Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का विकोशिकीयकरण-आधारित परिमाणीकरण

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65461
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Program in Physical Therapy, Washington University in St. Louis, 2Departments of Neurology, Orthopaedic Surgery and Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis

Summary

वर्तमान अध्ययन में बरकरार मांसपेशियों की मात्रा के माध्यम से इंट्रामस्क्युलर एडीपोज ऊतक (आईएमएटी) जमाव को देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए डीसेल्युलराइजेशन आधारित पद्धतियों का वर्णन किया गया है, साथ ही व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स के मैट्रिक्स को निर्धारित किया गया है जिसमें आईमैट शामिल है।

Abstract

फैटी घुसपैठ कंकाल की मांसपेशियों में मायोफाइबर के बीच एडिपोसाइट्स का संचय है और कई मायोपैथियों, चयापचय संबंधी विकारों और डिस्ट्रोफी की एक प्रमुख विशेषता है। नैदानिक रूप से मानव आबादी में, फैटी घुसपैठ का मूल्यांकन गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), और अल्ट्रासाउंड (यूएस) शामिल हैं। हालांकि कुछ अध्ययनों ने माउस की मांसपेशियों में फैटी घुसपैठ को मापने के लिए सीटी या एमआरआई का उपयोग किया है, लागत और अपर्याप्त स्थानिक संकल्प चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं। अन्य छोटे पशु विधियां व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स की कल्पना करने के लिए हिस्टोलॉजी का उपयोग करती हैं; हालांकि, यह पद्धति विषम विकृति विज्ञान में नमूना पूर्वाग्रह से ग्रस्त है। यह प्रोटोकॉल गुणात्मक रूप से देखने और मात्रात्मक रूप से फैटी घुसपैठ को पूरे बरकरार माउस मांसपेशियों में और डीसेलुलराइजेशन का उपयोग करके व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स के स्तर पर मापने के लिए कार्यप्रणाली का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल विशिष्ट मांसपेशियों या विशिष्ट प्रजातियों तक सीमित नहीं है और इसे मानव बायोप्सी तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, सकल गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन कम लागत के लिए मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ किया जा सकता है, जिससे इस प्रक्रिया को अनुसंधान प्रयोगशालाओं में अधिक सुलभ बनाया जा सकता है।

Introduction

कंकाल की मांसपेशी के भीतर मायोफाइबर के बीच एडिपोसाइट्स का संचय असमान स्थितियों की एक प्रमुख विशेषता है, टाइप 2 मधुमेह से सरकोपेनिया से मस्कुलोस्केलेटल चोट1,2,3,4,5,6,7 तक। इन स्थितियों के रोगजनन को समझने के लिए इस इंट्रामस्क्युलर एडीपोज ऊतक (आईएमएटी) का व्यापक मूल्यांकन महत्वपूर्ण है, क्योंकि आईएमएटी जमाव इंसुलिन प्रतिरोध 3,8,9,10 और खराब कंकाल की मांसपेशी समारोह 11,12,13,14,15 के साथ दृढ़ता से सहसंबद्ध है।. यद्यपि इन संघों को दशकों से नोट किया गया है, लेकिन आईएमएटी से जुड़े तंत्र और उत्पत्ति अभी भी गहन जांच का क्षेत्र बनी हुई है। यह आंशिक रूप से है क्योंकि कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का आकलन करने वाले अधिकांश अध्ययन मनुष्यों में किए गए हैं, जहां यांत्रिक जांच16,17 तक सीमित है। हालांकि, हाल ही में, चूहों सहित छोटे पशु मॉडल का उपयोग आईमैट विकास और सिग्नलिंग18,19,20 के सेलुलर विनियमन को इंगित करने में मदद करने के लिए किया गया है। इस काम का उद्देश्य कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ को गुणात्मक रूप से देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए छोटे पशु मॉडल के साथ उपयोग के लिए एक नया उपकरण प्रदान करना है।

नैदानिक रूप से मानव आबादी में, फैटी घुसपैठ का मूल्यांकन गैर-आक्रामक तरीकों का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) 6,21, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 16,17,22,23 और अल्ट्रासाउंड (यूएस) 17,24 शामिल हैं। ये इमेजिंग तकनीक ें आम तौर पर एक मांसपेशी में रुचि के परिभाषित क्षेत्र (आरओआई) की पहचान करती हैं और उस क्षेत्र के भीतर छवि स्लाइस प्राप्त करती हैं, हालांकि व्यापक दृष्टिकोण भी नियोजित किए गए हैं25,26,27. इन छवि स्लाइस को गुणात्मक ग्रेडिंग6 के अधीन किया जाता है और पिक्सेल थ्रेशोल्डिंग28 के माध्यम से परिमाणित किया जाता है। इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग जानवरों में पहले29,30 में किया गया है; हालांकि, वे महंगे हैं और छोटे पशु इमेजिंग सिस्टम तक पहुंच की आवश्यकता होती है। सीटी और एमआरआई उपयोग के माध्यम से स्थानिक संकल्प भी एक प्रमुख मुद्दा प्रस्तुत करता है, क्योंकि वे एक वोक्सेल के भीतर कंकाल की मांसपेशी फाइबर से आईमैट एडिपोसाइट्स को चित्रित करने में असमर्थ हैं और इसके बजाय मुख्य रूप से मांसपेशी क्षेत्रों और मुख्य रूप से आईमैट क्षेत्रों31,32 के व्यक्तिपरक पृथक्करण पर भरोसा करते हैं। जैसे, वसा या मांसपेशियों के ऊतकों की सटीक पहचान करने में असमर्थता भी इन ऊतकों की प्रतिनिधि मात्रा की गलत मात्रा प्रस्तुत करती है।

इन सीमाओं के कारण, छोटे पशु मॉडल में कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का आकलन करने की वर्तमान तकनीक आमतौर पर एक सस्ती और सुलभ विकल्प33,34 के रूप में हिस्टोलॉजी पर भरोसा करती है। हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई), ऑयल रेड ओ (ओआरओ), और पेरिलिपिन जैसे एडिपोसाइट्स मार्करों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग सहित मानक धुंधला प्रक्रियाएं, मांसपेशियों के भीतर फैटी घुसपैठ वाले एडिपोसाइट्स का सरल पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती हैं। हालांकि, हिस्टोलॉजी दृष्टिकोण शायद ही कभी व्यापक होते हैं, और आमतौर पर, आईमैट गुणात्मक या मात्रात्मक मूल्यांकन एक खंड34 तक सीमित होता है। लिपिड निष्कर्षण का उपयोग कुल मांसपेशी लिपिड35 को निर्धारित करने के लिए भी किया गया है; हालांकि, यह तकनीक इंट्रामायोसेलुलर लिपिड (आईएमसीएल) और इंट्रामस्क्युलर एडीपोज ऊतक (आईएमएटी) स्टोर36 के बीच अंतर करने में विफल रहती है। सारांश में, मांसपेशियों में वसा की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्तमान पद्धतियां या तो वित्तीय लागत या आईएमएटी की विशिष्ट पहचान तक सीमित हैं।

यहां, हम गुणात्मक विज़ुअलाइज़ेशन और मल्टी-स्केल परिमाणीकरण दोनों द्वारा कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का आकलन करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। यह पद्धति एक सरल डीसेलुलराइजेशन तकनीक को नियोजित करती है जो आईएमसीएल सहित मायोसेलुलर संरचनाओं को हटा देती है, लेकिन बड़े आईमैट एडिपोसाइट-व्युत्पन्न लिपिड बूंदों को बरकरार रखती है। इस तकनीक की विशिष्टता कासत्यापन प्रकाशित किया गया है, जिसमें डीसेलुलराइजेशन के साथ आईएमसीएल की कमी को दिखाने के लिए लिपिड निष्कर्षण का उपयोग करना, डीसेलुलराइजेशन के साथ आईमैट पैटर्निंग के प्रतिधारण को दिखाने के लिए μCT, और डीसेलुलराइजेशन के साथ पहचाने गए लोगों की तुलना में IMAT लिपिड बूंदों के समान आकार वितरण को दिखाने के लिए हिस्टोलॉजी शामिल है। एक बार डीसेल्युलराइज्ड होने के बाद, मांसपेशियों को पैटर्न के गुणात्मक विज़ुअलाइज़ेशन और फैटी घुसपैठ की सीमा और / या व्यक्तिगत आईएमएटी लिपिड बूंदों की मात्रात्मक इमेजिंग के लिए लिपिड-घुलनशील रंगों से रंगा जा सकता है। रंगों को बाद में आइसोप्रोपेनोल के साथ निकाला जा सकता है, और परिणामस्वरूप समाधान के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) का उपयोग आईमैट लिपिड मात्रा का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का कड़ा सत्यापन अन्यत्र प्रकाशित किया गयाहै। यह आलेख माउस की मांसपेशियों के साथ इस पद्धति का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है और अन्य अनुप्रयोगों में इस पद्धति को अपनाने का समर्थन करने के लिए समस्या निवारण युक्तियां प्रदान करता है, जैसे कि अन्य प्रजातियों या अन्य ऊतकों की मांसपेशियां।

Protocol

चूहों की देखभाल और बलिदान प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग और देखभाल के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड के अनुसार किया गया था। सभी काम सेंट लुइस स्कूल ऑफ मेडिसिन में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में पशु अध्ययन समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। 2-3 महीने की आयु के नर C57BL / 6J चूहों ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग इस प्रोटोकॉल में शामिल उदाहरण छवियों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। नीचे वर्णित सभी चरण कमरे के तापमान पर किए जाते हैं।

1. मांसपेशियों का विघटन

  1. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 1% डब्ल्यू / वी सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस; सामग्री की तालिका देखें) समाधान तैयार करें। घोल को पूरी तरह से मिश्रित होने तक हिलाएं।
    नोट: 1% एसडीएस थोक में तैयार किया जा सकता है और 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. पहले वर्णित38,39 के रूप में रुचि की मांसपेशियों (ओं) का विश्लेषण करें।
    1. 70% इथेनॉल समाधान के साथ बालों और त्वचा को गीला करके रुचि की मांसपेशियों को उजागर करें, फिर लगभग 2 सेमी का ट्रांसक्यूटेनियस चीरा बनाएं, इसके बाद फोर्सप्स और स्प्रिंग कैंची के साथ कवर त्वचा को हटा दें।
      नोट: यहां रुचि की मांसपेशियों में टिबियलएंटीरियर (टीए), एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल), और डायाफ्राम शामिल हैं। कुछ मांसपेशियां अन्य मांसपेशियों में गहरी हो सकती हैं, जिन्हें अन्य मांसपेशियों के विच्छेदन की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, ईडीएल को विच्छेदित करने के लिए टीए को हटाने की आवश्यकता होती है)।
    2. तेज कैंची या ब्लेड का उपयोग करके रुचि की मांसपेशियों (ओं) को विच्छेदित करें (सामग्री की तालिका देखें) यह सुनिश्चित करने के लिए कि मांसपेशियों की पूरी सीमा प्राप्त की जाती है और किनारे चिकनी होते हैं।
      नोट: यह आदर्श रूप से विज़ुअलाइज़ेशन को बेहतर बनाने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए मांसपेशियों का निरीक्षण करें कि कोई हड्डी के चिप्स या रैगिंग वाले किनारे शामिल नहीं हैं, फिर आवश्यकतानुसार तेज कैंची के साथ इन्हें ट्रिम करें।
    4. एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके मांसपेशियों का वजन करें और वजन रिकॉर्ड करें।
  3. विच्छेदित मांसपेशियों को 1% एसडीएस प्रति मिलीग्राम वजन के कम से कम 0.1 एमएल में रखें; 6-, 12- या 24-वेल प्लेटें क्रमशः डायाफ्राम, टीए और ईडीएल माउस मांसपेशियों के लिए अच्छी तरह से काम करती हैं। 6-, 12- और 24-वेल प्लेटों के लिए विशिष्ट मात्रा क्रमशः 6 एमएल, 3 एमएल और 1.5 एमएल है।
    नोट: एसडीएस समाधान कभी-कभी मांसपेशियों को विकृत करने का कारण बनता है, इसलिए सुनिश्चित करें कि प्रारंभिक विसर्जन पर मांसपेशी सपाट / विस्तारित है।
  4. वेल प्लेट (या अन्य बर्तनों) को 50-80 हर्ट्ज पर सेट रॉकिंग शेकर पर रखें।
  5. समय-समय पर SDS समाधान का नेत्रहीन निरीक्षण करें। जब घोल बादल हो जाता है, तो घोल को एक पिपेट के साथ हटा दें (मांसपेशियों को एस्पिरेट न करने का ध्यान रखें) और इसे ताजा 1% एसडीएस की समान मात्रा के साथ बदलें। जब समाधान 24 घंटे के लिए स्पष्ट रहता है, तो विकोशिकीयकरण पूरा हो जाता है।
    नोट: समाधान परिवर्तन के लिए आवश्यक आवृत्ति मांसपेशियों के आकार और प्रारंभिक समाधान की मात्रा से भिन्न होती है। टीए जैसी बड़ी मांसपेशियों को कुछ घंटों के भीतर नए एसडीएस की आवश्यकता होती है, और ईडीएल जैसी छोटी मांसपेशियां मूल समाधान में रात भर जा सकती हैं।
  6. एक पिपेट के साथ डीसेल्युलराइज्ड मांसपेशियों से अंतिम एसडीएस समाधान को हटा दें (मांसपेशियों को एस्पिरेट न करने का ध्यान रखें) और इसे पीबीएस की समान मात्रा के साथ बदलें।
  7. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत विकोशिकीय मांसपेशियों का निरीक्षण करें और मांसपेशियों से चिपके हुए किसी भी बाल या मलबे को हटाने के लिए बल और कैंची का उपयोग करें।
    नोट: इसके अलावा, इस चरण में विकोशिकीय मांसपेशियों की स्पष्टता पर ध्यान दें। यदि विकोशिकीय मांसपेशी पूरी तरह से पारदर्शी नहीं है और एसडीएस समाधान 24 घंटे में बादल में वृद्धि नहीं करता है, तो डीसेलुलराइजेशन कुशल नहीं था। यह गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन में एक कलाकृति बनाता है, और इसलिए प्रयोगात्मक मांसपेशियों के साथ आगे बढ़ने से पहले अभ्यास नमूनों पर डीसेल्युलराइजेशन को हमेशा अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  8. पीबीएस को ध्यान से निकालें, इसे 3.7% फॉर्मलाडेहाइड या 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान की समान मात्रा के साथ बदलें, और प्लेट को 24 घंटे के लिए रॉकिंग शेकर में वापस करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि फॉर्मलाडेहाइड समाधान पूरी तरह से विकोशिकीय मांसपेशियों को कवर करता है, अन्यथा धुंधलापन असमान होगा।

2. तेल लाल ओ के साथ आईमैट का विज़ुअलाइज़ेशन।

  1. ओआरओ का घोल तैयार करें।
    1. स्टॉक समाधान उत्पन्न करने के लिए आइसोप्रोपेनोल के 100 एमएल में 0.5 ग्राम ओआरओ पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलें।
      नोट: इसे पूरी तरह से भंग करने के लिए घोल में सौम्य गर्मी जोड़ें। इस स्टॉक को 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. कम से कम 0.1 एमएल / मिलीग्राम मांसपेशियों के वजन की मात्रा का उपयोग करके सभी मांसपेशियों के लिए आवश्यक कामकाजी समाधान प्राप्त करने के लिए 60: 40 अनुपात में ओआरओ स्टॉक समाधान और विआयनीकृत पानी को मिलाएं। 6-, 12- और 24-वेल प्लेटों के लिए विशिष्ट मात्रा क्रमशः 6 एमएल, 3 एमएल और 1.5 एमएल है।
      नोट: मिश्रण से पहले स्टॉक समाधान का निरीक्षण करें। यदि स्टॉक समाधान में पर्याप्त कण हैं, तो ताजा स्टॉक बनाएं।
    3. कण को व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए काम करने वाले समाधान को कवर करें।
    4. 40 μm जाल के माध्यम से काम करने वाले समाधान को फ़िल्टर करें, इसके बाद 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर करें।
      नोट: 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर तेजी से बंद हो जाता है और यदि कार्यशील समाधान आसानी से आगे नहीं बढ़ता है तो इसका आदान-प्रदान किया जाना चाहिए।
  2. फॉर्मलाडेहाइड या पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान को हटा दें और पीबीएस की समान मात्रा के तीन समाधान परिवर्तनों के साथ डीसेल्युलरमांसपेशियों को धो लें।
  3. पीबीएस को 60% आइसोप्रोपेनोल समाधान की समान मात्रा के साथ बदलें और 5 मिनट के लिए रॉकिंग शेकर पर इनक्यूबेट करें।
  4. 60% आइसोप्रोपेनोल समाधान को ओआरओ वर्किंग सॉल्यूशन के साथ बदलें और 10 मिनट के लिए रॉकिंग शेकर पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ओआरओ वर्किंग सॉल्यूशन पूरी तरह से डीसेल्युलराइज्ड मांसपेशियों को कवर करता है, अन्यथा धुंधलापन असमान होगा।
  5. ORO कार्यशील समाधान को 1% SDS की समान मात्रा के साथ बदलें। समय-समय पर SDS समाधान का नेत्रहीन निरीक्षण करें। जब घोल स्पष्ट रूप से गुलाबी हो जाता है, तो घोल को पिपेट से हटा दें (मांसपेशियों को एस्पिरेट न करने का ध्यान रखें) और इसे ताजा 1% एसडीएस के साथ बदलें।
  6. जब समाधान 24 घंटे के लिए स्पष्ट रहता है, तो 1% एसडीएस को पीबीएस के साथ बदलें और 4 x आवर्धन पर विच्छेदन / स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत दाग वाली मांसपेशियों का निरीक्षण करें। मांसपेशियों के बाहर से चिपके किसी भी स्पष्ट मलबे या कण को हटा दें। यदि यह व्यापक है, तो मलबे / कण को खींचने के लिए एक सफाई ऊतक पर डीसेल्यूलराइज्ड मांसपेशियों को धीरे से घुमाया जा सकता है।
  7. यदि धुंधलापन संतोषजनक है (एक पारदर्शी मैट्रिक्स में तैरते हुए चमकीले लाल गोले), तो स्टीरियो माइक्रोस्कोप से जुड़े कैमरे का उपयोग करके वांछित धुंधला पन की छवियां प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: यदि विच्छेदन माइक्रोस्कोप में संलग्न कैमरा नहीं है, तो आईपीस के माध्यम से चित्र लेने के लिए एक फोन कैमरा का उपयोग किया जा सकता है।

3. बीओडीआईपीवाई के साथ आईमैट लिपिड बूंदों का विज़ुअलाइज़ेशन।

नोट: कॉन्फोकल इमेजिंग ईडीएल या डायाफ्राम (~ 2 मिमी मोटाई) जैसी पतली मांसपेशियों के साथ सबसे प्रभावी है। वैकल्पिक रूप से, टीए जैसी मांसपेशियों की तुलनीय मोटाई स्ट्रिप्स का उपयोग किया जा सकता है।

  1. कम से कम 0.1 एमएल / मिलीग्राम मांसपेशियों के वजन की कामकाजी समाधान मात्रा प्राप्त करने के लिए पीबीएस में फ्लोरोसेंट बीओडीआईपीवाई 493/503 ( सामग्री की तालिका देखें) का 1: 200 समाधान तैयार करें। 6-, 12- और 24-वेल प्लेटों के लिए विशिष्ट मात्रा क्रमशः 6 एमएल, 3 एमएल और 1.5 एमएल है।
  2. फॉर्मलाडेहाइड, पैराफॉर्मलडिहाइड, या 1% एसडीएस को हटा दें और पीबीएस की समान मात्रा के तीन समाधान परिवर्तनों के साथ डीसेल्यूलराइज्ड मांसपेशियों को धो लें।
  3. पीबीएस को बीओडीआईपीवाई वर्किंग सॉल्यूशन से बदलें और 20 मिनट के लिए रॉकिंग शेकर पर इनक्यूबेट करें।
  4. पीबीएस की समान मात्रा के तीन समाधान परिवर्तनों के साथ डीसेल्यूलराइज्ड मांसपेशियों को धोएं।
  5. मांसपेशियों को एक स्पष्ट-तल वाले पोत में रखें जो उपलब्ध कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ संगत है। आदर्श रूप से, पकवान में मांसपेशियों को विकृत किए बिना उस पर एक कवरस्लिप रखने के लिए एक रिसेस्ड बॉटम होगा ( सामग्री की तालिका देखें)।
  6. 488 लेजर का उपयोग करके एक मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ छवि ढेर प्राप्त करें। ईडीएल के लिए विशिष्ट स्टैक आकार 10 μm स्लाइस मोटाई के साथ 0.5-1 मिमी हैं, जो प्रति स्टैक 50-100 छवियां प्रदान करते हैं।
    नोट: कुल लिपिड मात्रा, आईमैट लिपिड बूंदों की कुल संख्या, और क्लस्टरिंग के निकटतम पड़ोसी सूचकांक, पूरे मांसपेशी मात्रा के माध्यम से छवि बनाते हैं, छवि पंजीकरण के लिए कुछ ओवरलैप छोड़ने का ध्यान रखते हैं। औसत लिपिड बूंद की मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक स्टैक पर्याप्त हो सकता है।
  7. यदि वांछित हो, तो आईमैट वितरण की मानार्थ संपूर्ण मांसपेशी छवि के लिए, धारा 2 के अनुसार, ओआरओ के साथ मांसपेशियों को दाग दें।
    नोट: क्योंकि BODIPY फ्लोरोसेंट है, यह ORO की छवियों के अधिग्रहण पर प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई नहीं देगा।

4. लिपिड निष्कर्षण द्वारा कुल लिपिड मात्रा का अनुमान

  1. छवि अधिग्रहण के बाद, मांसपेशियों को 96-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं में आइसोप्रोपेनोल के 200 μL में स्थानांतरित करें, या यदि मांसपेशी फिट करने के लिए बहुत बड़ी है तो अच्छी तरह से / मात्रा को अनुकूलित करें।
  2. प्लेट को टैप करके, घोल को ऊपर और नीचे पाइप करके, और / या यांत्रिक रूप से एक पिपेट टिप के साथ मांसपेशियों को कुचलकर घोल को उत्तेजित करें जब तक कि माइक्रोस्कोप के तहत डीसेल्युलर मांसपेशी में कोई लाल / फ्लोरोसेंट गोले नहीं देखा जा सकता है।
    नोट: सर्वोत्तम विश्वसनीयता के लिए टैपिंग, पाइपिंग और क्रशिंग के एक ही संयोजन के साथ सभी मांसपेशियों का इलाज करें। इसके अलावा, टैपिंग, पाइपिंग और क्रशिंग में बिताए गए समय को सीमित करने का ध्यान रखें, क्योंकि आइसोप्रोपेनोल तेजी से वाष्पित हो जाएगा।
  3. प्रत्येक कुएं में घोल को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, फिर 75 μL को प्लेट के दो साफ कुओं में स्थानांतरित करें।
  4. प्लेट को कवर करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या प्लेट रीडर का उपयोग करके डुप्लिकेट 75 μL कुओं के अवशोषण को पढ़ें। यदि निर्माण ओआरओ से सना हुआ था, तो समाधान को 500 एनएम पर पढ़ें; यदि यह BODIPY 493/503 से सना हुआ था, तो प्लेट को 493 nm पर पढ़ें।
    नोट: यदि निर्माण बीओडीआईपीवाई और ओआरओ दोनों से सना हुआ था, तो प्लेट को 500 एनएम पर पढ़ने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि 500 एनएम रीडिंग केवल ओआरओ और ओआरओ प्लस बीओडीआईपीवाई के साथ सना हुआ संरचनाओं के बीच समान परिणाम देते हैं।
  5. यदि नमूनों के बीच आकार के अंतर को ठीक करने के लिए वांछित हो तो मांसपेशियों के रिकॉर्ड किए गए वजन से अवशोषण रीडिंग को विभाजित करें।

5. कॉन्फोकल छवियों से आईमैट लिपिड ड्रॉपलेट मैट्रिक्स का परिमाणीकरण।

नोट: इस अनुभाग को ImageJ संस्करण 1.47 ( सामग्री की तालिका देखें) या बाद में और बुनियादी ImageJ कौशल40 तक पहुंच की आवश्यकता है।

  1. इमेजजे में कॉन्फोकल स्टैक खोलें।
    नोट: विभिन्न कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप विभिन्न प्रारूपों में कॉन्फोकल छवियों को सहेज सकते हैं। ImageJ को स्टैक41 खोलने के लिए एक अतिरिक्त प्लगइन या वेरिएंट की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि फिजी। उपयोग किए गए एल्गोरिदम इमेजजे सॉफ्टवेयर पैकेज का हिस्सा हैं।
  2. BODIPY सकारात्मक पिक्सेल की पहचान करने के लिए ImageJ में एक थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिथ्म चलाएं। यह वर्तमान छवि को बाइनरी छवि में परिवर्तित करता है।
    1. थ्रेशोल्ड को समायोजित करने के > छवि का चयन करके थ्रेशोल्ड उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस खोलें> उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस में, थ्रेशोल्डिंग प्रकार के रूप में इंटरमोड का चयन करें और सुनिश्चित करें कि डार्क पृष्ठभूमि का चयन किया गया है। किसी अन्य विकल्प का चयन करने की आवश्यकता नहीं है। इसके बाद अप्लाई पर क्लिक करें।
    2. स्टैक को बाइनरी में बदलने के लिए एक संवाद बॉक्स खुलता है। सुनिश्चित करें कि इसमें निम्न विकल्प चयनित हैं: विधि: इंटरमोड; पृष्ठभूमि: अंधेरा। प्रत्येक छवि और काली पृष्ठभूमि (बाइनरी मास्क की) के लिए दहलीज की गणना करें। यह एक बाइनरी स्टैक उत्पन्न करता है, जहां सफेद बीओडीआईपीवाई सकारात्मक पिक्सेल को इंगित करता है और काला बीओडीआईपीवाई नकारात्मक पिक्सेल को इंगित करता है।
      नोट: इंटरमोड्स थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिदम सभी उपयोगकर्ताओं के लिए सबसे अच्छा विकल्प नहीं हो सकता है। इमेजजे के अंतर्निहित थ्रेशोल्डिंग विकल्पों का व्यक्तिपरक निरीक्षण बीओडीआईपीवाई सकारात्मक और नकारात्मक पिक्सेल को अलग करने के लिए इष्टतम एल्गोरिदम का चयन करने में मदद करता है।
  3. स्पर्श लिपिड बूंदों को अलग करने के लिए इमेजजे में वाटरशेड एल्गोरिदम चलाएं। द्विआधारी > वाटरशेड > प्रक्रिया का चयन करें। एक संवाद बॉक्स खुलता है जो पूछता है कि स्टैक में सभी छवियों को संसाधित किया जाना चाहिए या नहीं। हाँ का चयन करें. यह ठोस सफेद के बड़े क्षेत्रों को विभाजित करने वाली पतली काली रेखाओं को जोड़ता है।
  4. इमेजजे में विश्लेषण कण एल्गोरिथ्म के साथ आरओआई की पहचान करें।
    1. कणों का विश्लेषण > विश्लेषण का चयन करें। चयन सेटिंग्स सेट करने के लिए एक संवाद बॉक्स खुलता है.
      नोट: लिपिड ड्रॉपलेट आरओआई का सबसे अच्छा अनुमान प्राप्त करने के लिए आकार सीमा का चयन करना महत्वपूर्ण है। निचली सीमा उन क्षेत्रों को समाप्त करती है जो आईमैट-व्युत्पन्न लिपिड बूंदों (पृष्ठभूमि विरूपण साक्ष्य) होने की संभावना रखते हैं, और ऊपरी बाध्य उन क्षेत्रों को समाप्त करता है जो एकल आईमैट-व्युत्पन्न लिपिड बूंदों (लिपिड बूंदों को छूने वाले लिपिड बूंदों को छूते हैं जो वाटरशेड एल्गोरिदम द्वारा अलग नहीं किए गए थे) होने की संभावना है।
    2. इन मानों को सेट करने के लिए, मूल छवि खोलें और ओवल टूल का उपयोग करके दृश्य में सबसे छोटी और सबसे बड़ी लिपिड बूंद की रूपरेखा तैयार करें। फिर, "t" टाइप करके ROI प्रबंधक में इन आकृतियों को जोड़ें। विश्लेषण का चयन करें, फिर माप सेट करें। सेटिंग्स के चयन के लिए एक संवाद बॉक्स खुलता है.
      1. केवल क्षेत्र की जाँच करें और ठीक क्लिक करें. फिर, ROI प्रबंधक से मापन का चयन करें। कणों का विश्लेषण करने में आकार सीमा के रूप में इस परिणाम विंडो से दो क्षेत्र उपायों का उपयोग करें।
    3. सुनिश्चित करें कि प्रबंधक में जोड़ें जाँच की गई है. किसी अन्य विकल्प की आवश्यकता नहीं है।
  5. आरओआई मैनेजर में शो ऑल की जांच करके कॉन्फोकल स्टैक पर आरओआई को ओवरले करें। प्रत्येक स्टैक स्लाइस का व्यक्तिगत रूप से निरीक्षण करने के लिए स्लाइडर बार का उपयोग करें और ओवल टूल (इमेजजे टूलबार में स्थित) का उपयोग करके हाथ से लापता क्षेत्रों को जोड़ें।
  6. आरओआई माप आउटपुट करें। विश्लेषण > सेट माप का चयन करें और क्षेत्र, केन्द्रक, फिट दीर्घवृत्त और स्टैक स्थिति का चयन करें। OK पर क्लिक करें। फिर, ROI प्रबंधक से मापन का चयन करें। परिणाम तालिका में डेटा का चयन किया जा सकता है और आगे के विश्लेषण के लिए Matlab या Excel में कॉपी किया जा सकता है।
  7. रिफाइन.एम मैटलैब कोड37 या एक समान एल्गोरिथ्म का उपयोग करके प्रत्येक स्टैक में आरओआई को एक एकल आरओआई में परिष्कृत करें।
    नोट: यह चरण आवश्यक है क्योंकि चरण 5.2-5.4 आसन्न स्लाइस में एक ही लिपिड बूंद को अलग-अलग आरओआई के रूप में पहचानते हैं। हालांकि, आरओआई को वैकल्पिक रूप से केवल हाथ से पहचाना जा सकता है, या मैटलैब की आवश्यकता से बचने के लिए इमेजजे में डुप्लिकेट आरओआई को हाथ से समाप्त किया जा सकता है।
  8. Matlab या Excel का उपयोग करके ROI में सारांश आँकड़े प्राप्त करें।
    1. आरओआई की कुल संख्या के रूप में लिपिड बूंदों की कुल संख्या का अनुमान लगाएं।
    2. प्रत्येक 2 डी आरओआई पर फिट किए गए दीर्घवृत्त की मात्रा के रूप में लिपिड बूंद की मात्रा का अनुमान लगाएं, यह मानते हुए कि आकार की गहराई दीर्घवृत्त के प्रमुख और छोटे अक्षों का औसत है।
    3. कुल लिपिड मात्रा का अनुमान लगाएं, जो व्यक्तिगत अनुमानित लिपिड बूंद मात्रा का योग है।

Representative Results

कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का गुणात्मक दृश्य।
ठीक से विघटित मांसपेशियां सफेद और अर्ध-पारदर्शी होती हैं (खंड 1; चित्र 1)। जब आईमैट (खंड 2) की कल्पना करने के लिए डीसेल्युलर मांसपेशियों को ओआरओ के साथ दाग दिया जाता है, तो आईमैट लिपिड बूंदें लाल गोले के रूप में स्पष्ट मांसपेशी संरचनाओं के भीतर स्पष्ट होती हैं (चित्रा 1)। स्वस्थ माउस हिंदलिंब मांसपेशियों में बहुत कम प्राकृतिक आईमैट होता है, जो बहुत कम लाल, ओआरओ पॉजिटिव लिपिड (चित्रा 1 ए) से स्पष्ट होता है। तुलनात्मक रूप से, हिंदलिम्ब की मांसपेशियों को कार्डियोटॉक्सिन (सीटीएक्स) के साथ इंजेक्ट किया जाता है; चित्र 1B) या ग्लिसरॉल (जीएलवाई; चित्र 1C) डीसेल्युलराइजेशन से 14 दिन पहले आईमैट के संचय में वृद्धि हुई है, जिसमें जीएलवाई की तुलना में सीटीएक्स के बाद आईएमएटी की बड़ी एकाग्रता है, जैसा कि पहले उल्लेख किया गयाहै।

अपूर्ण विकोशिकीयकरण को प्रारंभिक एसडीएस उपचार के तुरंत बाद या अर्ध-अपारदर्शी, हल्के गुलाबी फाइबर के रूप में ओआरओ धुंधला होने के तुरंत बाद पहचाना जा सकता है (चित्रा 2 ए की तुलना में चित्रा 2 बी)। ओआरओ की अपूर्ण निकासी को अलग-अलग फाइबर लाइनों (चित्रा 2 सी) के बजाय गुलाबी या लाल समान पृष्ठभूमि के रूप में ओआरओ वॉशआउट के बाद पहचाना जा सकता है। चित्रा 2 ए, बी में एपिमस्कुलर एडीपोज (तारांकन) भी होता है, जो विकोशिकीय मांसपेशियों के बाहर लिपिड बूंदों का एक झुरमुट होता है। चित्रा 2 सी मांसपेशियों की तह को भी प्रदर्शित करता है जो तब हो सकता है जब मांसपेशियों को डीसेलुलराइजेशन के दौरान बाहर नहीं फैलाया जाता है। अपूर्ण विकोशिकीयकरण, अपूर्ण ओआरओ निकासी, और अवशिष्ट एपिमस्कुलर एडीपोज सभी वास्तव में निकाले गए लिपिड के (ओडी) को बढ़ाते हैं, लेकिन यदि उन्हें एक कलाकृति के रूप में पहचाना जाता है तो फैटी घुसपैठ के गुणात्मक मूल्यांकन में बाधा नहीं डालते हैं।

कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ की मात्रात्मक इमेजिंग।
व्यक्तिगत लिपिड ड्रॉपलेट मैट्रिक्स और वितरण के अधिक विस्तृत मूल्यांकन के लिए बीओडीआईपीवाई फ्लोरोसेंटली लेबल लिपिड बूंदों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है (चित्रा 3)। यह प्रक्रिया अर्ध-स्वचालित है, जैसा कि पहले वर्णित है, जिसमें मैटलैब कोड37 भी शामिल है। अच्छी बीओडीआईपीवाई धुंधला होने के परिणामस्वरूप विमान में चित्रित होने पर पड़ोसी आकृतियों से चित्रित उज्ज्वल अंडाकार आकार होते हैं (चित्रा 3 ए)। थ्रेशोल्डिंग और आकार विभाजन प्रत्येक लिपिड बूंद (चित्रा 3 बी) के लिए आरओआई उत्पन्न करने के लिए एक अच्छा पहला पास प्रदान करता है, लेकिन त्रुटियों को ठीक करने के लिए मैन्युअल संपादन की आवश्यकता होती है। सबसे व्यापक त्रुटि लिपिड बूंदें हैं जो ऊतक में गहरी होती हैं और इस प्रकार किसी भी स्लाइस पर उज्ज्वल नहीं होती हैं (चित्रा 3 बी; गुलाबी डबल तीर)। इमेजजे (चित्रा 3 सी) में ओवल टूल का उपयोग करके हाथ से आरओआई जोड़कर इसे ठीक किया जा सकता है। दूसरा लिपिड बूंदों के एक समूह को एकल आरओआई (चित्रा 3 बी; लाल तारांकन) के रूप में पहचान रहा है। इसे मूल ROI को हटाकर और कई नए ROI (चित्रा 3D) के साथ बदलकर ठीक किया जा सकता है। अंत में, एक एकल लिपिड बूंद को कई स्लाइस में एक अद्वितीय आरओआई के रूप में पहचाना जाता है, इसलिए डुप्लिकेट आरओआई को एकल आरओआई (चित्रा 3 ई; नीला तीर) में समेकित किया जाना चाहिए। यह मैटलैब जैसे डेटा प्रोसेसिंग टूल का उपयोग करके सबसे आसानी से किया जाता है, लेकिन सबसे बड़े आरओआई की पहचान करके और बाकी को हटाकर हाथ से भी किया जा सकता है। C57BL6/J और 129Sv माउस में प्रत्येक मीट्रिक के लिए औसत मान Biltz et al.37 में पाया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: उदाहरण तेल लाल ओ (ओआरओ) विकोशिकीय मांसपेशियों का धुंधलापन। ओआरओ-दाग वाली मांसपेशियों को खारा (एसएएल), कार्डियोटॉक्सिन (सीटीएक्स), या ग्लिसरॉल (जीएलवाई) के साथ इंजेक्शन के 14 दिन बाद। माउस एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) और टिबियल एंटीरियर (टीए) मांसपेशियों में एसएएल उपचार (ए) के साथ थोड़ा आईएमएटी (लाल गोले) होता है, लेकिन सीटीएक्स (बी) और जीएलवाई (सी) उपचार के जवाब में आईमैट जमा होता है। एक पूर्ण डीसेलुलराइजेशन और ओआरओ वॉशआउट है, जो पारदर्शी सफेद मांसपेशी पृष्ठभूमि में अलग-अलग ओआरओ पॉजिटिव लिपिड बूंदों से स्पष्ट है। स्केल सलाखों = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: खराब ओआरओ धुंधला परिणामों के उदाहरण। अपूर्ण विकोशिकीयकरण या अपूर्ण ओआरओ निकासी एक अर्ध-अपारदर्शी गुलाबी / लाल पृष्ठभूमि की ओर ले जाती है। पूरी तरह से विकोशिकीय माउस डायाफ्राम मांसपेशी (ए) की पारदर्शी सफेद पृष्ठभूमि की तुलना में, अपूर्ण डीसेलुलराइजेशन को हल्के गुलाबी / लाल फाइबर ट्रैक (बी) की विशेषता है, और अपूर्ण ओआरओ निकासी को एक डिफ्यूज गुलाबी / लाल पृष्ठभूमि (सी) की विशेषता है। स्केल बार: ऊपरी पैनल = 1 मिमी; निचले पैनल = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसेंट बीओडीआईपीवाई धुंधला और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ व्यक्तिगत लिपिड बूंद पहचान के उदाहरण व्यक्तिगत बीओडीआईपीवाई दाग वाले लिपिड बूंदों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डीसेल्यूलराइज्ड मांसपेशियों में पहचाना और परिमाणित किया जा सकता है। एक कॉन्फोकल स्टैक के माध्यम से अलग-अलग स्लाइस विमान में लिपिड बूंदों को चमकीले हरे दीर्घवृत्त के रूप में दिखाते हैं, और लिपिड बूंदों को विमान से बाहर फैंटर आकार (ए; नीले तीर) के रूप में दिखाते हैं। वाटरशेड ऑब्जेक्ट विभाजन और आरओआई पहचान के साथ संयुक्त थ्रेशोल्डिंग बीओडीआईपीवाई-दाग वाले आरओआई (बी) को मैप कर सकता है। थ्रेशोल्डिंग में कुछ फैंटर लिपिड बूंदों (बी; गुलाबी डबल तीर) की कमी हो सकती है, जिसके लिए हाथ (सी) द्वारा पहचान की आवश्यकता होती है। वाटरशेड विभाजन कई लिपिड बूंदों को एक साथ समूहित कर सकता है (बी; लाल तारांकन), आरओआई को हटाने और हाथ से पुन: आकलन (डी) की आवश्यकता होती है। एक ही लिपिड बूंद को कई स्लाइस में पहचाना जाता है जिसे डुप्लिकेट आरओआई को हटाने के लिए छवि पंजीकरण (ई) की आवश्यकता होती है। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह पांडुलिपि छोटे पशु मॉडल में कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ को गुणात्मक रूप से कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के तरीकों का वर्णन करती है जिसे इंट्रामस्क्युलर एडीपोज ऊतक (आईएमएटी) विकास और पैथोलॉजिकल विस्तार के रोगजनन को समझने के लिए लागू किया जा सकता है। पूरे मांसपेशियों के विकोशिकीयकरण और लिपिड-घुलनशील धुंधलापन का उपयोग पूरी मांसपेशियों में आईमैट की उपस्थिति का व्यापक रूप से आकलन करने के लिए एक लागत प्रभावी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सरल पद्धति की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल का आधार यह है कि एसडीएस के साथ मांसपेशियों का विकोशिकीयकरण आईएमसीएल की छोटी लिपिड बूंदों सहित मायोफाइबर के सेलुलर घटकों को हटा देता है, लेकिन इंट्रामायोसेलुलर एडिपोसाइट्स में बड़ी लिपिड बूंदों को छोड़ देता है। एसडीएस का उपयोग ऊतक इंजीनियरिंग में बड़े पैमाने परमैट्रिसेस को डीसेल्यूलर करने के लिए किया गया है। वसा और कंकाल की मांसपेशी जैसे ऊतकों को आमतौर पर अवशिष्ट एडिपोसाइट्स लिपिड42,43 को हटाने के लिए अतिरिक्त यांत्रिक पृथक्करण और / या अल्कोहल निष्कर्षण की आवश्यकता होती है। हमने पहले दिखाया है कि ऐसा इसलिए है क्योंकि एसडीएस के साथ डीसेल्युलराइजेशन आईएमसीएल को समाप्त करता है, यह एडिपोसाइट्स37 में बड़ी लिपिड बूंद को बचाता है। μCT के साथ ऑस्मियम टेट्रोक्साइड-दाग वाली बरकरार मांसपेशियों की इमेजिंग ने सत्यापित किया कि IMAT का स्थानिक पैटर्न डीसेलुलराइजेशन द्वारा बाधित नहीं था। इसके अलावा, नगण्य आईमैट के साथ एक डीसेल्यूलराइज्ड मांसपेशी में इंट्रामस्क्युलर ट्राइग्लिसराइड परिमाणीकरण बरकरार मांसपेशी मूल्यों का ~ 5% था, जो आईएमसीएल को हटाने की पुष्टि करता है। इसलिए, यह पद्धति एक अर्ध-पारदर्शी मांसपेशी मैट्रिक्स के माध्यम से अपने मूल शारीरिक वितरण में आईमैट लिपिड बूंदों को बरकरार रखती है।

इस प्रोटोकॉल में उचित डीसेल्युलराइजेशन सबसे महत्वपूर्ण कदम है। यदि डीसेल्युलराइजेशन अधूरा है, तो आईमैट लिपिड बूंदों की कल्पना करना मुश्किल होगा और अवशिष्ट आईएमसीएल ओआरओ या बीओडीआईपीवाई (चित्रा 2) के साथ उच्च पृष्ठभूमि धुंधला कर देगा। अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं द्वारा सामान्य त्रुटियां प्रति मांसपेशी (प्रत्येक कुएं के भीतर) अपर्याप्त एसडीएस कवरेज हैं, जैसे कि प्रत्येक मांसपेशी एसडीएस समाधान में पूरी तरह से कवर नहीं होती है, डीसेलुलराइजेशन के दौरान समाधान को उत्तेजित करने के लिए रॉकर का उपयोग नहीं करती है, और समाधान परिवर्तन अक्सर पर्याप्त नहीं करती है। इस पांडुलिपि में, हमने प्रति यूनिट मांसपेशी द्रव्यमान के लिए आवश्यक एसडीएस की मात्रा की सिफारिश की है, लेकिन उपयोगकर्ता को अभी भी यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता होगी कि मांसपेशियों को पूरी तरह से समाधान द्वारा कवर किया गया है, क्योंकि प्रत्येक मांसपेशी में एक अद्वितीय ज्यामिति है। उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करने के लिए उदारतापूर्वक (प्रति दिन दो बार) समाधान बदलने की भी सिफारिश की जाती है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि डीसेलुलराइजेशन पूरा हो गया है। एसडीएस उपचार के 4 दिनों के बाद आईमैट लिपिड बूंदों की अच्छी गुणवत्ता का धुंधलापन हासिल किया गया है। उच्च गुणवत्ता वाले ओआरओ धुंधला परिणामों के लिए, पर्याप्त निर्धारण और ओआरओ समाधान तैयारी भी महत्वपूर्ण है। ऊपर वर्णित एसडीएस उपचार के समान, प्रत्येक मांसपेशी नमूने के लिए 3.7% फॉर्मलाडेहाइड समाधान की पर्याप्त कवरेज की आवश्यकता होती है। यदि मांसपेशियों को फिक्सेटिव से बहुत जल्दी हटा दिया जाता है, तो लिपिड बूंदें केवल ओआरओ के साथ कमजोर दाग देंगी। कुल 1-2 घंटे पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए रातोंरात निर्धारण की सिफारिश की जाती है कि फिक्सेटिव मांसपेशियों के केंद्र में प्रवेश करता है और सभी लिपिड बूंदों को पूरी तरह से ठीक करता है। ओआरओ धुंधला होने के साथ एक अतिरिक्त चुनौती यह है कि जब अल्कोहल एकाग्रता 60% तक कम हो जाती है, तो एक कण बनना शुरू हो जाता है। यह कण सतह पर बस सकता है और मांसपेशियों की सीमा पर फंस सकता है। इससे बचने का सबसे अच्छा तरीका प्रत्येक धुंधलापन के लिए एक ताजा कामकाजी समाधान बनाना है और 40 जाल μm और 0.22 μm फ़िल्टर दोनों का उपयोग करना है। फिर, रॉकर के साथ आंदोलन बनाए रखने और धुंधला होने के समय को 10 मिनट तक सीमित करने से किसी भी कण को बसने से रोकने में मदद मिलेगी। यदि समस्या बनी रहती है, तो एक ताजा ओआरओ स्टॉक समाधान बनाने में मदद मिल सकती है। यदि कुछ कलाकृति विकोशिकीय मांसपेशियों की सतह से चिपकी रहती है, तो इस कलाकृति को हटाने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप, फोर्सप्स और सर्जिकल कैंची का उपयोग किया जा सकता है। कलाकृतियों को खत्म करने में विफल रहने से मांसपेशियों की छवि की गुणवत्ता प्रभावित होगी और ओडी रीडिंग की तैयारी में लिपिड निष्कर्षण भाग के दौरान आईमैट सामग्री को अधिक महत्व दिया जाएगा।

कुल मिलाकर, यह तकनीक सरल है और कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ को देखने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सोने के मानक तरीकों पर कई फायदे प्रदान करती है। सीटी, एमआरआई और यूएस जैसी गैर-आक्रामक तकनीकें, जो मनुष्यों में और कभी-कभी पशु मॉडल में बड़े पैमाने पर उपयोग की जाती हैं, में सीमित स्थानिक संकल्प होता है और मांसपेशियों के तंतुओं से लिपिड बूंदों को अलग करने में असमर्थ होते हैं। इस प्रकार, मध्यवर्ती संकेत तीव्रता के एक पिक्सेल या वोक्सेल को "मांसपेशी" या "वसा" के रूप में सौंपा जाता है, जबकि वास्तविकता में यह संभवतः मायोफाइबर और एडिपोसाइट्स का मिश्रण है। आमतौर पर, पशु मांसपेशियों में फैटी घुसपैठ का मूल्यांकन हिस्टोलॉजी द्वारा किया जाता है, अक्सर मांसपेशी क्रायोसेक्शन में ओआरओ द्वारा। हालांकि, यह आमतौर पर केवल एक प्रतिनिधि खंड में किया जाता है और अनुभाग पर लिपिड स्कैटर के कारण मात्रा निर्धारित करना मुश्किल होता है। इसके विपरीत, एक संपूर्ण विकोशिकीय मांसपेशी का ओआरओ धुंधला पन बरकरार आकृति विज्ञान के समान लागत और प्रयास के साथ आईएमएटी का व्यापक मूल्यांकन प्रदान करता है। इसके अलावा, विज़ुअलाइज़ेशन को बढ़ाने के अलावा, डीसेल्युलराइजेशन का ओआरओ धुंधला लिपिड निष्कर्षण द्वारा फैटी घुसपैठ की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है। फैटी घुसपैठ की विशेषताओं में गहरी गोता लगाने के लिए, एक फ्लोरोसेंट दाग, बीओडीआईपीवाई, का उपयोग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है। यह 3 डी परिदृश्य को मैप करने के लिए व्यक्तिगत आईमैट लिपिड बूंदों के पुनर्निर्माण को सक्षम बनाता है, जो हिस्टोलॉजी के साथ संभव नहीं है जब तक कि मांसपेशियों की लंबाई पर वर्गों का विश्लेषण नहीं किया जाता है। जबकि एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप मानक प्रयोगशाला उपकरण नहीं है, यह छोटे पशु एमआरआई या सीटी की तुलना में विश्वविद्यालय या उद्योग सेटिंग में सुलभ होने की अधिक संभावना है। इसके अलावा, इस प्रक्रिया का अधिकांश हिस्सा स्वचालित हो सकता है, अनुक्रमिक हिस्टोलॉजी की तुलना में समय लागत को कम करता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर सेटिंग्स को अनुकूलित करना बीओडीआईपीवाई धुंधला होने के लिए एक अतिरिक्त विचार है। ये प्रत्येक माइक्रोस्कोप के लिए अद्वितीय हैं। महत्वपूर्ण मूल्य लेजर तीव्रता है, जो मांसपेशियों की दूर की सतह पर लिपिड बूंदों का पता लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, जबकि पास की तरफ लिपिड बूंदों से संकेत को संतृप्त नहीं करता है। इस वजह से, यह सुझाव दिया जाता है कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ बीओडीआईपीवाई धुंधला का उपयोग करना ईडीएल या डायाफ्राम सहित पतली मांसपेशियों पर सबसे उपयुक्त है।

इस दृष्टिकोण की कई सीमाओं पर चर्चा की आवश्यकता है। सबसे पहले, जबकि यह अनुमान लगाया गया है कि इस तकनीक में यहां प्रस्तुत चूहों में चोट मॉडल (कार्डियोटॉक्सिन और ग्लिसरॉल) से परे व्यापक प्रयोज्यता है, नए अनुप्रयोगों (जैसे, एमडीएक्स मॉडल) को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि मांसपेशियों का आकार और संरचना (जैसे, फाइब्रोसिस) डीसेलुलराइजेशन को प्रभावित कर सकती है, जिससे एसडीएस एकाग्रता या इनक्यूबेशन गुना वृद्धि की आवश्यकता होती है। परिवर्तित मांसपेशी द्रव्यमान के साथ अन्य रोग मॉडल को भी अधिक सार्थक परिणाम उपाय प्रदान करने के लिए मांसपेशियों की मात्रा के सापेक्ष लिपिड की पूर्ण मात्रा या लिपिड के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए फैटी घुसपैठ के पूर्ण और सामान्यीकृत (मांसपेशी द्रव्यमान के लिए) मैट्रिक्स दोनों के विश्लेषण की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, इस तकनीक को मोटे तौर पर बड़े पशु मॉडल और मानव बायोप्सी पर लागू होने का अनुमान है, लेकिन इसके लिए प्रत्येक नए अनुप्रयोग के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। दूसरा, इस रणनीति में, पूरी मांसपेशी को इस परख के लिए समर्पित किया जाना चाहिए और इसका उपयोग किसी अन्य रोग संबंधी विशेषता का आकलन करने के लिए नहीं किया जा सकता है। आईमैट में अनुदैर्ध्य परिवर्तनों का आकलन करने का लक्ष्य रखने वाले अध्ययनों को गैर-आक्रामक इमेजिंग तकनीकों और अध्ययनों के साथ बेहतर सेवा दी जाती है, जिनके प्राथमिक उद्देश्य के लिए अन्य उद्देश्यों (हिस्टोलॉजी, मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, वेस्टर्न ब्लोटिंग) के लिए मांसपेशियों की आवश्यकता होती है, हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन द्वारा बेहतर सेवा की जाती है, क्योंकि जमे हुए मांसपेशियों के शेष हिस्से को अन्य परखों को आवंटित किया जा सकता है। हालांकि, यह परख विवो परीक्षण में जोड़ी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जैसे ट्रेडमिल रनिंग, या एक्स विवो सिकुड़ा हुआ परीक्षण, क्योंकि ये उपाय डीसेलुलराइजेशन44 से पहले किए जा सकते हैं। तीसरा, हालांकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ बीओडीआईपीवाई दाग का उपयोग लिपिड बूंदों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण प्रदान करता है, यह निर्णायक रूप से लिपिड बूंदों को व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स के रूप में पहचान नहीं सकता है, क्योंकि कोशिका झिल्ली को हटा दिया जाता है और अंतर्जात एडिपोसाइट्स प्रोटीन खो जाते हैं। मल्टीओकुलर एडिपोसाइट्स, अपरिपक्व एडिपोसाइट्स या "ब्राउन / बेज" फेनोटाइप का प्रतिनिधित्व करते हैं, को कई लिपिड बूंदों के रूप में पहचाना जा सकता है। अंत में, प्रोटोकॉल पहले जमे हुए मांसपेशियों पर अच्छी तरह से काम नहीं करता है। ये सीमाएं शायद मानव बायोप्सी के लिए सबसे गहरा हैं, क्योंकि जबकि पूरे बायोप्सी को डीसेल्युलर किया जा सकता है, बायोप्सी में आईमैट का स्थानिक वितरण हिस्टोलॉजिकल स्लाइस की तुलना में पूरी मांसपेशी का अधिक प्रतिनिधि होने की संभावना नहीं है। हालांकि, चूंकि यह तकनीक अनफ्रोजन बायोप्सी हैंडलिंग स्थितियों (जैसे, पीबीएस में बर्फ पर घंटे) के लिए अपेक्षाकृत असंवेदनशील है, बायोप्सी को बाद में विभिन्न परखों के लिए विभाजित किया जा सकता है, जिसमें डीसेलुलराइजेशन के लिए एक हिस्सा शामिल है, जो व्यक्तिगत लिपिड बूंदों का बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्रदान करेगा।

अंत में, कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक नई विधि विकसित की गई है, जो विकोशिकीय संरचनाओं के बरकरार लिपिड को धुंधला और इमेजिंग करके विकसित की गई है। यह पद्धति स्वर्ण-मानक दृष्टिकोणों पर सुधार प्रदान करती है, जिसमें यह मांसपेशियों के भीतर त्रि-आयामी फैटी घुसपैठ की व्यापक इमेजिंग और ओआरओ धुंधला होने के साथ त्वरित, सस्ते परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है। अधिक विस्तृत उपायों के लिए, एक दूसरा लिपिड-घुलनशील बीओडीआईपीवाई दाग लिपिड बूंद संख्या, मात्रा और वितरण पैटर्न का अधिक विस्तृत परिमाणीकरण प्रदान करता है, जैसा कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया गया है। साथ में, ये उपाय शोधकर्ताओं को नमूना या महंगी नॉनइनवेसिव इमेजिंग के बिना व्यक्तिगत लिपिड बूंदों के स्तर पर कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ को ठीक से मापने का एक तरीका प्रदान करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जीएएम के R01AR075773 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Syringe Filter Fisher Scientific SLGP033RS
1 mL LuerLock Syringes Fisher Scientific 14823434
12 mm Coverslips Fisher Scientific 12545F
12 well plates Fisher Scientific 08-772-29
24 well plates Fisher Scientific 08-772-1H
2-Propanol (Isopropanol) Sigma Aldrich I9516 0.5 mg/mL stock solution can be stored at room temperature for 1 month.  Working solution must be made fresh.
37% Formaldehyde Solution Sigma Aldrich 8187081000
40 µm Mesh Filter Fisher Scientific 87711
6 well plates Fisher Scientific 08-772-1B
96 well plates Fisher Scientific 08-772-2C
BODIPY 493/503 Fisher Scientific D-3922
C57BL/6J Mice Jackson Laboratory 000664
Confocal Imaging Dish VWR 734-2905
Confocal Microscope Leica TCS SPEII
Dissecting/stereo Microscope Zeiss 4107009123001000
Dissection scissors Fine Science Tools 14060-09
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11254-20
Ethanol Fisher Scientific 033361.K2
ImageJ NIH
Matlab Mathworks
Oil Red O Powder Sigma Aldrich O0625
Plate reader Bio-tek Synergy II 
Rocker/Shaker Reliable Scientific 55D
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma Aldrich L3771 1% Solution can be stored at room temperature for 1 month
Transfer pipettes Fisher Scientific 137119D
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delmonico, M. J., et al. Longitudinal study of muscle strength, quality, and adipose tissue infiltration. The American Journal of Clinical Nutrition. 90 (6), 1579-1585 (2009).
  2. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
  3. Freda, P. U., et al. Lower visceral and subcutaneous but higher intermuscular adipose tissue depots in patients with growth hormone and insulin-like growth factor I excess due to acromegaly. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 93 (6), 2334-2343 (2008).
  4. Garg, A., Peshock, R. M., Fleckenstein, J. L. Adipose tissue distribution pattern in patients with familial partial lipodystrophy (Dunnigan variety). The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 84 (1), 170-174 (1999).
  5. Gorgey, A. S., Dudley, G. A. Skeletal muscle atrophy and increased intramuscular fat after incomplete spinal cord injury. Spinal Cord. 45 (4), 304-309 (2007).
  6. Goutallier, D., Postel, J. M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre- and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. (304), 78-83 (1994).
  7. Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
  8. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. The American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
  9. Elder, C. P., Apple, D. F., Bickel, C. S., Meyer, R. A., Dudley, G. A. Intramuscular fat and glucose tolerance after spinal cord injury-a cross-sectional study. Spinal Cord. 42 (12), 711-716 (2004).
  10. Albu, J. B., et al. Independent association of insulin resistance with larger amounts of intermuscular adipose tissue and a greater acute insulin response to glucose in African American than in white nondiabetic women. The American Journal of Clinical Nutrition. 82 (6), 1210-1217 (2005).
  11. Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Mueller, M. J. Intermuscular adipose tissue is muscle specific and associated with poor functional performance. Journal of Aging Research. 2012, 172957 (2012).
  12. Gerber, C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., Meyer, D. C. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16 (6), 691-696 (2007).
  13. Hilton, T. N., Tuttle, L. J., Bohnert, K. L., Mueller, M. J., Sinacore, D. R. Excessive adipose tissue infiltration in skeletal muscle in individuals with obesity, diabetes mellitus, and peripheral neuropathy: association with performance and function. Physical Therapy. 88 (11), 1336-1344 (2008).
  14. Gaeta, M., et al. Muscle fat-fraction and mapping in Duchenne muscular dystrophy: evaluation of disease distribution and correlation with clinical assessments. Preliminary experience. Skeletal Radiology. 41 (8), 955-961 (2012).
  15. Buford, T. W., et al. Age-related differences in lower extremity tissue compartments and associations with physical function in older adults. Experimental Gerontology. 47 (1), 38-44 (2012).
  16. Addona, J., et al. Estimating 3D supraspinatus intramuscular fatty infiltration in older adults: a pilot study. Acta Radiologica. , 2841851221139597 (2022).
  17. Crook, J., et al. Comparison of multifidus muscle intramuscular fat by ultrasound echo intensity and fat-water based MR images in individuals with chronic low back pain. Musculoskeletal Science & Practice. 63, 102717 (2023).
  18. Lee, C., et al. Beige FAPs transplantation improves muscle quality and shoulder function after massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 38 (5), 1159-1166 (2020).
  19. Lee, C., et al. Beige fibro-adipogenic progenitor transplantation reduces muscle degeneration and improves function in a mouse model of delayed repair of rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 29 (4), 719-727 (2020).
  20. Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
  21. Overend, T. J., Cunningham, D. A., Paterson, D. H., Lefcoe, M. S. Thigh composition in young and elderly men determined by computed tomography. Clinical Physiology. 12 (6), 629-640 (1992).
  22. Li, W., et al. Progression and variation of fatty infiltration of the thigh muscles in Duchenne muscular dystrophy, a muscle magnetic resonance imaging study. Neuromuscular Disorders. 25 (5), 375-380 (2015).
  23. Davis, D. L., et al. Supraspinatus fatty infiltration on MRI among older adults receiving physical therapy as initial management for clinically suspected rotator cuff tear: A pilot study. Journal of Clinical Imaging Science. 12, 66 (2022).
  24. Salaffi, F., et al. Ultrasound and magnetic resonance imaging as diagnostic tools for sarcopenia in immune-mediated rheumatic diseases (IMRDs). La Radiologia Medica. 127 (11), 1277-1291 (2022).
  25. Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: a novel depot similar in size to visceral adipose tissue. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (4), 903-910 (2005).
  26. Tuttle, L. J., Sinacore, D. R., Cade, W. T., Mueller, M. J. Lower physical activity is associated with higher intermuscular adipose tissue in people with type 2 diabetes and peripheral neuropathy. Physical Therapy. 91 (6), 923-930 (2011).
  27. Matsumura, N., et al. Quantitative assessment of fatty infiltration and muscle volume of the rotator cuff muscles using 3-dimensional 2-point Dixon magnetic resonance imaging. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 26 (10), 309-318 (2017).
  28. Cheuy, V. A., Hastings, M. K., Commean, P. K., Ward, S. R., Mueller, M. J. Intrinsic foot muscle deterioration is associated with metatarsophalangeal joint angle in people with diabetes and neuropathy. Clinical Biomechanics. 28 (9-10), 1055-1060 (2013).
  29. Samagh, S. P., et al. MRI quantification of fatty infiltration and muscle atrophy in a mouse model of rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 31 (3), 421-426 (2013).
  30. Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: an experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
  31. Goodpaster, B. H., Kelley, D. E., Thaete, F. L., He, J., Ross, R. Skeletal muscle attenuation determined by computed tomography is associated with skeletal muscle lipid content. Journal of Applied Physiology. 89 (1), 104-110 (2000).
  32. Torriani, M., et al. Lower leg muscle involvement in Duchenne muscular dystrophy: an MR imaging and spectroscopy study. Skeletal Radiology. 41 (4), 437-445 (2012).
  33. Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
  34. Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (13), 2270-2278 (2010).
  35. Li, B., et al. Skeletal muscle respiratory uncoupling prevents diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Medicine. 6 (10), 1115-1120 (2000).
  36. Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
  37. Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), 1 (2017).
  38. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), 50183 (2013).
  39. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036 (2013).
  40. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  41. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  42. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  43. Ungerleider, J. L., Johnson, T. D., Rao, N., Christman, K. L. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
  44. Biltz, N. K., et al. Infiltration of intramuscular adipose tissue impairs skeletal muscle contraction. The Journal of Physiology. 598 (13), 2669-2683 (2020).

Tags

जीव विज्ञान अंक 196 फैटी घुसपैठ एडिपोसाइट्स मायोपैथिस चयापचय संबंधी विकार डिस्ट्रोफी कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) अल्ट्रासाउंड (यूएस) हिस्टोलॉजी नमूना पूर्वाग्रह माउस मांसपेशी कार्यप्रणाली गुणात्मक दृश्य मात्रात्मक माप बरकरार माउस मांसपेशी व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स मानव बायोप्सी प्रयोगशाला उपकरण
कंकाल की मांसपेशी फैटी घुसपैठ का विकोशिकीयकरण-आधारित परिमाणीकरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parson, J. C., Biltz, N. K., Meyer,… More

Parson, J. C., Biltz, N. K., Meyer, G. A. Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration. J. Vis. Exp. (196), e65461, doi:10.3791/65461 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter