Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع
Summary
يحدد هذا البروتوكول استخدام التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) لدمج الجينات (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للطحالب الدقيقة الخضراء Chlorella vulgaris ، مما يؤدي إلى إنتاج محولات مستقرة.
Abstract
يعمل التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) كأداة مستخدمة على نطاق واسع لمعالجة جينومات النبات. ومع ذلك ، تظهر A. tumefaciens القدرة على نقل الجينات إلى مجموعة متنوعة من الأنواع. تفتقر العديد من أنواع الطحالب الدقيقة إلى طرق راسخة لدمج الجينات ذات الأهمية بشكل موثوق في جينومها النووي. لتسخير الفوائد المحتملة للتكنولوجيا الحيوية للطحالب الدقيقة ، تعد أدوات معالجة الجينوم البسيطة والفعالة أمرا بالغ الأهمية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول AMT محسن لأنواع الطحالب الدقيقة الصناعية Chlorella vulgaris ، باستخدام بروتين الفلورسنت الأخضر المراسل (mGFP5) وعلامة مقاومة المضادات الحيوية ل Hygromycin B. يتم اختيار الطفرات من خلال الطلاء على وسائط Tris-Acetate-Phosphate (TAP) التي تحتوي على Hygromycin B و cefotaxime. يتم قياس التعبير عن mGFP5 عن طريق التألق بعد أكثر من عشرة أجيال من الزراعة الفرعية ، مما يشير إلى التحول المستقر لكاسيت T-DNA. يسمح هذا البروتوكول بتوليد موثوق به للعديد من مستعمرات C. vulgaris المعدلة وراثيا في أقل من أسبوعين ، باستخدام ناقل التعبير النباتي pCAMBIA1302 المتاح تجاريا.
Introduction
تمتلك Agrobacterium tumefaciens، وهي بكتيريا سالبة الجرام تنقلها التربة، قدرة فريدة على نقل الجينات بين المملكة، مما أكسبها لقب “مهندس وراثي طبيعي“1. يمكن لهذه البكتيريا نقل الحمض النووي (T-DNA) من البلازميد الذي يحفز الورم (Ti-Plasmid) إلى الخلايا المضيفة من خلال نظام إفراز من النوع الرابع ، مما يؤدي إلى تكامل الحمض النووي التائي والتعبير عنه داخل جينوم المضيف1،2،3،4. في البيئة الطبيعية ، تؤدي هذه العملية إلى تكوين الورم في النباتات ، والمعروف باسم مرض المرارة التاجية. ومع ذلك ، يمكن ل Agrobacterium أيضا نقل T-DNA إلى كائنات حية أخرى مختلفة ، بما في ذلك الخميرة والفطريات والطحالب وأجنة قنفذ البحر وحتى الخلايا البشرية في ظل ظروف المختبر5،6،7،8.
باستغلال هذا النظام الطبيعي ، يتيح التحول بوساطة Agrobacterium tumefaciens-mediation (AMT) التكامل العشوائي للجين (الجينات) ذات الأهمية في الجينوم النووي للخلية المضيفة عن طريق تعديل منطقة T-DNA في Ti-plasmid. لهذا الغرض ، فإن ناقل التعبير النباتي AMT المستخدم على نطاق واسع هو pCAMBIA13029. يمكن للباحثين استخدام تدفقات عمل استنساخ بسيطة في الإشريكية القولونية قبل نقل المتجه المطلوب إلى A. tumefaciens لنقله لاحقا إلى المضيف محل الاهتمام.
الطحالب الدقيقة الخضراء هي حقيقيات النوى التي تشترك في العديد من أوجه التشابه مع النباتات البرية ولكنها متمردة للغاية على التعديل الوراثي. ومع ذلك ، يلعب التحول الجيني دورا حاسما في كل من البحوث الأساسية والتكنولوجيا الحيوية للطحالب الدقيقة. في العديد من أنواع الطحالب الدقيقة ، وخاصة Chlamydomonas reinhardtii ، نجح التحول الجيني عبر AMT في إدخال جينات محورة مثل إنترلوكين -2 البشري (hIL-2) ، ومجال ربط مستقبلات فيروس كورونا 2 للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2 RBD) ، واثنين من الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) 10،11،12،13. من بين هذه الأنواع ، شلوريلا الشائع ، وهو نوع من الطحالب الخضراء أقل سرعة وأسرع نموا ، يحمل إمكانات كبيرة للإنتاج المستدام للكربوهيدرات والبروتينات والمغذيات والأصباغ وغيرها من المركبات عالية القيمة14. ومع ذلك ، فإن عدم وجود أدوات موثوقة لإنشاء سلالات معدلة وراثيا من C. vulgaris يعوق تقدمها التجاري. نظرا لوجود عدد محدود فقط من الأعمال المنشورة التي تستخدم AMT في C. vulgaris15 ، وبالنظر إلى الاختلافات الكبيرة بين زراعة النباتات والطحالب الدقيقة ، يصبح تحسين بروتوكول AMT ضروريا.
في هذه الدراسة ، أدخل الباحثون بروتين الفلورسنت الأخضر (mGFP5) في اتجاه مجرى فيروس فسيفساء القرنبيط (CamV) 35S المروج وأضافوا علامة الهستيدين لاستخدامها كجين مراسل للتعبير عن البروتين. تم اختيار المحولات باستخدام Hygromycin B ، وبعد الاستزراع الفرعي لأكثر من عشرين جيلا ، ظل التحول مستقرا. يمكن تكييف بلازميد pCAMBIA1302 المستخدم في هذا العمل بسهولة لاحتواء أي جين مهم. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل الطريقة والمواد المقدمة لأنواع الطحالب الخضراء الأخرى باستخدام مروج CamV35S نشط ، حيث يتم استخدام هذا المروج لاختيار Hygromycin.
Protocol
Representative Results
Discussion
ترتبط كفاءة التحول بعدة معايير مختلفة. يعد اختيار سلالات A. tumefaciens المستخدمة في AMT أمرا بالغ الأهمية. AGL-1 هي واحدة من أكثر السلالات الغازية المكتشفة ، ولهذا السبب ، تم استخدامها بشكل روتيني في نبات AMT. يعد استكمال وسائط الحث بالجلوكوز (15-20 مللي مول) مهما أيضا لكفاءة AMT. بالنظر إلى أن C. vulga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا البروفيسور بول هويكاس على تفضله بتوفير ناقل pCAMBIA1302 و Agrobacterium tumefaciens AGL1 من معهد علم الأحياء في ليدن ، جامعة ليدن ، هولندا. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا إيفا كوليك على مساعدتها في زراعة محولات الفلورسنت. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا وبرنامج Mitacs Accelerate.
Materials
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023)
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
