Summary
Presentert her er en ny versjon av ekspansjonsmikroskopi (ExM), Magnify, som er modifisert for opptil 11 ganger ekspansjon, og bevarer et omfattende utvalg av biomolekylklasser, og er kompatibel med et bredt spekter av vevstyper. Det muliggjør undersøkelse av nanoskalakonfigurasjonen av biomolekyler ved hjelp av konvensjonelle diffraksjonsbegrensede mikroskoper.
Abstract
Nanoskala avbildning av biologiske prøver kan forbedre forståelsen av sykdomspatogenese. I de senere år har ekspansjonsmikroskopi (ExM) vist seg å være et effektivt og billig alternativ til optisk superoppløsningsmikroskopi. Imidlertid har det vært begrenset av behovet for spesifikke og ofte tilpassede forankringsmidler for å beholde forskjellige biomolekylklasser i gelen og av vanskeligheter med å utvide standard kliniske prøveformater, for eksempel formalinfiksert parafininnebygd vev, spesielt hvis større ekspansjonsfaktorer eller konserverte proteinepitoper er ønsket. Her beskriver vi Magnify, en ny ExM-metode for robust ekspansjon opptil 11 ganger i et bredt spekter av vevstyper. Ved å bruke metakorolin som det kjemiske ankeret mellom vev og gel, beholder Magnify flere biomolekyler, slik som proteiner, lipider og nukleinsyrer, i gelen, og tillater dermed bred nanoskalaavbildning av vev på konvensjonelle optiske mikroskoper. Denne protokollen beskriver beste praksis for å sikre robust og sprekkfri vevsutvidelse, samt tips for håndtering og avbildning av svært ekspanderte geler.
Introduction
Biologiske systemer utviser strukturell heterogenitet, fra lemmer og organer ned til nivåene av proteiner på nanoskala. Derfor krever en fullstendig forståelse av driften av disse systemene visuell undersøkelse på tvers av disse størrelsesskalaene. Imidlertid forårsaker diffraksjonsgrensen for lys utfordringer ved visualisering av strukturer mindre enn ~ 200-300 nm på et konvensjonelt fluorescensmikroskop. I tillegg presenterer optiske superoppløsningsmetoder 1,2,3, som stimulert utslippsuttømming (STED), fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM) og strukturert belysningsmikroskopi (SIM), selv om de er kraftige, sine egne utfordringer, da de krever dyr maskinvare og reagenser og ofte har langsomme oppkjøpstider og dårlig evne til å avbilde store volumer i 3D.
Ekspansjonsmikroskopi4 (ExM) gir et alternativt middel for å omgå diffraksjonsgrensen for lys ved kovalent forankring av biomolekyler i en vannsvulmende polymergel og fysisk trekke dem fra hverandre, og dermed gjøre dem oppløselige på konvensjonelle optiske mikroskoper. En rekke ExM-protokollvarianter har blitt utviklet siden den opprinnelige publiseringen av ExM for mindre enn et tiår siden, og disse protokollene tillater direkte inkorporering av proteiner 5,6,7, RNA 8,9,10 eller lipider11,12,13 inn i gelnettverket ved å endre det kjemiske ankeret eller utvide prøven ytterligere (og dermed forbedre den effektive oppløsningen) enten i et enkelt trinn14 eller flere iterative trinn15,16. Inntil nylig kunne ingen enkelt ExM-protokoll beholde disse tre biomolekylklassene med et enkelt kommersielt tilgjengelig kjemisk anker, samtidig som det ga en mekanisk solid gel som kunne utvide ~ 10 ganger i en enkelt ekspansjonsrunde.
Her presenterer vi Magnify17, et nylig tillegg til ExM-arsenalet som bruker metakrolin som biomolekylanker. Metakrotin danner kovalente bindinger med vev som for paraformaldehyd, slik at flere klasser av biomolekyler kan beholdes i gelnettverket uten å kreve forskjellige spesifikke eller tilpassede forankringsmidler. I tillegg kan denne teknikken utvide et bredt spekter av vev opptil 11 ganger, inkludert notorisk utfordrende prøver som formalinfast parafin-innebygd (FFPE) kliniske prøver. Tidligere metoder for å utvide slike mekanisk stive prøver krevde hard proteasefordøyelse, noe som gjorde antistoffmerkingen av proteiner av interesse umulig etter at prøven hadde blitt utvidet. I motsetning til dette oppnår denne teknikken utvidelse av FFPE kliniske prøver ved hjelp av en varm denatureringsløsning, og dermed bevare hele proteinepitoper i gelen, som kan målrettes for postekspansjonsavbildning (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer dyr ble utført i samsvar med National Institutes of Health (NIH) retningslinjer og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Carnegie Mellon University. Humane vevsprøver ble kommersielt innhentet.
1. Klargjøring av lagerreagenser og løsninger
MERK: Se materialfortegnelsen for en liste over reagensene som brukes.
- Forbered geleringslagerløsningene. Disse vil bli kombinert umiddelbart før geleringstrinnet.
- Klargjør monomeroppløsningen (4 g/100 ml N,N- dimetylakrylamidsyre [DMAA], 50 g/100 ml natriumakrylat [SA], 66,7 g/100 ml akrylamid [AA], 0,10 g/100 ml n,n′-metylenbisakrylamid [Bis], 33 g/100 ml natriumklorid [NaCl], 1x fosfatbufret saltvann; PBS) ved hjelp av komponentene oppført i tabell 1. Løs opp eller fortynn alle stamløsningene i vann. Stammonomeroppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i minst 3 måneder.
- Lag følgende stamløsninger separat i vann: 0,5% (w / w) 4-Hydroxy-TEMPO (4HT), som hemmer gelering under monomerdiffusjon i vevet, og 10% (w / w) tetrametyletylendiamin (TEMED), som akselererer den radikale generasjonen initiert av ammoniumpersulfat (APS) og fremstilles ved 10% (w / w).
MERK: Stamløsningen kan distribueres i 1-2 ml alikoter og lagres ved 4 °C i opptil 3 måneder; Imidlertid lages APS umiddelbart før klargjøring av geleringsoppløsningen.
- Forbered homogeniseringsbufferen (1% w / v SDS, 8 M urea, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, ved romtemperatur [R.T.]) ved å kombinere 1 g SDS, 48,048 g urea, 5 ml EDTA (0,5M, pH 8), 20 ml 10x PBS, 25 ml Tris (2 M) og 0,75 g glycin. Tilsett vann for et totalt volum på 100 ml. Løsningen kan skaleres opp eller ned etter behov og kan lagres ved R.T.
2. Vevsforberedelse for arkiverte og nytilberedte kliniske vevsglass
MERK: Trinnene for forbehandling av vev varierer basert på hvordan prøvene tilberedes.
- For kliniske prøver med formaldehydfast parafininnebygd (FFPE), følg trinnene nedenfor.
- Plasser prøvene i en sekvensiell serie løsninger (en glassglassglassglassgurk eller 50 ml konisk rør kan brukes): xylen, 95% etanol, 70% etanol og 50% etanol, etterfulgt av dobbelt avionisert vann. Bruk hver oppløsning to ganger i minst 3 minutter hver gang. Bruk tang til å plassere lysbildet i beholderen, og tilsett 15 ml av den respektive løsningen (nok til å dekke prøven). Plasser det kappede koniske røret horisontalt på en shaker ved romtemperatur.
- For prøver farget og montert på permanente lysbilder, følg trinnene nedenfor.
- Plasser lysbildet kort i xylen, og fjern forsiktig dekslene med et passende verktøy, for eksempel et barberblad. Hvis dekselet sitter fast, sett lysbildene i xylen tilbake til romtemperatur til dekselet løsner.
- Deretter behandler du prøvene som FFPE-prøver (trinn 2.1.1).
MERK: For hematoksylin og eosin (H &E) -fargede lysbilder, går hematoksylin- og eosinflekken tapt under ekspansjonsprosessen.
- For ufikserte frosne vevsglass i optimal skjæretemperatur (OCT) løsning, fikser vevet i aceton ved -20 °C i 10 minutter før du vasker prøvene med 1x PBS-oppløsning tre ganger i 10 minutter hver gang ved romtemperatur.
- For tidligere faste frosne kliniske vevslysbilder, smelt OCT ved å inkubere lysbildene i 2 minutter ved romtemperatur, og vask deretter med 1x PBS-oppløsning tre ganger i 5 minutter hver gang ved romtemperatur.
3. Vevsforberedelse for paraformaldehydfiksert musehjerne
- Følg denne protokollen for musehjerneseksjoner som er 30-50 μm tykke.
MERK: Suksess kan bli funnet med større seksjoner, men lengre tider kan være nødvendig for monomer løsning diffusjon og homogenisering. - Hvis seksjonene for øyeblikket ikke er lagret i en 1x PBS-løsning (for eksempel i en 30% [v / v] glyserol og 30% [v / v] etylenglykoloppløsning i 1x PBS), vask tre ganger i minst 10 minutter hver gang ved romtemperatur i 1x PBS i en 6-til-24-brønnplate.
- Få et ubelagt glassmikroskopilysbilde. Hvis den ene siden av glassglasset er belagt, bruk en våt pensel for å se etter den ubelagte siden (ofte vil etiketten på den belagte siden være laget av malt glass og blir mindre ugjennomsiktig når den er våt).
- Bruk en pensel til å fukte den ubestrøkne sklien. Fjern musens hjernevev fra brønnplaten med penselen, og legg det forsiktig på lysbildet, ved hjelp av en rullende bevegelse for å sikre at vevet er flatt. La overflødig PBS forbli på vevet til alle seksjonene er montert.
MERK: Mens et enkelt glassglass kan brukes til flere vevsseksjoner, når flere vevsseksjoner geleres samtidig (selv på separate lysbilder), må det utvises mer forsiktighet for å sikre at de ikke tørker helt ut. - Bruk en laboratoriepapirklut, fjern størstedelen av overflødig PBS fra lysbildet. La det være en liten væskering rundt hver vevsdel, men la resten av lysbildet være mest tørt. Denne gjenværende væsken vil dekke vevet mens gelmonomeroppløsningen fremstilles.
4. Gelering
MERK: Denne protokollen er egnet for alle vevstyper som er klargjort for bruk med denne teknikken.
- Påfør avstandsstykker på hver side av vevsseksjonen (figur 2A) for å forhindre vevskompresjon. For å gjøre det, lag avstandsstykkene ved å kutte tynne stykker dekselglass med en diamantpenn, og fest dem deretter til lysbildet med små mengder vann eller 1x PBS, eller fest dem med en liten mengde superlim. Deretter plasserer du avstandsstykkene forsiktig på hver side av vevet.
- Forbered den endelige geleringsløsningen. Vanligvis er ~200 μL tilstrekkelig per vevssnitt, men volumet bør ikke overstige 800 μL per lysbilde. Enhver mer geleringsløsning vil resultere i spillover.
MERK: Metakrotin, brukes til å forankre biomolekyler i gelen. Det er imidlertid ikke nødvendig med et separat forankringstrinn, og metakrolin kan tilsettes direkte til den endelige geleringsløsningen.- Kombiner følgende i rekkefølge per seksjon: 200 μL monomeroppløsning, 0,5 μL 0,5 % 4HT-stamoppløsning (1:400 fortynning), 0,2-0,5 μL metakrolin (1:400-1:1000 fortynning avhengig av vevstype; bruk vanligvis en 1:1 000 fortynning for paraformaldehyd [PFA]-faste prøver og 1:400 for kliniske FFPE-prøver), 2 μL 10 % TEMED stamløsning (1:100 fortynning), og 5 mikrol 10 % A.P.S. stamløsning (1:40 fortynning).
MERK: Forbered den endelige geleringsoppløsningen umiddelbart før bruk. For å forhindre for tidlig gelering, legg til APS-løsningen sist.
- Kombiner følgende i rekkefølge per seksjon: 200 μL monomeroppløsning, 0,5 μL 0,5 % 4HT-stamoppløsning (1:400 fortynning), 0,2-0,5 μL metakrolin (1:400-1:1000 fortynning avhengig av vevstype; bruk vanligvis en 1:1 000 fortynning for paraformaldehyd [PFA]-faste prøver og 1:400 for kliniske FFPE-prøver), 2 μL 10 % TEMED stamløsning (1:100 fortynning), og 5 mikrol 10 % A.P.S. stamløsning (1:40 fortynning).
- Fjern overflødig løsning fra vevseksjonen, og legg lysbildet i en petriskål. Tilsett all den nytilberedte, kalde geleringsløsningen i prøven, og inkuber blandingen på vevet i 30 minutter ved 4 °C for å tillate diffusjon i vevet.
- Plasser et annet ubelagt glasslysbilde forsiktig over vevs- og geloppløsningen. Luftbobler bør unngås (figur 2B).
MERK: Hvis luftbobler blir fanget over vevet, kan glasslokket løftes forsiktig og plasseres ned igjen. I tillegg kan enhver monomerløsning som søler ut bli trimmet av etter polymerisering og vil ikke forårsake noen problemer for vevet. - Sørg for at polymerisasjonen er fullført. Denne polymerisasjonen kan gjøres på to måter, som hver gir lignende resultater. Inkuber først prøvene ved 37 °C i fuktige omgivelser (for eksempel en lukket petriskål med et fuktig papirhåndkle) over natten. Alternativt, for raskere polymerisering, inkuber prøvene i den fuktede atmosfæren i 2 timer ved 37 ° C etterfulgt av 1 time ved 60 ° C.
5. Prøvefordøyelse og vevsutvidelse
MERK: Denne protokollen er egnet for alle vevstyper.
- Bruk øyevern, skyv et barberblad mellom de to glasslysbildene i geleringskammeret for å skille dem.
MERK: Glasslysbildene skal skille seg veldig enkelt. Hvis forskjellige deler av gelen sitter fast på begge lysbildene, kan en pensel brukes til å lede gelen til den ene eller den andre. Hvis gelen har blitt spesielt tørr under polymerisering, kan 1x PBS påføres på utsiden av gelkammeret, men ikke senk gelen helt, da dette vil føre til at den ekspanderer før vevet homogeniseres, noe som vil resultere i sprekker. - Trim den tomme gelen rundt vevet for å minimere volumet. Kutting av gelen asymmetrisk muliggjør sporing av gelens orientering etter homogenisering, da prøven vil være helt gjennomsiktig.
- Løft forsiktig den vevsholdige gelen fra lysbildet med et barberblad, og overfør den forsiktig til et 2 ml sentrifugerør med en pensel.
- Fyll røret til toppen med homogeniseringsbuffer (tabell 2) forvarmet til 80 °C.
- Inkuber prøven med risting ved 80 °C i 8 timer (for PFA-fiksert musehjerne) eller 60 timer (de fleste kliniske FFPE-prøver; se tabell 3).
MERK: Homogeniseringstiden er avhengig av vevstype og fikseringsmetode. Mange av disse betingelsene er allerede validert, men for andre kan optimalisering være nødvendig. - Hell innholdet i sentrifugerøret i en enkelt brønn av en 6-brønns plastcellekulturplate.
- Fjern denatureringsbufferen med en overføringspipette.
- For å fjerne gjenværende SDS helt fra hydrogelen, vask prøven i en 1% ikke-ionisk overflateaktivt middel (C12E 10) løsning som følger: minst tre ganger i10 minutter hver gang ved romtemperatur; i 60 minutter ved 60 °C; og deretter ytterligere tre vasker i 10 min hver gang ved romtemperatur.
- Oppbevar prøven i 1x PBS + 0,02 % natriumazid ved 4 °C til farging og avbildning etter ekspansjon må utføres.
MERK: På dette tidspunktet bør prøven være ~ 3-4,5 ganger større i hver dimensjon, avhengig av vevstype.
6. Profilering av biomolekyler etter ekspansjon
- Antistofffarging
MERK: Dette følger en typisk immunfluorescens (IF) / immunhistokjemi (I.H.C.) fargeprotokoll. Mengdene av primære og sekundære antistoffer som brukes, avhenger av konsentrasjonene foreslått av produsenten eller ved optimalisering for det spesifikke eksperimentet. Individuelle buffere kan erstattes etter brukerens skjønn.- Med prøven i en enkelt brønn med en 6-brønns cellekulturplate, vask de utvidede prøvene tre ganger i 10 minutter hver gang i 1x PBS ved RT, og overfør væsken med en pipette.
- Utfør et valgfritt blokkeringstrinn (for eksempel 3 % bovint serumalbumin/0,1 % Triton-X100 i 1x PBS) i minst 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
- Inkuber med de primære antistoffene i fargebuffer (for eksempel 0,1 % Triton-X100 1x PBS eller 9x PBS/1 % TritonX/10 mg/L heparin) over natten ved 37 °C. Avhengig av prøvestørrelsen, bør 0,5-2 ml tilstrekkelig dekke gelen.
- Vask prøven tre ganger i minst 10 minutter hver gang i 1x PBS ved romtemperatur.
- Inkuber de tilsvarende sekundære antistoffene i 3 timer ved 37 °C i den valgte fargebufferen.
- Vask prøven tre ganger i minst 10 minutter hver gang i 1x PBS ved romtemperatur.
- NHS-ester pan-protein farging
- Med prøven i en 6-brønnsplate, hell 1-2 ml polyetylenglykol (PEG 200) på prøven (nok til å dekke den helt).
MERK: Vevet skal krympe og gå tilbake til sin opprinnelige pre-ekspansjonsstørrelse (eller i nærheten av det). - Flekk med fluoroforkonjugert NHS-ester fortynnet til 13,3-80 μg / ml i 3 timer ved RT i 1-2 ml fargebuffer (for eksempel 1x PBS, 2x SSC eller 100 mM natriumbikarbonatløsning).
- Vask prøven tre ganger i minst 10 minutter hver gang i 1x PBS ved romtemperatur.
- Med prøven i en 6-brønnsplate, hell 1-2 ml polyetylenglykol (PEG 200) på prøven (nok til å dekke den helt).
- Lipid farging
MERK: Lipidfarging etter ekspansjon er ikke effektiv på FFPE-kliniske prøver, da lipider går tapt under fikseringsprosessen.- Vask prøven tre ganger i minst 10 minutter hver gang i 1x PBS ved romtemperatur.
- Påfør et konvensjonelt lipofilt fargestoff (DiO, DiI eller DiD) fortynnet 200 ganger i 2 ml 0,1% TritonX-100 / 1x PBS i 72-96 timer ved romtemperatur.
- Vask minst tre ganger med 1x PBS
- Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
- Legg homogeniserte gelprøver i hybridiseringsbuffer forvarmet til 60 °C i 30 minutter.
- Forbered hybridiseringsbufferen for FISH: Kombiner 2x SSC (300 mM NaCl, 30 mM natriumcitrat, pH 7,0), 10% (v / v) dekstransulfat, 20% (v / v) etylenkarbonat og 0,1% (v / v) Tween20.
- Inkuber gelprøvene med en hybridiseringsbuffer som inneholder 10 pM (per oligo) FISH-sonder mot målgenet (minst 20 prober per 10 kb) ved 45 °C over natten.
- Vask med streng vaskebuffer (2x S.S.C. og 0,1 % Tween20) to ganger i 15 minutter hver gang ved 45 °C.
- Vask med streng vaskebuffer ytterligere to ganger i 10 min hver gang ved 37 °C.
- Til slutt, vask med 1x PBS minst tre ganger i 10 min hver gang ved romtemperatur.
- Prøvene er klare for avbildning eller lagring i 1x PBS + 0,02 % natriumazid ved 4 °C.
- Full vevsutvidelse og fluorescensavbildning
MERK: Ekspansjonsfaktoren som kan oppnås med Magnify varierer med vevstype og ekspansjonsmetode (en fullstendig oppsummering finnes i tabell 3). Som et generelt estimat vil imidlertid en forstørrelsesprøve ekspandere 3-4,5 ganger i 1x PBS, 5-7 ganger i PBS fortynnet til 1:50 i ddH 2 O og 8-11 ganger i ddH2O. Den optimale ekspansjonsfaktoren for avbildning avhenger av hvert eksperiments behov. Ekspansjonsfaktoren er svært justerbar, slik at en enkelt prøve kan utvides og krympes mange ganger for avbildning på forskjellige skalaer.- Flytt prøvene som er utvidet 4 ganger i PBS til en glassbunn 6-brønns bildeplate ved hjelp av en pensel. Flytt en prøve som utvides ytterligere ved å kutte den i mindre biter eller plassere forsiktig i en stor glassbunnbildeplate med et tynt stykke fleksibel plast.
- Utfør fluorescensavbildning ved hjelp av et konvensjonelt bredfeltsmikroskop, et konfokalmikroskop eller et annet bildebehandlingssystem. Fjerning av overflødig væske rundt gelen med en papirlaboratorieklut kan forhindre gelbevegelse under avbildning. Gelene kan også immobiliseres ved å påføre 0,1% poly-L-lysin på glassoverflaten før avbildning.
MERK: Påføring av poly-L-lysin vil gjøre gelen helt immobile ved kontakt. Av denne grunn må det tas hensyn til at gelen påføres glasset uten å brette eller strekke seg. I tillegg bør gelen ikke få tørke helt på poly-L-lysinbelagt glass, da dette kan gjøre fjerning vanskelig, og gelen bør ikke krympes i PBS mens den fortsatt er festet til glasset med poly-L-lysin, da dette kan forårsake gel- eller vevskader. - Etter avbildning, krymp prøvene i 1x PBS med minst tre vasker i 10 minutter hver gang, da det ikke anbefales å lagre prøvene på lang sikt i ddH2O på grunn av nedbrytning av fluorescenssignalet. Spesielt bør fullt utvidede prøver farget med lipofile fargestoffer avbildes så nær ekspansjonstidspunktet som mulig for å forhindre dissosiasjon av fargestoffet i vann.
- Oppbevar prøvene i 1x PBS + 0,02 % natriumazid ved 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hvis protokollen er fullført (figur 1), vil prøven vises klar og flat etter varmedenaturering; Enhver folding eller rynke indikerer ufullstendig homogenisering. En vellykket utvidet prøve vil være 3-4,5 ganger større enn før ekspansjon i 1x PBS og 8-11 ganger større når den er fullt utvidet i ddH2O. Figur 3 viser eksempler på bilder før og etter ekspansjon av 5 μm tykk FFPE human nyreprøve behandlet ved hjelp av denne protokollen og vellykket utvidet over 8 ganger. Vevet ble først farget med antistoffer for ACTN4 sammen med DAPI for å visualisere det nukleære DNA. Prøven ble deretter avbildet ved hjelp av et spinnende diskkonfokalmikroskop (figur 3A). Vevet ble behandlet etter protokollen ovenfor, inkludert farging etter ekspansjon av de samme målene, og fullstendig ekspandert i vann (figur 3B) før ny avbildning. Etter varmedenaturering kan andre biomolekyler enn proteiner også farges for og avbildes, som vist i figur 4. Lipofile fargestoffer kan brukes til å avsløre celle- og mitokondriemembranstrukturer i musehjernen (figur 4A). I tillegg kan nukleinsyrer avbildes gjennom FISH, som i FFPEs normale humane lymfeknutevev vist i figur 4B,C.
Figur 5 viser et sannsynlig utfall dersom prøven ikke er riktig homogenisert. Etter utvidelse ble vevet farget med antistoffer for ACTN4 og vimentin, sammen med DAPI for å visualisere kjernefysisk DNA og hvetekimagglutinin (WGA) for å merke karbohydrater. Vevet ble utvidet 3,5 ganger i PBS før avbildning ved hjelp av et spinnende disk konfokalmikroskop. I en nyreseksjon (figur 5A,C) ses den sprekkfrie ekspansjonen av glomerulus. I et eget snitt (figur 5B,D) kan man tydelig se sprekkdannelser i vevet.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av forstørrelsesarbeidsflyten. Forbehandling av klinisk arkiverte vevsslides utføres først basert på lagringsformatet. Frittflytende paraformaldehydfaste seksjoner trenger bare vaskes i PBS. Prøvene inkuberes deretter i en gelmonomerløsning, inkludert metakrolin for å forankre biomolekylene til hydrogelen. In situ-polymerisering utføres før varmedenaturering med urea, SDS og EDTA. Prøvene blir deretter grundig vasket og farget ved hjelp av konvensjonelle immunfargingsprotokoller, FISH-protokoller eller lipofile fargestoffer. Prøvene blir deretter utvidet i rent vann før avbildning. Dette tallet er modifisert fra Klimas et al.17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vevsprøvegeleringskammer . (A) På hver side av vevet plasseres to avstandsstykker, for eksempel to stykker #1.0 dekkglass, før gelmonomerløsningen får diffundere ved 4 °C. For å forhindre kompresjon, bør avstandsstykkene være tykkere enn vevskivene. (B) Et lokk, for eksempel et annet glassglass, brukes til å dekke prøven før polymerisering ved 37 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempel på preekspansjonsbilder av en human nyrevevsseksjon. (A) Et bilde tatt med 60x forstørrelse (1,4 NA) sammenlignet med (B) et bilde av samme synsfelt etter ekspansjon med Forstørrelse tatt ved 40x forstørrelse (1,15 NA, ekspansjonsfaktor: 8,15x). Magenta, DAPI; Gul, ACTN4. Den maksimale intensiteten til bildene etter utvidelsen projiseres over 25 bilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Alternative biomolekylfargestrategier med Magnify . (A) (i og iv) NHS-ester pan-protein merking av fullt utvidet mus hjernevev. (ii og v) Lipofil fargestoff (DiD) merking av samme mus hjernevev. (iii og vi) Kanalene ble slått sammen. (B) DNA FISH med Magnify ved bruk av FFPE normalt humant lymfeknutevev. Ekspansjonsfaktor: 3,5x i 1x PBS. Hvit, DAPI; Magenta, serin/treoninkinase 1 gen; Blått, APC / C aktivatorprotein CDH1 gen; Gul, menneskelig satellittsekvens S4. (C) Individuelle kanaler tilknyttet B. Alle bildene ble oppnådd ved hjelp av et spinnende disk konfokalmikroskop ved 40x forstørrelse (1, 15 NA). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative resultater av 5 μm tykke FFPE nyreprøver. (A) Sprekkfri utvidelse. Hvit, DAPI; Gul, vimentin; Cyan, alfa-aktinin 4; Magenta, hvetekimagglutinin. (B) Utvidet nyreseksjon som viser sprekker. Sprekkdannelser, forvrengninger og tap av merkede mål kan være et resultat av utilstrekkelig forankring og/eller homogenisering. (C,D) Innzoomede bilder av de innboksede områdene i henholdsvis A og B. Alle bildene ble tatt ved hjelp av et spinnende disk konfokalmikroskop ved 10x (A, B; 0, 45 NA) eller 60x (C, D; 1, 2 NA) forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammensetning av gelmonomeroppløsning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Sammensetning av homogeniseringsbuffer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Sammendrag av metakolin- og homogeniseringsbetingelser for validerte vev. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi Magnify-protokollen17, en ExM-variant som kan beholde flere biomolekyler med et enkelt kjemisk anker og utvide utfordrende FFPE-kliniske prøver opptil 11 ganger med varmedenaturering. De viktigste endringene i denne protokollen som skiller den fra andre ExM-protokoller, inkluderer bruk av en omformulert gel som forblir mekanisk robust selv når den er fullstendig utvidet, samt bruk av metakrolin som biomolekylanker. De mest kritiske trinnene i denne protokollen er som følger: 1) sammensetningen av den endelige geloppløsningen; 2) tidspunktet for geleringstrinnene; 3) oppsettet av geleringskammeret; 4) parametrene for prøvehomogenisering; og 5) tilstrekkelig vask av SDS fra prøven før farging etter ekspansjon.
Den mest kritiske parameteren for denne protokollen er sammensetningen av den endelige geleringsløsningen, spesielt konsentrasjonen av biomolekylankeret metakrotin. Ulike metakrotinkonsentrasjoner er nødvendig for å utvide forskjellige vevstyper (tabell 3), og det må utvises forsiktighet for å sikre at denne verdien er godt tilpasset prøven som skal utvides. Overforankring med metakolin kan resultere i redusert ekspansjonsfaktor og tap av epitoper tilgjengelig for farging etter ekspansjon, mens underforankring, spesielt i kliniske FFPE-prøver, kan føre til vevssprekker eller forvrengning. Derfor må metakrotinkonsentrasjonen optimaliseres for ikke-validerte vevstyper, selv om den optimale konsentrasjonen sannsynligvis vil falle nær eller innenfor området som presenteres her. Selv om vi forventer at denne protokollen vil fungere for de fleste vevstyper, selv de vi ennå ikke har validert, er det kjent at den ikke fungerer for prøver som inneholder bein.
Utover metakrolin kan bruk av feil konsentrasjon av en kritisk gelingrediens (4HT eller TEMED) resultere i fullstendig svikt i forsøket, enten på grunn av ufullstendig eller ingen gelering (overdreven 4HT) eller for tidlig gelering (overdreven TEMED, redusert 4HT eller tilsetning av APS før de andre komponentene). For å forhindre for tidlig gelering er det også nødvendig å oppbevare prøven og gelen ved 4 °C og utsettes for luft i 30 minutter og bare dekke prøven og plassere den ved 37 °C i et fuktet kammer etter at diffusjonsprosessen er fullført.
Når du konstruerer gelkammeret, er det viktig å inkludere avstandsstykker mellom de to ubelagte glassglassene, spesielt for tykkere vevsseksjoner som PFA-fast musehjerne. Mangel på avstandsstykker kan forårsake vevskompresjon, noe som resulterer i forvrengte bilder og unøyaktige data.
Prøvehomogeniseringen avhenger av fordøyelsestiden med fordøyelsesbufferen, samt fordøyelsesbufferens temperatur og sammensetning. Utilstrekkelig homogenisering kan forårsake forvrengninger og reduserte ekspansjonsfaktorer sammenlignet med rapportert verdi for en gitt vevstype. Hvis det er mistanke om ufullstendig homogenisering, kan fordøyelsestiden økes, spesielt når det gjelder tykkere vev.
Et enkelt, men avgjørende skritt er tilstrekkelig utvasking av SDS fra prøven med et ikke-ionisk overflateaktivt middel (som C12E10) etter homogeniseringstrinnet. Eventuell gjenværende SDS kan resultere i suboptimal eller helt hindret antistoffbinding. Heldigvis, hvis dette mistenkes, vil ytterligere vask og påføring av antistoffene ofte være en tilfredsstillende løsning.
Protokollen gir et kostnadseffektivt alternativ til dagens superoppløsningsbilder og elektronmikroskopiteknikker for å forhøre nanoskalastrukturer i forskjellige vevsprøver, inkludert i FFPE-kliniske prøver. Bruken av metakrolin og varmedenaturering tillater profilering etter ekspansjon av biomolekyler som er bevart under vevsfiksering (dette utelukker avbildning av lipider i FFPE-prøver, for eksempel). Vår protokoll, som en utvidelse av ExM-rammeverket, er modulær og sannsynligvis kompatibel med andre teknikker som optiske superoppløsningsmetoder (STED18, STORM19) eller iterativ ekspansjonsmikroskopi (iExM)15. Disse er imidlertid ennå ikke testet med den presenterte protokollen, og de store ekspansjonsfaktorene kan by på utfordringer, spesielt ved fluoroforforfortynning. I tillegg krever den store størrelsen på prøvene etter full ekspansjon i vann forsiktighet ved håndtering (selv om gelen som brukes her er mer motstandsdyktig enn tidligere ExM-gelformuleringer med høy ekspansjonsfaktor, for eksempel ti ganger robust ekspansjonsmikroskopi (TREx), for å håndtere feilsignaler17), og kreative løsninger er av og til nødvendig for å overføre og avbilde disse fullt utvidede gelene. For eksempel ved å bruke brede redskaper som et tynt plastark for å overføre de fullt ekspanderte gelene i stedet for en pensel, eller ved hjelp av skreddersydde store bildeplater (i våre hender betyr dette laserskårne eller 3D-printede plater med store biter av # 1.5 coverglass festet til bunnen; disse kan ses i den medfølgende videoen). Viktigst av alt, utvider denne metoden anvendeligheten av nanoskala avbildning ved å tillate nanoskala avbildning av vanlige biologiske og patologiske prøvepreparater på konvensjonelle bredfelt- eller konfokale mikroskoper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer følgende konkurrerende økonomiske interesser: Y.Z., A.K., Z.C. og B.R.G. oppfant flere oppfinnelser relatert til Magnify og ExM.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Carnegie Mellon University og DSF Charitable Foundation (YZ og XR), National Institutes of Health (NICH) Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01, og Kauffman Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
