص كامل في الجدول 3). ومع ذلك ، كتقدير عام ، ستتوسع عينة Magnify 3-4.5 أضعاف في 1x PBS ، و 5-7 أضعاف في PBS مخففة إلى 1:50 في ddH 2 O، و 8-11 أضعاف في ddH2O. يعتمد عامل التوسع الأمثل للتصوير على احتياجات كل تجربة. عامل التمدد قابل للضبط بدرجة كبيرة ، بحيث يمكن توسيع عينة واحدة وتقليصها عدة مرات للتصوير بمقاييس مختلفة.- انقل العينات الموسعة 4 أضعاف في PBS إلى لوحة تصوير ذات 6 آبار ذات قاع زجاجي باستخدام فرشاة رسم. انقل أي عينة موسعة عن طريق تقطيعها إلى قطع أصغر أو وضعها برفق في لوحة تصوير كبيرة ذات قاع زجاجي بقطعة رقيقة من البلاستيك المرن.
- قم بإجراء التصوير الفلوري باستخدام مجهر تقليدي واسع المجال أو مجهر متحد البؤر أو نظام تصوير آخر من اختيارك. قد تؤدي إزالة السوائل الزائدة حول الجل بقطعة قماش مخبرية ورقية إلى منع حركة الهلام أثناء التصوير. يمكن أيضا تجميد المواد الهلامية عن طريق تطبيق 0.1٪ بولي-L-lysine على سطح الزجاج قبل التصوير.
ملاحظة: تطبيق بولي-L-يسين سيجعل الجل غير متحرك تماما عند ملامسته. لهذا السبب ، يجب توخي الحذر من تطبيق الجل على الزجاج دون طي أو تمتد. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي السماح للهلام بالجفاف تماما على الزجاج المطلي ب poly-L-lysine ، لأن هذا قد يجعل الإزالة صعبة ، ويجب عدم تقليص الجل في PBS بينما لا يزال متصلا بالزجاج مع poly-L-lysine ، لأن هذا قد يتسبب في تلف الجل أو الأنسجة. - بعد التصوير ، قم بتقليص العينات في 1x PBS مع ثلاث غسلات على الأقل لمدة 10 دقائق في كل مرة ، حيث لا ينصح بتخزين العينات على المدى الطويل في ddH2O بسبب تدهور إشارة التألق. على وجه الخصوص ، يجب تصوير العينات الموسعة بالكامل الملطخة بالأصباغ المحبة للدهون في أقرب وقت ممكن من وقت التمدد لمنع تفكك الصبغة في الماء.
- قم بتخزين العينات في 1x PBS + 0.02٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إذا تم إكمال البروتوكول بنجاح (الشكل 1) ، فستظهر العينة واضحة ومسطحة بعد تمسخ الحرارة ؛ أي طي أو تجعد يشير إلى تجانس غير كامل. ستكون العينة الموسعة بنجاح أكبر بمقدار 3-4.5 مرة مما كانت عليه قبل التمدد في 1x PBS وأكبر من 8-11 ضعفا عند توسيعها بالكامل في ddH2O. يوضح الشكل 3 أمثلة على صور ما قبل وبعد التمدد لعينة الكلى البشرية FFPE بسمك 5 ميكرومتر والتي تمت معالجتها باستخدام هذا البروتوكول وتم توسيعها بنجاح على مدى 8 أضعاف. تم تلطيخ الأنسجة أولا بالأجسام المضادة ل ACTN4 جنبا إلى جنب مع DAPI لتصور الحمض النووي النووي. ثم تم تصوير العينة باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار (الشكل 3 أ). تمت معالجة الأنسجة باتباع البروتوكول المذكور أعلاه ، بما في ذلك تلطيخ نفس الأهداف بعد التمدد ، وتم توسيعها بالكامل في الماء (الشكل 3 ب) قبل إعادة التصوير. بعد تمسخ الحرارة، قد تكون الجزيئات الحيوية الأخرى غير البروتينات ملطخة وصورتها أيضا، كما هو موضح في الشكل 4. يمكن تطبيق الأصباغ المحبة للدهون للكشف عن هياكل غشاء الخلية والميتوكوندريا في دماغ الفأر (الشكل 4 أ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصوير الأحماض النووية من خلال FISH ، كما هو الحال في أنسجة العقدة الليمفاوية البشرية الطبيعية FFPE الموضحة في الشكل 4B ، C.
يوضح الشكل 5 النتيجة المحتملة إذا لم يتم تجانس العينة بشكل صحيح. بعد التمدد ، تم تلطيخ الأنسجة بالأجسام المضادة ل ACTN4 و vimentin ، جنبا إلى جنب مع DAPI لتصور الحمض النووي النووي وجرثومة القمح agglutinin (WGA) لتسمية الكربوهيدرات. تم توسيع الأنسجة 3.5 أضعاف في PBS قبل التصوير باستخدام مجهر القرص البؤري الغزل. في قسم واحد من الكلى (الشكل 5A ، C) ، يمكن رؤية التوسع الخالي من الشقوق للكبيبة. في قسم منفصل (الشكل 5B ، D) ، يمكن رؤية التكسير بوضوح في الأنسجة.
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير عمل التكبير. يتم إجراء المعالجة المسبقة لشرائح الأنسجة المؤرشفة سريريا أولا بناء على تنسيق التخزين. يجب غسل المقاطع المثبتة بالبارافورمالدهايد العائمة فقط في برنامج تلفزيوني. ثم يتم تحضين العينات في محلول مونومر هلامي ، بما في ذلك الميثاكرولين لتثبيت الجزيئات الحيوية في الهيدروجيل. يتم إجراء البلمرة في الموقع قبل تمسخ الحرارة باستخدام اليوريا و SDS و EDTA. ثم يتم غسل العينات جيدا وتلطيخها باستخدام بروتوكولات التلوين المناعي التقليدية أو بروتوكولات FISH أو الأصباغ المحبة للدهون. ثم يتم توسيع العينات في الماء النقي قبل التصوير. تم تعديل هذا الرقم من Klimas et al.17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: غرفة هلام عينة الأنسجة . (أ) على كل جانب من جوانب الأنسجة ، يتم وضع فواصل ، مثل قطعتين من زجاج الغطاء # 1.0 ، قبل السماح لمحلول مونومر الهلام بالانتشار عند 4 درجات مئوية. لمنع الضغط ، يجب أن تكون الفواصل أكثر سمكا من شرائح الأنسجة. (ب) يستخدم غطاء، مثل شريحة زجاجية ثانية، لتغطية العينة قبل البلمرة عند 37 درجة مئوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: مثال على صور ما قبل التمدد لمقطع من أنسجة الكلى في الإنسان. (أ) صورة تم التقاطها بتكبير 60x (1.4 NA) مقارنة ب (B) صورة لنفس مجال الرؤية بعد التمدد مع التكبير الملتقط عند تكبير 40x (1.15 NA ، عامل التمدد: 8.15x). أرجواني ، دابي ؛ أصفر ، ACTN4. يتم عرض أقصى كثافة لصور ما بعد التوسيع على 25 إطارا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استراتيجيات تلطيخ الجزيئات الحيوية البديلة باستخدام Magnify . (أ) (i و iv) وضع العلامات على البروتين الشامل NHS-ester لأنسجة دماغ الفأر الموسعة بالكامل. (II و V) صبغة محبة للدهون (DiD) لوضع العلامات على نفس أنسجة دماغ الفأر. (ثالثا وسادسا) تم دمج القنوات. (ب) الحمض النووي FISH مع التكبير باستخدام أنسجة العقدة الليمفاوية البشرية الطبيعية FFPE. عامل التوسع: 3.5x في 1x PBS. أبيض ، دابي ؛ أرجواني ، سيرين / ثريونين كيناز 1 جين ؛ أزرق ، جين بروتين منشط APC / C CDH1 ؛ الأصفر ، تسلسل القمر الصناعي البشري S4. (ج) القنوات الفردية المرتبطة ب B. تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار عند تكبير 40x (1.15 NA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية لعينات الكلى FFPE بسمك 5 ميكرومتر. (أ) التمدد الخالي من الشقوق. أبيض ، دابي ؛ الأصفر ، فيمنتين. سماوي ، ألفا أكتينين 4 ؛ أرجواني ، جرثومة القمح agglutinin. ب: توسيع قسم الكلى الذي يظهر تشققا. يمكن أن يكون التكسير والتشوهات وفقدان الأهداف المصنفة نتيجة لعدم كفاية التثبيت و / أو التجانس. (ج، د) صور مكبرة للمناطق المحاصرة في A و B ، على التوالي. تم الحصول على جميع الصور باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار عند تكبير 10x (A ، B ؛ 0.45 NA) أو 60x (C ، D ؛ 1.2 NA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تكوين محلول مونومر الهلام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: تكوين المخزن المؤقت للتجانس. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: ملخص لظروف الميثاكرولين والتجانس للأنسجة التي تم التحقق من صحتها. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، نقدم بروتوكول Magnify 17 ، وهو متغير ExM يمكنه الاحتفاظ بجزيئات حيوية متعددة مع مرساة كيميائية واحدة وتوسيع العينات السريرية FFPE الصعبة حتى11 ضعفا مع تمسخ الحرارة. تشمل التغييرات الرئيسية في هذا البروتوكول التي تميزه عن بروتوكولات ExM الأخرى استخدام هلام معاد صياغته يظل قويا ميكانيكيا حتى عند توسيعه بالكامل ، بالإضافة إلى استخدام الميثاكرولين كمرساة للجزيء الحيوي. الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي كما يلي: 1) تكوين محلول الهلام النهائي. 2) توقيت خطوات الهلام ؛ 3) إعداد غرفة الجيلاتيون. 4) معلمات تجانس العينة ؛ و 5) الغسيل الكافي ل SDS من العينة قبل تلطيخ ما بعد التوسع.
المعلمة الأكثر أهمية لهذا البروتوكول هي تكوين محلول التبلور النهائي ، وخاصة تركيز الميثاكرولين مرساة الجزيء الحيوي. مطلوب تركيزات مختلفة من الميثاكرولين لتوسيع أنواع الأنسجة المختلفة (الجدول 3) ، ويجب توخي الحذر لضمان مطابقة هذه القيمة جيدا للعينة المراد توسيعها. يمكن أن يؤدي الإفراط في التثبيت مع الميثاكرولين إلى انخفاض عامل التمدد وفقدان الحواتم المتاحة للتلطيخ بعد التمدد ، في حين أن التثبيت الناقص ، خاصة في العينات السريرية FFPE ، يمكن أن يؤدي إلى تشققات الأنسجة أو تشويهها. لذلك ، يجب تحسين تركيز الميثاكرولين لأنواع الأنسجة غير المؤكدة ، على الرغم من أن التركيز الأمثل من المحتمل أن يقع بالقرب من أو ضمن النطاق المعروض هنا. بينما نتوقع أن يعمل هذا البروتوكول مع معظم أنواع الأنسجة ، حتى تلك التي لم نتحقق منها بعد ، فمن المعروف أنه لا يعمل مع العينات التي تحتوي على العظام.
بالإضافة إلى الميثاكرولين ، يمكن أن يؤدي استخدام تركيز غير صحيح لمكون جل حرج (4HT أو TEMED) إلى الفشل الكامل للتجربة ، إما بسبب التبلور غير المكتمل أو عدم التبلور (4HT المفرط) أو الهلام المبكر (TEMED المفرط ، أو تقليل 4HT ، أو إضافة APS قبل المكونات الأخرى). لمنع الهلام المبكر ، من الضروري أيضا الاحتفاظ بالعينة والهلام عند 4 درجات مئوية وتعريضهما للهواء لمدة 30 دقيقة وتغطية العينة فقط ووضعها عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطبة بعد اكتمال عملية الانتشار.
عند بناء حجرة الهلام ، يعد تضمين الفواصل بين الشريحتين الزجاجيتين غير المطليتين أمرا بالغ الأهمية ، خاصة بالنسبة لأقسام الأنسجة السميكة مثل دماغ الفأر الثابت PFA. يمكن أن يتسبب نقص الفواصل في ضغط الأنسجة ، مما يؤدي إلى صور مشوهة وبيانات غير دقيقة.
يعتمد تجانس العينة على وقت الهضم مع المخزن المؤقت للهضم ، وكذلك درجة حرارة المخزن المؤقت للهضم وتكوينه. يمكن أن يتسبب التجانس غير الكافي في حدوث تشوهات وتقليل عوامل التمدد مقارنة بالقيمة المبلغ عنها لنوع معين من الأنسجة. في حالة الاشتباه في التجانس غير الكامل ، يمكن زيادة وقت الهضم ، خاصة في حالة الأنسجة السميكة.
وتتمثل خطوة بسيطة ولكنها حاسمة في الغسل الكافي ل SDS من العينة باستخدام خافض للتوتر السطحي غير أيوني (مثل C12E10) بعد خطوة التجانس. يمكن أن يؤدي أي بقايا SDS إلى ارتباط الأجسام المضادة دون المستوى الأمثل أو إعاقة تامة. لحسن الحظ ، إذا كان هذا مشتبها به ، فإن المزيد من الغسيل وإعادة تطبيق الأجسام المضادة غالبا ما يكون حلا مرضيا.
يوفر البروتوكول بديلا فعالا من حيث التكلفة للتصوير فائق الدقة الحالي وتقنيات الفحص المجهري الإلكتروني لاستجواب الهياكل النانوية في عينات الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك العينات السريرية FFPE. يسمح استخدام الميثاكرولين وتمسخ الحرارة بالتنميط بعد التمدد لأي جزيئات حيوية يتم حفظها أثناء تثبيت الأنسجة (وهذا يحول دون تصوير الدهون في عينات FFPE ، على سبيل المثال). بروتوكولنا ، كامتداد لإطار عمل ExM ، معياري ومتوافق على الأرجح مع تقنيات أخرى مثل طرق الدقة الفائقة البصرية (STED18 ، STORM 19) أو مجهر التمدد التكراري (iExM)15. ومع ذلك ، لم يتم اختبارها بعد مع البروتوكول المقدم ، وقد تشكل عوامل التوسع الكبيرة تحديات ، خاصة مع تخفيف الفلوروفور. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحجم الكبير للعينات بعد التمدد الكامل في الماء يتطلب عناية عند المناولة (على الرغم من أن الجل المستخدم هنا أكثر مرونة من تركيبات جل ExM السابقة ذات عامل التمدد العالي ، مثل الفحص المجهري القوي للتمدد بعشرة أضعاف (TREx) ، للتعامل مع الأخطاء17) ، والحلول الإبداعية مطلوبة أحيانا لنقل وتصوير هذه المواد الهلامية الموسعة بالكامل. على سبيل المثال ، استخدام أدوات واسعة القاعدة مثل ورقة رقيقة من البلاستيك لنقل المواد الهلامية الموسعة بالكامل بدلا من فرشاة الرسم ، أو باستخدام لوحات تصوير كبيرة مصنوعة خصيصا (في أيدينا ، وهذا يعني لوحات مقطوعة بالليزر أو مطبوعة 3D مع قطع كبيرة من # 1.5 غطاء زجاجي ملتصق بالأسفل ؛ يمكن رؤيتها في الفيديو المصاحب). الأهم من ذلك ، أن هذه الطريقة توسع نطاق تطبيق التصوير النانوي من خلال السماح بالتصوير النانوي لمستحضرات العينات البيولوجية والمرضية الشائعة على المجاهر التقليدية واسعة المجال أو متحدة البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عن المصالح المالية المتنافسة التالية: اخترع YZ و AK و Z.C. و B.R.G. العديد من الاختراعات المتعلقة ب Magnify و ExM.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل جامعة كارنيجي ميلون ومؤسسة D.S.F. الخيرية (YZ و X.R.) ، والمعاهد الوطنية للصحة (N.I.H.) جائزة المخرج المبتكر الجديد DP2 OD025926-01 ، ومؤسسة كوفمان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
