Summary
Denne undersøgelse beskriver decellulariseringsbaserede metoder til visualisering og kvantificering af intramuskulært fedtvæv (IMAT) aflejring gennem intakt muskelvolumen samt kvantificering af målinger af individuelle adipocytter, der omfatter IMAT.
Abstract
Fedtinfiltration er akkumulering af adipocytter mellem myofibre i skeletmuskulatur og er et fremtrædende træk ved mange myopatier, stofskifteforstyrrelser og dystrofier. Klinisk i humane populationer vurderes fedtinfiltration ved hjælp af ikke-invasive metoder, herunder computertomografi (CT), magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og ultralyd (US). Selvom nogle undersøgelser har brugt CT eller MR til at kvantificere fedtinfiltration i musemuskler, er omkostninger og utilstrækkelig rumlig opløsning fortsat udfordrende. Andre smådyrsmetoder bruger histologi til at visualisere individuelle adipocytter; Denne metode lider imidlertid af prøveudtagningsbias i heterogen patologi. Denne protokol beskriver metoden til kvalitativt at se og kvantitativt måle fedtinfiltration omfattende gennem intakt musemuskel og på niveau med individuelle adipocytter ved hjælp af decellularisering. Protokollen er ikke begrænset til specifikke muskler eller specifikke arter og kan udvides til menneskelig biopsi. Derudover kan grove kvalitative og kvantitative vurderinger foretages med standard laboratorieudstyr til lave omkostninger, hvilket gør denne procedure mere tilgængelig på tværs af forskningslaboratorier.
Introduction
Akkumuleringen af adipocytter mellem myofibre i skeletmuskulaturen er et fremtrædende træk ved forskellige tilstande, fra type 2-diabetes til sarkopeni til muskuloskeletale skader 1,2,3,4,5,6,7. Omfattende vurdering af dette intramuskulære fedtvæv (IMAT) er afgørende for at forstå patogenesen af disse tilstande, da IMAT-aflejring er stærkt korreleret med insulinresistens 3,8,9,10 og dårlig skeletmuskelfunktion 11,12,13,14,15 . Selv om disse sammenhænge er blevet bemærket i årtier, er de mekanismer, der er forbundet med og oprindelsen af IMAT, stadig et område, hvor IMAT undersøges intenst. Dette skyldes dels, at de fleste undersøgelser, der vurderer skeletmuskulaturens fedtinfiltration, er blevet udført hos mennesker, hvor mekanistiske undersøgelser er begrænsede16,17. Men for nylig er små dyremodeller, herunder mus, blevet brugt til at hjælpe med at lokalisere cellulær regulering af IMAT-udvikling og signalering18,19,20. Dette arbejde har til formål at give et nyt værktøj til brug med små dyremodeller til kvalitativ visualisering og kvantificering af skeletmuskulaturens fedtinfiltration.
Klinisk i humane populationer vurderes fedtinfiltration ved hjælp af ikke-invasive metoder, herunder computertomografi (CT) 6,21, magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) 16,17,22,23 og ultralyd (US) 17,24. Disse billeddannelsesteknikker identificerer typisk et defineret interesseområde (ROI) i en muskel og erhverver billedskiver inden for denne region, selvom omfattende tilgange også er blevet anvendt25,26,27. Disse billedudsnit underkastes kvalitativ klassificering6 og kvantificeres via pixeltærskel28. Lignende metoder er blevet anvendt hos dyr, der tidligerevar 29,30; De er dog dyre og kræver adgang til billeddannelsessystemer til små dyr. Rumlig opløsning via CT- og MR-brug udgør også et stort problem, da de ikke er i stand til at afgrænse IMAT-adipocytter fra skeletmuskelfibre inden for en voxel og i stedet stole på subjektiv adskillelse af primært muskelregioner og primært IMAT-regioner31,32. Som sådan præsenterer manglende evne til nøjagtigt at identificere fedt eller muskelvæv også unøjagtig kvantificering af repræsentative mængder af disse væv.
På grund af disse begrænsninger er nuværende teknikker til vurdering af skeletmuskulaturfedtinfiltration i små dyremodeller oftest afhængige af histologi som et billigt og tilgængeligt alternativ33,34. Standardfarvningsprocedurer, herunder hæmatoxylin og eosin (H&E), olierød O (ORO) og immunfarvning til adipocytmarkører såsom perilipin, muliggør enkel påvisning og visualisering af adipocytter, der omfatter fedtinfiltration i musklen. Imidlertid er histologiske tilgange sjældent omfattende, og typisk er IMAT kvalitativ eller kvantitativ vurdering begrænset til et enkelt afsnit34. Lipidekstraktion er også blevet brugt til at kvantificere samlede muskellipider35; Denne teknik skelner imidlertid ikke mellem intramyocellulært lipid (IMCL) og intramuskulært fedtvæv (IMAT) lagre36. Sammenfattende er de nuværende metoder til at visualisere og kvantificere fedt i muskler fortsat begrænset enten af økonomiske omkostninger eller den specifikke påvisning af IMAT.
Her beskriver vi en detaljeret metode til vurdering af skeletmuskulaturens fedtinfiltration både ved kvalitativ visualisering og kvantificering i flere skalaer. Denne metode anvender en simpel decellulariseringsteknik, der fjerner myocellulære strukturer, herunder IMCL, men holder de større IMAT-adipocytafledte lipiddråber intakte. Validering af specificiteten af denne teknik er blevet offentliggjort37, herunder anvendelse af lipidekstraktion til at vise udtømning af IMCL med decellularisering, μCT til at vise tilbageholdelse af IMAT-mønster med decellularisering og histologi til at vise den tilsvarende størrelsesfordeling af IMAT-lipiddråber sammenlignet med dem, der er identificeret med decellularisering. Når de er decellulariseret, kan musklerne farves med lipidopløselige farvestoffer til kvalitativ visualisering af mønsteret og omfanget af fedtinfiltration og / eller kvantitativ billeddannelse af individuelle IMAT-lipiddråber. Farvestoffer kan efterfølgende ekstraheres med isopropanol, og den optiske densitet (OD) af den resulterende opløsning kan anvendes til at estimere IMAT-lipidvolumenet. Den strenge validering af denne teknik er offentliggjort andetsteds37. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til brug af denne metode med musemuskler og giver fejlfindingstip til at understøtte vedtagelsen af denne metode i andre applikationer, såsom muskler fra andre arter eller andet væv.
Protocol
Pleje og ofring af mus blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for the Use and Care of Laboratory Animals. Alt arbejde blev godkendt af Animal Studies Committee ved Washington University i St. Louis School of Medicine. C57BL/6J-hanmus i alderen 2-3 måneder (se materialetabel) blev brugt til at generere eksempelbillederne i denne protokol. Alle trin beskrevet nedenfor udføres ved stuetemperatur.
1. Muskel decellularisering
- Der fremstilles en 1% w/v natriumdodecylsulfatopløsning (SDS; se materialetabel) i fosfatbufret saltvand (PBS). Rør opløsningen, indtil den er helt blandet.
BEMÆRK: 1% SDS kan fremstilles i bulk og opbevares ved stuetemperatur i 1 måned. - Dissekere den eller de relevante muskler som beskrevet tidligere38,39.
- Udsæt de interessante muskler ved at fugte hår og hud med 70% ethanolopløsning, og lav derefter et transkutant snit på ca. 2 cm efterfulgt af fjernelse af dækhuden med tang og fjedersaks.
BEMÆRK: De muskler af interesse her omfatter tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL) og membran. Nogle muskler kan ligge dybt i andre muskler, hvilket kræver dissektion af andre muskler (f.eks. Dissekering af EDL kræver fjernelse af TA). - Dissekere den eller de relevante muskler ved hjælp af skarpe sakse eller knive (se materialetabellen) for at sikre, at hele muskelens omfang opnås, og kanterne er glatte.
BEMÆRK: Dette gøres ideelt under et dissekerende mikroskop for at forbedre visualiseringen. - Undersøg musklerne for at sikre, at ingen knoglechips eller ujævne kanter er inkluderet, og trim derefter disse væk med skarpe saks efter behov.
- Vej musklen ved hjælp af en analytisk vægt og registrer vægten.
- Udsæt de interessante muskler ved at fugte hår og hud med 70% ethanolopløsning, og lav derefter et transkutant snit på ca. 2 cm efterfulgt af fjernelse af dækhuden med tang og fjedersaks.
- Placer den dissekerede muskel i mindst 0,1 ml 1% SDS pr. Milligram vægt; 6-, 12- eller 24-brøndsplader fungerer godt til henholdsvis membran-, TA- og EDL-musemusklerne. Typiske volumener er 6 ml, 3 ml og 1,5 ml for henholdsvis 6-, 12- og 24-brøndplader.
BEMÆRK: SDS-opløsningen vil undertiden få musklerne til at deformere, så sørg for, at musklen er flad / forlænget ved første nedsænkning. - Placer brøndpladen (eller andre beholdere) på en gyngeryster indstillet til 50-80 Hz.
- Undersøg SDS-opløsningen visuelt med jævne mellemrum. Når opløsningen bliver overskyet, skal du fjerne opløsningen med en pipette (pas på ikke at aspirere musklen) og erstatte den med et lige stort volumen frisk 1% SDS. Når opløsningen forbliver klar i 24 timer, er decellulariseringen afsluttet.
BEMÆRK: Den hyppighed, der kræves til opløsningsændringer, varierer efter muskelstørrelse og det oprindelige opløsningsvolumen. Større muskler som TA har brug for nyt SDS inden for få timer, og mindre muskler som EDL kan gå natten over i den originale løsning. - Fjern den endelige SDS-opløsning fra de decellulariserede muskler med en pipette (pas på ikke at aspirere musklen) og erstat den med et tilsvarende volumen PBS.
- Undersøg visuelt de decellulariserede muskler under et dissekerende mikroskop og brug tang og saks til at fjerne hår eller snavs, der sidder fast på musklen.
BEMÆRK: Bemærk også klarheden af den decellulariserede muskel i dette trin. Hvis den decellulariserede muskel ikke er fuldt gennemsigtig, og SDS-opløsningen ikke stiger i uklarhed over 24 timer, var decellulariseringen ikke effektiv. Dette skaber en artefakt i kvalitative og kvantitative vurderinger, og derfor bør decellularisering altid optimeres på praksisprøver, før man fortsætter med eksperimentelle muskler. - Fjern forsigtigt PBS, udskift det med et lige stort volumen 3,7% formaldehyd eller 4% paraformaldehydopløsning, og returner pladen til gyngerysteren i 24 timer.
BEMÆRK: Sørg for, at formaldehydopløsningen fuldt ud dækker den decellulariserede muskel, ellers vil farvningen være ujævn.
2. Visualisering af IMAT med olierød O
- Forbered en opløsning af ORO.
- 0,5 g ORO-pulver (se materialetabellen) opløses i 100 ml isopropanol for at generere en stamopløsning.
BEMÆRK: Tilsæt let varme til opløsningen for at opløse den helt. Denne bestand kan opbevares ved stuetemperatur i 1 måned. - Kombiner ORO-stamopløsningen og deioniseret vand i forholdet 60:40 for at opnå den arbejdsløsning, der er nødvendig for alle muskler ved hjælp af et volumen på mindst 0,1 ml / mg muskelvægt. Typiske volumener er 6 ml, 3 ml og 1,5 ml for henholdsvis 6-, 12- og 24-brøndplader.
BEMÆRK: Undersøg stamopløsningen før blanding. Hvis stamopløsningen indeholder betydelige partikler, skal der laves frisk lager. - Dæk arbejdsløsningen til i 10 minutter for at lade partiklerne bundfælde sig.
- Arbejdsløsningen filtreres gennem et 40 μm net efterfulgt af et 0,22 μm sprøjtefilter.
BEMÆRK: 0,22 μm sprøjtefilteret tilstoppes hurtigt og skal udskiftes, hvis arbejdsløsningen ikke skubber let igennem.
- 0,5 g ORO-pulver (se materialetabellen) opløses i 100 ml isopropanol for at generere en stamopløsning.
- Formaldehyd- eller paraformaldehydopløsningen fjernes, og de decellulariserede muskler vaskes med tre opløsningsændringer af et lige så stort volumen PBS.
- PBS udskiftes med et tilsvarende volumen 60% isopropanolopløsning og inkuberes på en vipperyster i 5 min.
- Udskift 60% isopropanolopløsningen med ORO-arbejdsløsningen, og inkuber på vipperysteren i 10 minutter.
BEMÆRK: Sørg for, at ORO-arbejdsløsningen dækker den decellulariserede muskel fuldt ud, ellers vil farvningen være ujævn. - Udskift ORO-arbejdsløsningen med et tilsvarende volumen på 1% SDS. Undersøg SDS-opløsningen visuelt med jævne mellemrum. Når opløsningen bliver mærkbart lyserød, skal du fjerne opløsningen med en pipette (pas på ikke at aspirere musklen) og erstatte den med frisk 1% SDS.
- Når opløsningen forbliver klar i 24 timer, skal du udskifte 1% SDS med PBS og inspicere den farvede muskel under et dissekerings-/stereomikroskop ved 4x forstørrelse. Fjern eventuelle åbenlyse snavs eller partikler, der sidder fast på ydersiden af musklen. Hvis dette er omfattende, kan den decellulariserede muskel rulles forsigtigt på et rengøringsvæv for at trække snavs / partikler af.
- Hvis farvningen er tilfredsstillende (lyse røde kugler, der flyder i en gennemsigtig matrix), skal du tage billeder af farvningen som ønsket ved hjælp af et kamera, der er fastgjort til stereomikroskopet (se materialetabel).
BEMÆRK: Hvis dissekeringsmikroskopet ikke har et tilsluttet kamera, kan et telefonkamera bruges til at tage billeder gennem okularet.
3. Visualisering af IMAT lipiddråber med BODIPY
BEMÆRK: Konfokal billeddannelse er mest effektiv med tynde muskler som EDL eller membran (~ 2 mm tykkelse). Alternativt kan sammenlignelige tykkelsesstrimler af muskler som TA anvendes.
- Forbered en 1:200 opløsning af fluorescerende BODIPY 493/503 (se materialetabel) i PBS for at opnå et arbejdsopløsningsvolumen på mindst 0,1 ml / mg muskelvægt. Typiske volumener er 6 ml, 3 ml og 1,5 ml for henholdsvis 6-, 12- og 24-brøndplader.
- Fjern formaldehyd, paraformaldehyd eller 1% SDS og vask de decellulariserede muskler med tre opløsningsændringer af et lige stort volumen PBS.
- Udskift PBS med BODIPY arbejdsløsningen og inkuber på vipperysteren i 20 minutter.
- De decellulariserede muskler vaskes med tre opløsningsændringer af et lige så stort volumen PBS.
- Placer musklen i et klarbundet kar, der er kompatibelt med et tilgængeligt konfokalmikroskop. Ideelt set vil skålen have en forsænket bund for at placere et dæksel over musklen uden at deformere den (se materialetabel).
- Få billedstakke med et standard konfokalmikroskop (se materialetabel) ved hjælp af 488-laseren. Typiske stakstørrelser for en EDL er 0,5-1 mm med en skivetykkelse på 10 μm, hvilket giver 50-100 billeder pr. stak.
BEMÆRK: For at kvantificere det samlede lipidvolumen, det samlede antal IMAT-lipiddråber og det nærmeste naboindeks for klyngedannelse, billede gennem hele muskelvolumen, og sørg for at efterlade noget overlap til billedregistrering. For at kvantificere det gennemsnitlige lipiddråbevolumen kan en stak være tilstrækkelig. - Hvis det ønskes, pletter du musklerne med ORO, som beskrevet i afsnit 2, for et gratis helmuskelbillede af IMAT distribution.
BEMÆRK: Fordi BODIPY er fluorescerende, vil det ikke være synligt under lysmikroskopet, når billeder af ORO erhverves.
4. Estimering af total lipidvolumen ved lipidekstraktion
- Efter billedoptagelse overføres musklerne til 200 μL isopropanol i individuelle brønde i en 96-brøndplade, eller brønden / volumenet tilpasses, hvis musklen er for stor til at passe.
- Opløsningen omrystes ved at banke på pladen, pipettere opløsningen op og ned og/eller mekanisk knuse musklen med en pipettespids, indtil der ikke kan ses røde/fluorescerende kugler i den decellulariserede muskel under et mikroskop.
BEMÆRK: Behandl alle musklerne med den samme kombination af bankning, pipettering og knusning for den bedste pålidelighed. Sørg også for at begrænse den tid, der bruges på at tappe, pipettere og knuse, da isopropanol vil fordampe hurtigt. - Opløsningen blandes i hvert hul ved pipettering op og ned, og der overføres derefter 75 μL til to rene huller på pladen.
- Pladen tildækkes, og absorbansen af de dobbelte 75 μl brønde aflæses ved hjælp af et spektrofotometer eller en pladelæser. Hvis konstruktionen blev farvet med ORO, skal du læse opløsningen ved 500 nm; hvis det var farvet med BODIPY 493/503, aflæses pladen ved 493 nm.
BEMÆRK: Hvis konstruktionen blev farvet med både BODIPY og ORO, anbefales det at læse pladen ved 500 nm, da 500 nm aflæsninger giver lignende resultater mellem konstruktioner farvet med ORO kun og ORO plus BODIPY. - Absorbansaflæsningen divideres med muskelens registrerede vægt, hvis det ønskes, for at korrigere for størrelsesforskelle mellem prøverne.
5. Kvantificering af IMAT lipiddråbemålinger fra konfokale billeder
BEMÆRK: Dette afsnit kræver adgang til ImageJ version 1.47 (se materialetabel) eller nyere og grundlæggende ImageJ-færdigheder40.
- Åbn konfokale stakke i ImageJ.
BEMÆRK: Forskellige konfokale mikroskoper kan gemme konfokale billeder i forskellige formater. ImageJ kan kræve et ekstra plugin eller en variant, såsom Fiji, for at åbne stakkene41. De anvendte algoritmer er en del af ImageJ-softwarepakken. - Kør en tærskelalgoritme i ImageJ for at identificere BODIPY-positive pixels. Dette konverterer det aktuelle billede til et binært billede.
- Åbn tærskelbrugergrænsefladen ved at vælge Billede > Juster > tærskel. I brugergrænsefladen skal du vælge Intermodes som tærskeltype og sikre, at Mørk baggrund er valgt. Det er ikke nødvendigt at vælge andre indstillinger. Klik derefter på Anvend.
- Der åbnes en dialogboks, hvor stakken konverteres til binær. Sørg for, at følgende indstillinger er valgt: Metode: Intermodes; Baggrund: Mørk. Beregn tærsklen for hvert billede og sort baggrund (af binære masker). Dette genererer en binær stak, hvor hvid angiver BODIPY positive pixels og sort angiver BODIPY negative pixels.
BEMÆRK: Intermodes-tærskelalgoritmen er muligvis ikke det bedste valg for alle brugere. Subjektiv inspektion af de indbyggede tærskelindstillinger i ImageJ hjælper med at vælge den optimale algoritme til adskillelse af BODIPY positive og negative pixels.
- Kør Watershed algoritmen i ImageJ for at adskille rørende lipiddråber. Vælg Proces > binær > vandskel. Der åbnes en dialogboks, hvor du bliver spurgt, om alle billeder i stakken skal behandles. Vælg Ja. Dette tilføjer tynde sorte linjer, der deler større områder med konstant hvidt.
- Identificer ROI'er med algoritmen Analysér partikler i ImageJ.
- Vælg Analysér > Analysér partikler. Der åbnes en dialogboks, hvor du kan angive indstillingerne for markering.
BEMÆRK: Valg af størrelsesinterval er afgørende for at opnå det bedste skøn over lipiddråbe-ROI'er. Den nedre grænse eliminerer regioner, der sandsynligvis er for små til at være IMAT-afledte lipiddråber (baggrundsartefakt), og den øvre grænse eliminerer regioner, der sandsynligvis er for store til at være enkelte IMAT-afledte lipiddråber (berøring af lipiddråber, der ikke blev adskilt af Watershed algoritmen). - For at indstille disse værdier skal du åbne det originale billede og skitsere den mindste og største lipiddråbe, der vises, ved hjælp af det ovale værktøj. Føj derefter disse figurer til ROI-manageren ved at skrive "t". Vælg Analysér og derefter Indstil målinger. Der åbnes en dialogboks, hvor indstillingerne kan vælges.
- Kontroller kun område , og klik på OK. Vælg derefter Mål fra ROI-styringen. Brug de to arealmålinger fra dette resultatvindue som størrelsesinterval i Analysér partikler.
- Sørg for , at Føj til Manager er markeret. Ingen andre muligheder er nødvendige.
- Vælg Analysér > Analysér partikler. Der åbnes en dialogboks, hvor du kan angive indstillingerne for markering.
- Overlejr ROI'erne på den konfokale stak ved at markere Vis alle i ROI Manager. Brug skyderen til at undersøge hvert stakudsnit enkeltvis og tilføje manglende områder manuelt ved hjælp af ovalværktøjet (findes på værktøjslinjen ImageJ).
- Udskriv ROI-målingerne. Vælg Analysér > Indstil målinger , og vælg Område, Centroid, Tilpas ellipse og Stakposition. Klik på OK. Vælg derefter Mål fra ROI-styringen. Dataene i resultattabellen kan vælges og kopieres til Matlab eller Excel til yderligere analyse.
- Finjuster ROI'erne i hver stak til et enkelt investeringsafkast ved hjælp af Refine.m Matlab-kode37 eller en lignende algoritme.
BEMÆRK: Dette trin er påkrævet, da trin 5.2-5.4 identificerer den samme lipiddråbe i tilstødende skiver som forskellige ROI'er. Investeringsafkast kan dog alternativt kun identificeres manuelt, eller duplikerede ROI'er kan elimineres manuelt i ImageJ for at undgå behovet for Matlab. - Få oversigtsstatistikken i ROI ved hjælp af Matlab eller Excel.
- Anslå det samlede antal lipiddråber som det samlede antal ROI'er.
- Anslå lipiddråbevolumen som volumenet af ellipsen monteret på hver 2D ROI, forudsat at dybden af formen er gennemsnittet af ellipsens større og mindre akser.
- Anslå det samlede lipidvolumen, som er summen af individuelle estimerede lipiddråbevolumener.
Representative Results
Kvalitativ visualisering af skeletmuskulaturens fedtinfiltration
Korrekt decellulariserede muskler er hvide og halvgennemsigtige (afsnit 1; Figur 1). Når decellulariserede muskler farves med ORO for at visualisere IMAT (afsnit 2), er IMAT lipiddråber synlige i de klare muskelstrukturer som røde kugler (figur 1). Sunde musebagbensmuskler har lidt naturlig IMAT, hvilket fremgår af lidt eller ingen rødt, ORO-positivt lipid (figur 1A). Til sammenligning injiceres bagbensmuskler med kardiotoksin (CTX; Figur 1B) eller glycerol (GLY; Figur 1C) 14 dage før decellularisering har en øget akkumulering af IMAT, med en større koncentration af IMAT efter CTX sammenlignet med GLY som tidligere nævnt37.
Ufuldstændig decellularisering kan identificeres umiddelbart efter indledende SDS-behandling eller efter udvaskning af ORO-farvningen som semi-uigennemsigtige, lyserøde fibre (figur 2B sammenlignet med figur 2A). Ufuldstændig clearance af ORO kan identificeres efter ORO-udvaskning som en lyserød eller rød ensartet baggrund snarere end forskellige fiberlinjer (figur 2C). Figur 2A, B indeholder også epimuskulært fedt (stjerner), en klump lipiddråber uden for den decellulariserede muskel. Figur 2C viser også den muskelfoldning, der kan opstå, hvis musklerne ikke spredes ud under decellularisering. Ufuldstændig decellularisering, ufuldstændig ORO-clearance og resterende epimuskulær fedt øger alle kunstigt (OD) af ekstraheret lipid, men hindrer ikke nødvendigvis kvalitativ vurdering af fedtinfiltration, hvis de anerkendes som en artefakt.
Kvantitativ billeddannelse af skeletmuskulatur fedtinfiltration
BODIPY fluorescerende mærkede lipiddråber kan afbildes via konfokal mikroskopi for en mere detaljeret vurdering af individuelle lipiddråbemålinger og fordeling (figur 3). Denne proces er halvautomatisk, som tidligere beskrevet, herunder Matlab-kode37. God BODIPY-farvning resulterer i lyse elliptiske former, der er afgrænset fra nabofigurer, når de afbildes i plan (figur 3A). Tærskel- og formsegmentering giver et godt første pas til generering af ROI'er for hver lipiddråbe (figur 3B), men manuelle redigeringer er nødvendige for at rette fejl. Den mest gennemgribende fejl er lipiddråber, der er dybt inde i vævet og dermed ikke er lyse på nogen skiver (figur 3B; lyserøde dobbeltpile). Dette kan afhjælpes ved at tilføje ROI'er manuelt ved hjælp af det ovale værktøj i ImageJ (figur 3C). Den anden er at identificere en gruppe lipiddråber som en enkelt ROI (figur 3B; rød stjerne). Dette kan rettes ved at slette og erstatte det oprindelige investeringsafkast med flere nye investeringsafkast (figur 3D). Endelig identificeres en enkelt lipiddråbe som en unik ROI i flere skiver, så de duplikerede ROI'er skal konsolideres i en enkelt ROI (figur 3E; blå pil). Dette gøres nemmest ved hjælp af et databehandlingsværktøj som Matlab, men kan også gøres manuelt ved at identificere den største ROI og slette resten. Gennemsnitsværdier for hver måling i C57BL6/J og 129Sv-musen findes i Biltz et al.37.
Figur 1: Eksempel olie rød O (ORO) farvning af decellulariserede muskler. ORO-farvede muskler 14 dage efter injektion med saltvand (SAL), kardiotoksin (CTX) eller glycerol (GLY). Mus extensor digitorum longus (EDL) og tibialis anterior (TA) muskler har lidt IMAT (røde kugler) med SAL behandling (A), men akkumulerer IMAT som reaktion på CTX (B) og GLY (C) behandling. Der er en fuldstændig decellularisering og ORO-udvaskning, hvilket fremgår af forskellige ORO-positive lipiddråber i en gennemsigtig hvid muskelbaggrund. Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksempler på dårlige ORO-farvningsresultater. Ufuldstændig decellularisering eller ufuldstændig ORO-clearance fører til en semi-uigennemsigtig lyserød / rød baggrund. Sammenlignet med den gennemsigtige hvide baggrund af fuldt decellulariseret musemembranmuskel (A) er ufuldstændig decellularisering kendetegnet ved lyserøde / røde fiberspor (B), og ufuldstændig ORO-clearance er kendetegnet ved en diffus lyserød / rød baggrund (C). Skalastænger: øverste paneler = 1 mm; nedre paneler = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksempler på individuel lipiddråbeidentifikation med fluorescerende BODIPY farvning og konfokal mikroskopi Individuelle BODIPY farvede lipiddråber kan identificeres og kvantificeres i decellulariserede muskler ved hjælp af konfokal mikroskopi. Individuelle skiver gennem en konfokal stak viser lipiddråber i plan som lyse grønne ellipser og lipiddråber ud af plan som svagere former (A; blå pile). Tærskelværdi kombineret med segmentering af vandskelsobjekter og ROI-identifikation kan kortlægge BODIPY-farvede ROI'er (B). Tærskelværdier kan gå glip af nogle svagere lipiddråber (B; lyserød dobbeltpil), der kræver identifikation i hånden (C). Vandskelssegmentering kan gruppere flere lipiddråber sammen (B; rød stjerne), hvilket kræver sletning af ROI og re-estimering i hånden (D). Den samme lipiddråbe identificeres i flere skiver, der kræver billedregistrering (E) for at slette de duplikerede ROI'er. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dette manuskript beskriver metoder til kvalitativt at visualisere og kvantificere skeletmuskulaturens fedtinfiltration i små dyremodeller, der kan anvendes til yderligere forståelse af patogenesen af intramuskulær fedtvæv (IMAT) udvikling og patologisk ekspansion. Brugen af helmuskeldecellularisering og lipidopløselig farvning giver mulighed for en omkostningseffektiv, reproducerbar og enkel metode til omfattende vurdering af tilstedeværelsen af IMAT i hele muskler.
Grundlaget for denne protokol er, at decellularisering af muskler med SDS fjerner de cellulære komponenter i myofibre, herunder de små lipiddråber af IMCL, men skåner de store lipiddråber i intramyocellulære adipocytter. SDS er blevet brugt i vid udstrækning42 i vævsteknik til at decellularisere matricer. Væv som fedt og skeletmuskulatur kræver typisk yderligere mekanisk dissociation og / eller alkoholekstraktion for at fjerne det resterende adipocytlipid42,43. Vi har tidligere vist, at dette skyldes, at mens decellularisering med SDS eliminerer IMCL, skåner det den store lipiddråbe i adipocytter37. Billeddannelse af osmiumtetroxidfarvet intakt muskel før og efter decellularisering med μCT verificerede, at det rumlige mønster af IMAT ikke blev forstyrret af decellularisering. Endvidere var intramuskulær triglyceridkvantificering i en decellulariseret muskel med ubetydelig IMAT ~5% af de intakte muskelværdier, hvilket verificerede fjernelsen af IMCL. Derfor bevarer denne metode IMAT-lipiddråber i deres oprindelige anatomiske fordeling gennem en halvgennemsigtig muskelmatrix.
Korrekt decellularisering er det mest kritiske trin i denne protokol. Hvis decellulariseringen er ufuldstændig, vil IMAT-lipiddråber være vanskelige at visualisere, og resterende IMCL vil forårsage høj baggrundsfarvning med enten ORO eller BODIPY (figur 2). Almindelige fejl hos uerfarne brugere er utilstrækkelig SDS-dækning pr. muskel (inden for hver brønd), således at hver muskel ikke er helt dækket af SDS-opløsning, ikke bruger en vipper til at agitere opløsningen under decellularisering og ikke udfører opløsningsændringer ofte nok. I dette manuskript har vi anbefalet den nødvendige mængde SDS pr. muskelmasseenhed, men brugeren skal stadig sikre, at musklerne er fuldstændigt dækket af løsninger, da hver muskel har en unik geometri. Brugere anbefales også at ændre løsningerne liberalt (så meget som to gange om dagen) for at sikre, at decellularisering er afsluttet. Farvning af IMAT-lipiddråber af god kvalitet er opnået efter så mange som 4 dages SDS-behandling. For ORO-farvningsresultater af høj kvalitet er tilstrækkelig fiksering og forberedelse af ORO-opløsning også vigtig. I lighed med SDS-behandlingen beskrevet ovenfor er der behov for tilstrækkelig dækning af 3,7% formaldehydopløsning for hver muskelprøve. Hvis musklen fjernes fra fikseringsmidlet for tidligt, vil lipiddråber kun svagt plette med ORO. I alt 1-2 timer bør være tilstrækkeligt, men natten over anbefales fiksering for at sikre, at fikseringsmidlet trænger ind i midten af musklen og løser alle lipiddråber fuldt ud. En yderligere udfordring med ORO-farvning er, at når alkoholkoncentrationen reduceres til 60%, begynder der at dannes partikler. Disse partikler kan slå sig ned på overfladen og sidde fast på muskelgrænsen. Den bedste måde at undgå dette på er at lave en frisk arbejdsløsning til hver farvning og bruge både 40 mesh μm og 0,22 μm filtre. Derefter vil opretholdelse af omrøring med vipperen og begrænsning af farvningstiden til 10 minutter hjælpe med at forhindre, at eventuelle partikler, der dannes, sætter sig. Hvis problemet fortsætter, kan det hjælpe at lave en frisk ORO-lagerløsning. Hvis nogle artefakter forbliver fast på den decellulariserede muskeloverflade, kan et stereomikroskop, tang og kirurgisk saks bruges til at fjerne denne artefakt. Undladelse af at eliminere artefakter vil påvirke billedkvaliteten af muskler og overvurdere IMAT-indhold under lipidekstraktionsdelen som forberedelse til OD-læsning.
Samlet set er denne teknik ligetil og giver flere fordele i forhold til guldstandardmetoder til visualisering og kvantificering af skeletmuskulaturfedtinfiltration. Ikke-invasive teknikker, såsom CT, MR og US, som anvendes i vid udstrækning hos mennesker og undertiden i dyremodeller, har begrænset rumlig opløsning og er ude af stand til at skelne lipiddråber fra muskelfibre. Således tildeles en pixel eller voxel med mellemliggende signalintensitet som "muskel" eller "fedt", mens det i virkeligheden sandsynligvis er en blanding af myofibre og adipocytter. Mere almindeligt vurderes fedtinfiltration i dyremuskler ved histologi, oftest ved ORO i muskelkryosektioner. Dette udføres dog typisk kun i et enkelt repræsentativt afsnit og er vanskeligt at kvantificere på grund af lipidspredning over sektionen. I modsætning hertil giver ORO-farvning af en hel decellulariseret muskel en omfattende vurdering af IMAT med lignende omkostninger og indsats som intakt morfologi. Ud over at forbedre visualiseringen muliggør ORO-farvning af decellularisering desuden kvantificering af fedtinfiltration ved lipidekstraktion. For et dybere dykke ned i funktionerne ved fedtinfiltration kan en fluorescerende plet, BODIPY, bruges sammen med konfokal mikroskopi. Dette gør det muligt at rekonstruere individuelle IMAT-lipiddråber for at kortlægge 3D-landskabet, hvilket ikke er muligt med histologi, medmindre sektioner analyseres over muskelens længde. Mens et konfokalmikroskop ikke er standard laboratorieudstyr, er det mere sandsynligt, at det er tilgængeligt på et universitet eller i industrien end MR eller CT for små dyr. Desuden kan meget af denne proces automatiseres, hvilket reducerer tidsomkostningerne sammenlignet med sekventiel histologi. Optimering af indstillingerne på det konfokale mikroskop er en yderligere overvejelse for BODIPY-farvning. Disse er unikke for hvert mikroskop. Den kritiske værdi er laserintensitet, som skal være høj nok til at detektere lipiddråberne på den fjerne overflade af musklen, samtidig med at signalet fra lipiddråberne på forsiden ikke mættes. På grund af dette foreslås det, at brug af BODIPY-farvning med konfokalmikroskopi er bedst egnet på tyndere muskler, herunder EDL eller membran.
Flere begrænsninger ved denne tilgang fortjener diskussion. For det første, mens det forventes, at denne teknik har bred anvendelighed ud over skademodeller (kardiotoksin og glycerol) hos mus, der præsenteres her, kan nye applikationer (f.eks. MDX-modellen) kræve optimering, da muskelens størrelse og sammensætning (f.eks. fibrose) kan påvirke decellularisering, hvilket kræver øget SDS-koncentration eller inkubationstider. Andre sygdomsmodeller med ændret muskelmasse ville også kræve analyse af både absolutte og normaliserede (til muskelmasse) målinger af fedtinfiltration for at bestemme den absolutte mængde lipid eller procentdel af lipid i forhold til muskelvolumenet for at give et mere meningsfuldt resultatmål. Desuden forventes denne teknik at være bredt anvendelig til større dyremodeller og humane biopsier, men dette kan kræve optimering for hver ny applikation. For det andet skal hele musklen i denne strategi være dedikeret til dette assay og kan ikke bruges til at vurdere et andet patologisk træk. Undersøgelser, der sigter mod at vurdere langsgående ændringer i IMAT, er bedre tjent med ikke-invasive billeddannelsesteknikker, og undersøgelser, hvis primære mål kræver, at musklen til andre formål (histologi, kvantitativ polymerasekædereaktion, western blotting) er bedre tjent med histologisk vurdering, da resten af den frosne muskel kan allokeres til andre assays. Dette assay er imidlertid velegnet til parring med in vivo-test, såsom løbebåndskørsel eller ex vivo-kontraktil test, da disse foranstaltninger kan foretages før decellularisering44. For det tredje, selvom brugen af BODIPY-plet med konfokal mikroskopi giver visualisering og kvantificering af lipiddråber i høj opløsning, kan den ikke endeligt identificere lipiddråber som individuelle adipocytter, da cellemembranen fjernes, og endogene adipocytproteiner går tabt. Multilokulære adipocytter, der repræsenterer umodne adipocytter eller en "brun / beige" fænotype, kan identificeres som flere lipiddråber. Endelig fungerer protokollen ikke godt på tidligere frosne muskler. Disse begrænsninger er sandsynligvis mest dybtgående for humane biopsier, da mens hele biopsien kan decellulariseres, er den rumlige fordeling af IMAT i biopsien sandsynligvis ikke mere repræsentativ for hele musklen end en histologisk skive. Men da denne teknik er relativt ufølsom over for ufrosne biopsihåndteringsbetingelser (f.eks. timer på is i PBS), kunne biopsien opdeles senere for forskellige assays, herunder en del til decellularisering, hvilket ville give en bedre opløsning af individuelle lipiddråber.
Afslutningsvis er en ny metode til kvalitativ og kvantitativ analyse af skeletmuskulaturens fedtinfiltration blevet udviklet ved farvning og billeddannelse af det tilbageholdte lipid af decellulariserede konstruktioner. Denne metode tilbyder forbedringer i forhold til guldstandardtilgange, idet den muliggør omfattende billeddannelse af tredimensionel fedtinfiltration i muskler og hurtig, billig kvantificering med ORO-farvning. For mere detaljerede målinger giver en anden lipidopløselig BODIPY-plet en mere detaljeret kvantificering af lipiddråbeantal, volumen og fordelingsmønster, som afbildet ved konfokal mikroskopi. Sammen giver disse målinger forskere en måde at præcist måle skeletmuskulaturens fedtinfiltration på niveauet af de enkelte lipiddråber uden prøveudtagning eller dyr ikke-invasiv billeddannelse.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01AR075773 to GAM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | Fisher Scientific | SLGP033RS | |
| 1 mL LuerLock Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| 12 mm Coverslips | Fisher Scientific | 12545F | |
| 12 well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1H | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | I9516 | 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month. Working solution must be made fresh. |
| 37% Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 8187081000 | |
| 40 µm Mesh Filter | Fisher Scientific | 87711 | |
| 6 well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | 08-772-2C | |
| BODIPY 493/503 | Fisher Scientific | D-3922 | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Confocal Imaging Dish | VWR | 734-2905 | |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SPEII | |
| Dissecting/stereo Microscope | Zeiss | 4107009123001000 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 033361.K2 | |
| ImageJ | NIH | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Oil Red O Powder | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Plate reader | Bio-tek | Synergy II | |
| Rocker/Shaker | Reliable Scientific | 55D | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119D | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 |
References
- Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
- Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
- Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
- Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
- Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957 (2012).
- Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
- Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
- Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
- Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
- Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597 (2022).
- Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717 (2023).
- Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
- Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
- Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
- Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66 (2022).
- Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
- Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
- Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
- Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
- Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
- Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
- Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
- Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
- Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
- Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
- Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
- Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1 (2017).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
- Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).
