Universell molekylær retensjon med 11 ganger ekspansjonsmikroskopi
Summary
Presentert her er en ny versjon av ekspansjonsmikroskopi (ExM), Magnify, som er modifisert for opptil 11 ganger ekspansjon, og bevarer et omfattende utvalg av biomolekylklasser, og er kompatibel med et bredt spekter av vevstyper. Det muliggjør undersøkelse av nanoskalakonfigurasjonen av biomolekyler ved hjelp av konvensjonelle diffraksjonsbegrensede mikroskoper.
Abstract
Nanoskala avbildning av biologiske prøver kan forbedre forståelsen av sykdomspatogenese. I de senere år har ekspansjonsmikroskopi (ExM) vist seg å være et effektivt og billig alternativ til optisk superoppløsningsmikroskopi. Imidlertid har det vært begrenset av behovet for spesifikke og ofte tilpassede forankringsmidler for å beholde forskjellige biomolekylklasser i gelen og av vanskeligheter med å utvide standard kliniske prøveformater, for eksempel formalinfiksert parafininnebygd vev, spesielt hvis større ekspansjonsfaktorer eller konserverte proteinepitoper er ønsket. Her beskriver vi Magnify, en ny ExM-metode for robust ekspansjon opptil 11 ganger i et bredt spekter av vevstyper. Ved å bruke metakorolin som det kjemiske ankeret mellom vev og gel, beholder Magnify flere biomolekyler, slik som proteiner, lipider og nukleinsyrer, i gelen, og tillater dermed bred nanoskalaavbildning av vev på konvensjonelle optiske mikroskoper. Denne protokollen beskriver beste praksis for å sikre robust og sprekkfri vevsutvidelse, samt tips for håndtering og avbildning av svært ekspanderte geler.
Introduction
Biologiske systemer utviser strukturell heterogenitet, fra lemmer og organer ned til nivåene av proteiner på nanoskala. Derfor krever en fullstendig forståelse av driften av disse systemene visuell undersøkelse på tvers av disse størrelsesskalaene. Imidlertid forårsaker diffraksjonsgrensen for lys utfordringer ved visualisering av strukturer mindre enn ~ 200-300 nm på et konvensjonelt fluorescensmikroskop. I tillegg presenterer optiske superoppløsningsmetoder 1,2,3, som stimulert utslippsuttømming (STED), fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM) og strukturert belysningsmikroskopi (SIM), selv om de er kraftige, sine egne utfordringer, da de krever dyr maskinvare og reagenser og ofte har langsomme oppkjøpstider og dårlig evne til å avbilde store volumer i 3D.
Ekspansjonsmikroskopi4 (ExM) gir et alternativt middel for å omgå diffraksjonsgrensen for lys ved kovalent forankring av biomolekyler i en vannsvulmende polymergel og fysisk trekke dem fra hverandre, og dermed gjøre dem oppløselige på konvensjonelle optiske mikroskoper. En rekke ExM-protokollvarianter har blitt utviklet siden den opprinnelige publiseringen av ExM for mindre enn et tiår siden, og disse protokollene tillater direkte inkorporering av proteiner 5,6,7, RNA 8,9,10 eller lipider11,12,13 inn i gelnettverket ved å endre det kjemiske ankeret eller utvide prøven ytterligere (og dermed forbedre den effektive oppløsningen) enten i et enkelt trinn14 eller flere iterative trinn15,16. Inntil nylig kunne ingen enkelt ExM-protokoll beholde disse tre biomolekylklassene med et enkelt kommersielt tilgjengelig kjemisk anker, samtidig som det ga en mekanisk solid gel som kunne utvide ~ 10 ganger i en enkelt ekspansjonsrunde.
Her presenterer vi Magnify17, et nylig tillegg til ExM-arsenalet som bruker metakrolin som biomolekylanker. Metakrotin danner kovalente bindinger med vev som for paraformaldehyd, slik at flere klasser av biomolekyler kan beholdes i gelnettverket uten å kreve forskjellige spesifikke eller tilpassede forankringsmidler. I tillegg kan denne teknikken utvide et bredt spekter av vev opptil 11 ganger, inkludert notorisk utfordrende prøver som formalinfast parafin-innebygd (FFPE) kliniske prøver. Tidligere metoder for å utvide slike mekanisk stive prøver krevde hard proteasefordøyelse, noe som gjorde antistoffmerkingen av proteiner av interesse umulig etter at prøven hadde blitt utvidet. I motsetning til dette oppnår denne teknikken utvidelse av FFPE kliniske prøver ved hjelp av en varm denatureringsløsning, og dermed bevare hele proteinepitoper i gelen, som kan målrettes for postekspansjonsavbildning (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi Magnify-protokollen17, en ExM-variant som kan beholde flere biomolekyler med et enkelt kjemisk anker og utvide utfordrende FFPE-kliniske prøver opptil 11 ganger med varmedenaturering. De viktigste endringene i denne protokollen som skiller den fra andre ExM-protokoller, inkluderer bruk av en omformulert gel som forblir mekanisk robust selv når den er fullstendig utvidet, samt bruk av metakrolin som biomolekylanker. De mest kritiske trinnene i denne protokollen er som følger: …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Carnegie Mellon University og DSF Charitable Foundation (YZ og XR), National Institutes of Health (NICH) Director’s New Innovator Award DP2 OD025926-01, og Kauffman Foundation.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
