Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تحويل جذر فول الصويا المشعر لتحليل وظيفة الجينات

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65485
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1
1Department of Biology, York University, 2Department of Genetic Engineering and Biotechnology, Shahjalal University of Science and Technology

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للإنتاج عالي الكفاءة لجذور شعر فول الصويا المعدلة وراثيا.

Abstract

فول الصويا (جلايسين ماكس) هو محصول قيم في الزراعة التي لديها الآلاف من الاستخدامات الصناعية. جذور فول الصويا هي الموقع الرئيسي للتفاعل مع الميكروبات التي تنقلها التربة والتي تشكل تكافلا لإصلاح النيتروجين ومسببات الأمراض ، مما يجعل الأبحاث التي تنطوي على علم الوراثة لجذر فول الصويا ذات أهمية قصوى لتحسين إنتاجها الزراعي. يتم التوسط في التحول الجيني لجذور شعر فول الصويا (HRs) بواسطة سلالة Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) وهو أداة فعالة لدراسة وظيفة الجينات في جذور فول الصويا ، ويستغرق 2 أشهر فقط من البداية إلى النهاية. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا يحدد طريقة الإفراط في التعبير عن جين مهم في الموارد البشرية لفول الصويا وإسكاته. تشمل هذه المنهجية تعقيم بذور فول الصويا ، وإصابة الفلقات ب K599 ، واختيار وحصاد HRs المتحولة وراثيا لعزل الحمض النووي الريبي ، وإذا لزم الأمر ، تحليلات الأيض. إن إنتاجية النهج كافية لدراسة العديد من الجينات أو الشبكات في وقت واحد ويمكن أن تحدد الاستراتيجيات الهندسية المثلى قبل الالتزام بنهج التحول المستقر طويل الأجل.

Introduction

فول الصويا (جليكاين ماكس) هو من بين المحاصيل الأكثر قيمة في الزراعة. لديها الآلاف من الاستخدامات التجارية والصناعية ، مثل المواد الغذائية والأعلاف الحيوانية والنفط ، وكمصدر للمواد الخام للتصنيع1. قدرتها على تكوين علاقة تكافلية مع الكائنات الحية الدقيقة في التربة المثبتة للنيتروجين ، وهي ريزوبيا ، تزيد من أهمية دراسة علم الوراثة فول الصويا2. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي ضبط خصائص تثبيت النيتروجين في جذور فول الصويا إلى تقليل انبعاثات الكربون وتقليلمتطلبات الأسمدة النيتروجينية 3 بشكل كبير. وبالتالي ، فإن فهم علم الوراثة الذي يتحكم في جوانب بيولوجيا جذر فول الصويا ، على وجه الخصوص ، له تطبيقات واسعة في الزراعة والصناعة. بالنظر إلى هذه الفوائد ، من المهم أن يكون لديك بروتوكول موثوق لتحليل وظيفة جينات فول الصويا.

ربما تكون Agrobacterium tumefaciens هي الأداة الأكثر استخداما للتحول الوراثي للنبات حيث أن لديها القدرة على دمج الحمض النووي (T-DNA) في الجينوم النووي للعديد من الأنواع النباتية. عندما تصيب Agrobacterium نباتا ، فإنها تنقل البلازميد المسبب للورم (Ti) إلى كروموسوم المضيف ، مما يؤدي إلى تكوين ورم في موقع الإصابة. تم استخدام التحول بوساطة Agrobacterium على نطاق واسع لعقود من الزمن للتحليل الوظيفي الجيني ومن أجل تعديل سمات المحاصيل4. على الرغم من أن أي جين مهم يمكن نقله بسهولة إلى الخلايا النباتية المضيفة من خلال التحول بوساطة A. tumefaciens، فإن هذه الطريقة لها العديد من العيوب. إنها تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وتتطلب خبرة واسعة للعديد من الأنواع النباتية ، مثل فول الصويا. على الرغم من أنه يمكن تحويل عدد قليل من أنواع فول الصويا عن طريق نهج عقدة النبتة باستخدام A. tumefaciens، فإن عدم كفاءة هذا النهج يستلزم الحاجة إلى تقنية تحويل وراثي بديلة سريعة وعاليةالكفاءة 4,5. حتى غير الخبراء يمكنهم استخدام طريقة تحويل جذر الشعر (HR) بوساطة Agrobacterium rhizogenes للتغلب على هذه العيوب.

يعد تحويل الموارد البشرية أداة سريعة نسبيا ، ليس فقط لتحليل وظيفة الجينات ، ولكن أيضا لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية ، مثل إنتاج المستقلبات المتخصصة والمواد الكيميائية الدقيقة ، والبروتينات السكرية النشطة بيولوجياالمعقدة 6. لا يتطلب إنتاج الموارد البشرية لفول الصويا خبرة واسعة ، حيث يمكن توليدها عن طريق جرح أسطح النبتات ، يليها التلقيح باستخدام Agrobacterium rhizogenes7. تعبر A. rhizogenes عن جينات الفوعة (Vir) المشفرة بواسطة بلازميد Ti الذي ينقل ويحمل ويدمج شريحة T-DNA في جينوم الخلايا النباتية مع تحفيز نمو الجذر خارج الرحم في نفس الوقت8.

بالمقارنة مع أنظمة التعبير الجيني الأخرى لفول الصويا ، مثل biolistics أو التحول القائم على A. tumefaciens، من الأنسجة والخلايا وزراعة الأعضاء، فإن نظام التعبير HR يظهر العديد من المزايا. أولا ، الموارد البشرية مستقرة وراثيا ويتم إنتاجها بسرعة على الوسائط الخالية من الهرمونات1،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للموارد البشرية إنتاج مستقلبات متخصصة بكميات تعادل أو تزيد عن الجذور الأصلية11,12. هذه المزايا تجعل الموارد البشرية أداة تكنولوجيا حيوية مرغوبة لأنواع النباتات التي لا تتوافق مع A. tumefaciens أو التي تتطلب ظروف زراعة الأنسجة الخاصة لتشكيل أنسجة متوافقة. طريقة HR هي طريقة فعالة لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين ، وتوطين البروتين تحت الخلوي ، وإنتاج البروتين المؤتلف ، والمعالجة النباتية ، والطفرات ، وتأثيرات الجينوم الواسعة باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي13،14،15. يمكن استخدامه أيضا لدراسة إنتاج المستقلبات المتخصصة التي لها قيمة في الصناعة ، بما في ذلك الجلسولين ، الذي يعالج دفاع فول الصويا ضد مسببات الأمراض الميكروبية المهمة Phytophthora sojae وله أنشطة رائعة مضادة للسرطان ووقائية عصبية في البشر16,17.

يوضح هذا التقرير بروتوكولا سهلا وفعالا لإنتاج الموارد البشرية لفول الصويا. مقارنة بطرق تحويل الموارد البشرية السابقة ، يوفر هذا البروتوكول تحسنا كبيرا (33٪ -50٪) في معدل تكوين الموارد البشرية عن طريق الفحص المسبق لمحولات A. rhizogenes لوجود بلازميد Ti قبل تلقيح فلقات فول الصويا. نوضح قابلية تطبيق هذا البروتوكول من خلال تحويل العديد من المتجهات الثنائية التي تبالغ في التعبير عن جينات عامل نسخ فول الصويا أو تسكتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يوصى بإجراء جميع خطوات الإجراءات في ظل ظروف معقمة.

1. تعقيم بذور فول الصويا

  1. في خزانة السلامة البيولوجية ، ضع 16-20 بذرة فول الصويا Williams 82 المستديرة في حالة نقية (أي بدون شقوق أو عيوب) في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
  2. أضف 30 مل من كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ ، ورج برفق لمدة 30 ثانية ، ثم صب الكحول.
  3. رج البذور برفق باستخدام 30 مل من المبيض بنسبة 10٪ لمدة 10 ثوان واترك البذور تجلس في المحلول لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT ، 25 درجة مئوية). بعد 5 دقائق ، صفي المبيض.
  4. كرر الرج ثلاث مرات مع 30 مل من H 2 O المعقم عالي النقاء لمدةدقيقة واحدة لكل شطف وتخلص من H2O بين كل شطف.
  5. ضع البذور المعقمة على ورق ترشيح مشبع ب 5 مل من وسط الإنبات والزراعة المشتركة (الأوتوكلاف نصف القوة السائل موراشيج و Skoog [MS] وسط مع 1٪ سكروز [درجة الحموضة = 5.8] ثم أضف 2.5 مل / لتر من الفيتامينات) في أطباق بتري المعقمة.
  6. ضع الألواح في الظلام عند RT (25 درجة مئوية) لمدة 3 أيام قبل نقل الألواح عند 22 درجة مئوية تحت 16 ساعة من مصابيح الفلورسنت T5 البيضاء الباردة (100 μE m-2 · s-1) لمدة 4 أيام للسماح للبذور بالإنبات.
    ملاحظة: تخلص من البذور المجعدة أو المتشققة. أفضل البذور هي تلك الكبيرة والصفراء بشكل موحد. تعقيم ما لا يقل عن ضعف عدد البذور المطلوبة للتجربة لاختيار البذور ذات النوعية الجيدة ، حيث قد لا تكون بعض البذور مثالية بسبب التلف أو الأمراض أو عدم الإنبات.

2. إصابة النبتات ب K599

ملاحظة: استخدم متجهات سلسلة pGWB ، حيث يضمن اختيارها المزدوج التكامل الجينومي لشريط T-DNA بأكمله. تم استخدام التثقيب الكهربائي لتحويل ناقل ثنائي يؤوي الجين محل الاهتمام إلى A. rhizogenes pRi265918.

  1. استنادا إلى تسلسل A. rhizogenes pRi2659 plasmid18 ، صمم الاشعال للكشف عن جين Ti plasmid VirD2 (VirD2 إلى الأمام : 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; عكس VirD2: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; حجم التضخيم المتوقع: 221 نقطة أساس). بعد التحول ، اختبر مستعمرات Agrobacterium للاحتفاظ ب VirD2 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام مجموعة PCR (انظر جدول المواد). دورة PCR: 94 °C لمدة 3 دقائق ؛ 35 دورة (94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة) ؛ و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. بعد اختيار مستعمرة A. rhizogenes التي تحتوي على كل من VirD2 والجين محل الاهتمام (GOI) ، قم بخط بعضها على ألواح Luria-Bertani (LB) المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (50 مجم / لتر) للبلازميد محل الاهتمام واحتضانها طوال الليل عند 30 درجة مئوية. في حالة استخدام سبكتينومايسين ، أضف تركيز 100 مجم / لتر.
  3. استخدم طرف ماصة P200 لكشط طول ~ 1.5 سم من K599 Agrobacterium من ألواح LB وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات (PB ؛ 0.01 M Na2HPO4 ، 0.15 M NaCl ، درجة الحموضة 7.5).
  4. تمييع Agrobacterium في H2O معقم وعالي النقاء (v / v = 1: 1) وأسيتوسيرينجون (AS؛ مخزون 100 mM في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO] ، v / v = 1: 1000). قم بقياس الامتصاص باستخدام أنبوب كوفيت بكثافة بصرية تبلغ 600 نانومتر (OD600). النطاق الأمثل المتوقع هو بين 0.5 و 0.8.
  5. في خزانة السلامة الحيوية ، اغمس مشرطا معقم في محلول K599 Agrobacterium وقم بعمل عدة جروح بعمق 1 مم على طول السطح الداخلي (الجانب المحوري ، المسطح) من النبتة. أثناء التلقيح ، استخدم ملقط معقم لتثبيت النبتة.
  6. ضع حوالي 6-8 فلقات مقطعة من الجانب لأسفل على طبق بتري يحتوي على ورق ترشيح مشبع بوسط GC مع AS.
    ملاحظة: لتحضير 6 ألواح ، يكفي 50 مل من وسط GC و 50 ميكرولتر من 100 mM AS لتحقيق تركيز نهائي قدره 100 ميكرومتر.
  7. احتضان الألواح في RT (25 درجة مئوية) لمدة 3 أيام تحت فترة ضوئية 16 ساعة (~ 65 μE).
  8. نقل النبتات المصابة إلى ألواح نمو الجذور المشعرة (HRG) (الأوتوكلاف نصف قوة MS مع 3٪ سكروز [درجة الحموضة = 5.8] و 2.6 جم / لتر جيلزان ، ثم أضف 2.5 مل / لتر من خليط الفيتامينات و 500 مجم / لتر تيمينتين).
    ملاحظة: كانت هناك بعض المشكلات المتعلقة ب timentin من بعض البائعين البديلين ، والتي لم يتم التخلص من K599 منها. يوصى باستخدام أطباق بتري أطول (100 مم × 25 مم) لمتوسط HRG.
  9. احتضان ألواح HRG عند 22 درجة مئوية في غرفة النمو مع ضبط المعلمات على ضوء 100 μE على فترة ضوئية مدتها 16 ساعة حتى يتم ملاحظة الجذور الأولية ذات الجذور الثانوية بطول 2-3 سم (~ 3-4 أسابيع).

3. اختيار وحصاد الموارد البشرية

  1. حصاد الجذور الأولية (طولها 5-7 سم) التي تنمو من الكالس وتحتوي على جذور ثانوية (طولها 2-3 سم) باستخدام مشرط معقم وملقط. نقل إلى لوحات HRG الاختيار التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. دع الموارد البشرية تنمو لمدة 5 أيام أخرى على لوحات HRG المختارة.
    ملاحظة: عادة ما يستخدم كاناميسين (50 مجم / لتر) أو هيجروميسين (50 مجم / لتر) أو فوسفينوثريسين (10 مجم / لتر) للاختيار. بالنسبة لمتجهات التعبير ، يتم استخدام pGWB2 للتعبير الزائد ، ويستخدم pANDA35HK لإسكات RNAi ، ويستخدم pGWB6 للتوطين تحت الخلوي ، ويستخدم pMDC7 للتعبير المستحث.
  2. في اليوم الخامس ، حصاد الموارد البشرية المعدلة وراثيا ذات الجذور الثانوية بطول 3-6 سم. في حالة ملاحظة البروتينات الفلورية ، فإن الجذور الثانوية لها القليل من التألق الذاتي. في حالة إجراء الاستنباط أو العلاجات الكيميائية ، قطع الجذور الثانوية إلى قطع 1 سم ووضع ~ 100 ملغ على أجار HRG في كومة. بعد ذلك ، قم بتشبع الأكوام ب 80 ميكرولتر من العلاج المناسب واترك الألواح تحضن عند RT (25 درجة مئوية).
  3. بعد وقت العلاج المطلوب ، تابع استخراج الحمض النووي الريبي أو المستقلب.
  4. بالنسبة للحمض النووي الريبي ، جفف الجذور بسرعة على منشفة ورقية معقمة واحصدها مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
  5. أغلق الجزء العلوي من الأنبوب على الفور باستخدام parafilm ، وقم بعمل فتحتين صغيرتين باستخدام ملقط مدبب ، واغمر الأنابيب في النيتروجين السائل. تجفلى لمدة 3 أيام ، ثم قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: من الضروري تحديد الموارد البشرية البيضاء. بعد 5 أيام من النمو على اللوحة الانتقائية ، ستبقى الموارد البشرية المعدلة وراثيا بيضاء ، لكن الجذور غير المعدلة وراثيا ستتحول إلى اللون البني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج التمثيلية مأخوذة من البيانات المنشورة19,20. تظهر نتائج مستعمرة PCR (cPCR) للبكتيريا الزراعية K599 المحولة في الشكل 1. كما هو موضح في المستعمرات الإيجابية في الشكل 1 ، تم الكشف عن الجين محل الاهتمام بواسطة cPCR (الشكل 1A). ومع ذلك ، كان ثلث إلى نصف المستعمرات سلبيا لفحص جين VirD2 (الشكل 1B) ، مما يشير إلى فقدان بلازميد Ti ، ولن يكون قادرا على توليد جذور الكالس أو الشعر. يوضح الشكل 2 إجراء التحضير العام ل HRs لفول الصويا وتحليل التعبير الجيني. يوضح الشكل 3 التوطين تحت الخلوي ل GFP-GmJAZ1-6. الشكل 4 هو تحليل التعبير الجيني الذي يوضح الإفراط في التعبير عن عامل نسخ الجلسولين GmHSF6-1 وإسكات الحمض النووي الريبي ل GmMYB29A2 في جذور ويليامز 82 المشعرة. تم الحصول على نتائج مماثلة في العديد من التقارير الأخيرة20,21.

Figure 1
الشكل 1: مستعمرة PCR (cPCR) من K599 Agrobacterium باستخدام مستعمرة PCR البادئات من الجين محل الاهتمام أو VirD2. أ: جين الفائدة cPCR. (ب) VirD2 cPCR. الاختصارات: C = مستعمرة. + ve = السيطرة الإيجابية ؛ -ve = السيطرة السلبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة على ثقافة جذر فول الصويا المشعر (HR) وإجراء تحليل وظيفة الجينات. النسيج التي تشكلت على موقع الجرح 2 أسابيع بعد عدوى K599 Agrobacterium . حدث تمايز الخلايا بعد أسبوع واحد ، ثم انقضى أسبوع واحد لاستطالة HR. تبع ذلك حصاد الموارد البشرية ومحفز الجلوكان الجداري (WGE) / العلاج الوهمي لمدة 24 ساعة. تم إخضاع HRs لاستخراج المستقلب لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) وعزل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير الجيني ، على التوالي. WGE هو مستنبط جلوكان الجدار من فيتوفثورا سوجاي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الفحص المجهري الفلوري ل GmJAZ1-6 المنصهر بشكل متعدي مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) في جذور ويليامز 82 المشعرة المعدلة وراثيا. (أ) القناة الخضراء (GFP). (ب) القناة الزرقاء (DAPI). (ج) دمج القناتين الخضراء والزرقاء. تم جمع جميع الصور باستخدام مجهر زايس متحد البؤر. تشير صور DAPI (6 ميكروغرام / مل) إلى تلطيخ نووي. قضبان المقياس هي 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل التعبير الجيني. (أ) التعبير الجيني في التعبير المفرط عن GmHSF6-119 Williams 82 HRs فول الصويا تحت 24 ساعة علاج وهمي أو مستنبط لمدة 24 ساعة مع WGE. (ب) التعبير الجيني في RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 HRs فول الصويا المستنبطة لمدة 24 ساعة مع WGE. WGE هو مستنبط جلوكان الجدار من فيتوفثورا سوجاي. أأكبر بكثير و بأقل بكثير من التحكم ، اختبار t للطلاب المقترن (p < 0.01). تمثل أشرطة الخطأ SE (n ≥ 3 نسخ مكررة بيولوجية). تشير الجذور الثانوية التي تم جمعها من جذر أولي واحد إلى تضاعف بيولوجي واحد. وقد عدل هذا الرقم بإذن من Lin et al.19 و Jahan et al.20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خلال العقد الماضي ، تم تطوير طريقة HR لفول الصويا كأداة قوية لدراسة الجينات المشاركة في تثبيت النيتروجين 22,23 ، وتحمل الإجهاد الحيوي وغير الحيوي 24,25 ، ومسارات الأيض الحيوي 26,27. إن معرفة كيفية إنتاج النباتات للمستقلبات لها عدد كبير من الفوائد للإنتاج الزراعي وصناعة الأدوية ، حيث يمكن استخدامها لدراسة شبكات الجينات التي تشارك في التوسط في الدفاعات الكيميائية الحيوية ضد مسببات الأمراض28.

لتحديد أولويات الإنتاجية وكفاءة التكلفة ، يبسط هذا البروتوكول الإجراء. على سبيل المثال ، بدلا من استخدام وسائط صلبة أكثر تكلفة تحتوي على عامل تبلور ، تنبت بذور فول الصويا في ظروف معقمة باستخدام مناشف ورقية من الدرجة الصناعية مشبعة بوسط نمو سائل. تعد تقنيات المختبر المعقم والحفاظ على ظروف العمل المعقمة ضرورية لتجارب تحويل الموارد البشرية ، نظرا لأن مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة ، مثل الفطريات والخميرة ، يمكن أن تسبب تلوث الثقافات في المختبر .

بالإضافة إلى ذلك ، يعد استخدام الكثافة المناسبة للضوء والفترة الضوئية أمرا بالغ الأهمية لثقافة الموارد البشرية. تتأثر عملية نمو وتطور النباتات في الثقافات المختبرية بشكل كبير بجودة شدة الضوء والفترة الضوئية ، كما لوحظ في العديد من الدراسات السابقة. إذا كانت شدة الضوء منخفضة جدا أو عالية جدا ، فقد يؤدي ذلك إلى إبطاء عملية تحريض الجذر. وبالمثل ، إذا كانت الفترة الضوئية غير مناسبة ، فقد تؤدي إلى فشل تكوين الكالس وتطور الخلايا المتمايز29. علاوة على ذلك ، بناء على تجاربنا السابقة ، فإن HRs غير المعدلة وراثيا مقاومة للكاناميسين (50 مجم / لتر) عند استخدامها كمضاد حيوي وحيد. لهذا السبب ، نستخدم عادة المتجهات التي تشفر المقاومة المزدوجة للهيجروميسين والكاناميسين. في ظل هذا الاختيار الصارم ، نحن قادرون على الحصول على معدل موارد بشرية معدل وراثيا إيجابي يبلغ 15٪ -30٪ من إجمالي الجذور ، ومع ذلك ~ 80٪ من هؤلاء الموارد البشرية لديهم جينات مفرطة في التعبير / إسكات بشكل كبير كما تم ترميزها بواسطة النواقل.

لضمان نجاح تجارب تحويل الموارد البشرية ، من الأهمية بمكان اختبار ما إذا كانت سلالة A. rhizogenes المستخدمة في التجربة تحتفظ ببلازميد Ti الذي يشفر جينات الفوعة. يعد وجود بلازميد Ti ضروريا للاندماج الناجح للحمض النووي التائي في جينوم النبات4. أصبح استخدام cPCR للكشف عن بلازميد Ti خطوة أساسية في هذا البروتوكول. في الماضي ، وجدنا أن 33٪ -50٪ من تحولاتنا ستفشل في إنتاج كالي وجذور. تدري ، كان هذا بسبب فقدان بلازميد Ti أثناء التحول أو الزراعة اللاحقة ل A. rhizogenes. الآن ، من خلال تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل لمستعمرات Agrobacterium بعد تحولها ، نضمن وجود بلازميد Ti وأن 100٪ من تجارب التحول تنتج جذورا. أثبت استخدام cPCR في هذا البروتوكول أنه إضافة قيمة لإجراء تحويل الموارد البشرية القياسي. لقد قلل من عدد التجارب الفاشلة ، وبالتالي توفير الوقت والموارد. سمحت لنا خطوة cPCR أيضا بتأكيد أن عملية التحويل تعمل على النحو المنشود ، مما يضمن أن نتائج التجارب موثوقة وقابلة للتكرار.

على الرغم من ذلك ، فإن هذه الطريقة المبسطة لها بعض القيود. على سبيل المثال ، يمكن لهذا البروتوكول الإجابة على الأسئلة البيولوجية الأساسية للخلية حول وظائف الجينات في الموارد البشرية المعدلة وراثيا. ومع ذلك ، قد لا تكون الأسئلة المتعلقة بالأنسجة النباتية الأخرى ، مثل البراعم والأوراق ، قابلة للاختبار في الموارد البشرية. من المهم دائما التأكد من أن العملية التي تتم دراستها لا تتأثر بمستويات الهرمون خارج الرحم أو العوامل الأخرى التي أدخلتها A. rhizogenes. يجب على الباحثين ملاحظة حدودها وتصميم التجارب بعناية لضمان نتائج دقيقة وذات مغزى.

باختصار ، البروتوكول الموضح هنا هو طريقة عالية الكفاءة للتحقق من وظيفة الجينات في جذور فول الصويا. لقد أثبتنا مؤخرا قيمته في دراسة مناهج الهندسة متعددة الجينات وفهم شبكات الجينات المشاركة في تنظيم الدفاعات الكيميائية الحيوية لفول الصويا19. الكفاءة النسبية لهذا النهج تجعله مثاليا للإجابة على الأسئلة المعقدة في بيولوجيا النبات التي تتطلب التحقيق في العديد من الجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC) رقم المنحة RGPIN-2020-06111 وبتبرع سخي من براد ليس. نود أن نشكر واين باروت (جامعة جورجيا) على K599 Agrobacterium والبروتوكول الأولي ، ومختبر Nakagawa & Hachiya (جامعة شيمانه) على المتجهات الفارغة pGWB2 و pGWB6 و pANDA35HK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone Cayman 23224
Bleach lavo 21124
DMSO Fisher bioreagents 195679
Gelzan Phytotech HYY3251089A
Hygromycin Phytotech HHA0397050B
Isopropyl alcohol Fisher chemical 206462
Kanamycin Phytotech SQS0378007G
LB powder Fisher bioreagents 200318
MS powder Caisson labs 2210001
Na2HPO4 Fisher bioreagents 194171
NaCl Fisher chemical 192946
Petri dishes Fisherbrand 08-757-11 100 mm x 25 mm
Phosphinothricin Cedarlane P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit Sigma R4775
Sucrose Bioshop 2D76475
Timentin Caisson labs 12222002
Vitamins Caisson labs 2211010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246 (2017).
  2. Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner. Scientific Reports. 10, 1619 (2020).
  3. Huang, X. -F., et al. Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities. Botany. 92 (4), 267-275 (2014).
  4. Ma, H., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus. Frontiers in Plant Science. 13, 1039094 (2022).
  5. Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications. The Arabidopsis Book. 15, e0186 (2017).
  6. Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
  7. Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
  8. Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
  9. Chen, L., et al. Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).
  10. Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method. Current Protocols. 1 (7), e195 (2021).
  11. Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures. Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).
  12. Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I. Molecules. 22 (8), 1261 (2017).
  13. Cheng, Y., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean. Plant Methods. 17 (1), 73 (2021).
  14. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).
  15. Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation. Frontiers in Plant Science. 10, 1427 (2019).
  16. Ahmed, S., Kovinich, N. Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health. Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).
  17. Walker, R. R., et al. Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887 (2022).
  18. Tong, X., et al. The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots. International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).
  19. Lin, J., et al. RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1. Plants. 12 (3), 545 (2023).
  20. Jahan, M. A., et al. Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).
  21. Jahan, M. A., et al. The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean. BMC Genomics. 20, 149 (2019).
  22. Nguyen, C. X., et al. Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development. The Plant Genome. , e20171 (2021).
  23. Brear, E. M., et al. GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation. New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).
  24. Chen, Z., et al. Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants. Agronomy. 11 (1), 170 (2021).
  25. Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode. Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).
  26. Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).
  27. Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.). Molecules. 27 (18), 6118 (2022).
  28. Lozovaya, V. V., et al. Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani. Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).
  29. Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 195 ، الجلايسين ماكس ، جذور الشعر ، التحول ، التعبير الجيني ، علم الجينوم الوظيفي ، جذور Agrobacterium
تحويل جذر فول الصويا المشعر لتحليل وظيفة الجينات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, J., Wi, D., Ly, M., Jahan, M.… More

Lin, J., Wi, D., Ly, M., Jahan, M. A., Pullano, S., Martirosyan, I., Kovinich, N. Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function. J. Vis. Exp. (195), e65485, doi:10.3791/65485 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter