Summary
Här presenterar vi ett protokoll för högeffektiv produktion av transgena sojabönor håriga rötter.
Abstract
Sojabönor (Glycine max) är en värdefull gröda i jordbruket som har tusentals industriella användningsområden. Sojabönor rötter är den primära platsen för interaktion med jordburna mikrober som bildar symbios för att fixera kväve och patogener, vilket gör forskning som involverar sojabönrotgenetik av största vikt för att förbättra sin jordbruksproduktion. Den genetiska omvandlingen av sojabönor håriga rötter (HR) förmedlas av Agrobacterium rhizogenes stam NCPPB2659 (K599) och är ett effektivt verktyg för att studera genfunktionen i sojabönor, som bara tar 2 månader från början till slut. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som beskriver metoden för att överuttrycka och tysta en gen av intresse för sojabönor. Denna metod inkluderar sterilisering av sojabönor, infektion av kotyledoner med K599 och selektion och skörd av genetiskt transformerade HRs för RNA-isolering och, om det är motiverat, metabolitanalyser. Genomströmningen av tillvägagångssättet är tillräcklig för att samtidigt studera flera gener eller nätverk och kan bestämma de optimala tekniska strategierna innan man förbinder sig till långsiktiga stabila transformationsmetoder.
Introduction
Sojabönor (Glycine max) är bland de mest värdefulla grödorna inom jordbruket. Det har tusentals kommersiella och industriella användningsområden, såsom mat, djurfoder, olja och som en källa till råvaror för tillverkning1. Dess förmåga att bilda ett symbiotiskt förhållande med kvävefixerande markmikroorganismer, nämligen rhizobia, höjer ytterligare vikten av att studera sojaböngenetik2. Till exempel kan finjustering av kvävefixeringsegenskaper i sojabönrötter leda till minskade koldioxidutsläpp och kraftigt minska kraven på kvävegödsel3. Således har förståelsen av genetiken som styr aspekter av sojabönrotbiologi i synnerhet breda tillämpningar inom jordbruk och industri. Med tanke på dessa fördelar är det viktigt att ha ett tillförlitligt protokoll för att analysera funktionen av sojaböngener.
Agrobacterium tumefaciens är kanske det mest använda verktyget för växtgenetisk omvandling eftersom den har förmågan att integrera överförings-DNA (T-DNA) i kärngenomet hos många växtarter. När Agrobacterium infekterar en växt, Det överför tumörinducerande (Ti) plasmiden till värdkromosomen, vilket leder till bildandet av en tumör på infektionsstället. Den Agrobacterium-medierade transformationen har använts i stor utsträckning i årtionden för genfunktionell analys och för att modifiera grödegenskaper4. Även om vilken gen som helst av intresse lätt kan överföras till värdväxtceller genom A. tumefaciens-medierad transformation, har denna metod flera nackdelar; Det är tidskrävande, dyrt och kräver omfattande expertis för många växtarter, såsom sojabönor. Även om några sorter av sojabönor kan omvandlas genom den kotyledonära nodmetoden med hjälp av A. tumefaciens, kräver ineffektiviteten i detta tillvägagångssätt behovet av en alternativ genetisk transformationsteknik som är snabb och mycket effektiv 4,5. Även en icke-expert kan använda denna Agrobacterium rhizogenes-medierad hårig rot (HR) transformationsmetod för att övervinna dessa nackdelar.
HR-transformation är ett relativt snabbt verktyg, inte bara för att analysera genfunktion utan också för biotekniska tillämpningar, såsom produktion av specialiserade metaboliter och finkemikalier och komplexa bioaktiva glykoproteiner6. Produktionen av HR-skivor av sojabönor kräver inte omfattande expertis, eftersom de kan genereras genom att skada ytorna på kotyledoner, följt av inokulering med Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes uttrycker virulensgener (Vir) som kodas av dess Ti-plasmid som överför, bär och integrerar sitt T-DNA-segment i genomet av växtceller samtidigt som de stimulerar ektopisk rottillväxt8.
Jämfört med andra system för uttryck av sojabönsgener, såsom biolistik eller A. tumefaciens-baserad transformation av vävnad, cell och organodling, uppvisar HR-uttryckssystemet flera fördelar. För det första är HR genetiskt stabila och produceras snabbt på hormonfria medier 1,9,10. Dessutom kan HR producera specialiserade metaboliter i mängder som motsvarar eller är större än inhemska rötter11,12. Dessa fördelar gör HR till ett önskvärt biotekniskt verktyg för växtarter som är oförenliga med A. tumefaciens eller som kräver speciella vävnadsodlingsförhållanden för att bilda kompatibla vävnader. HR-metoden är ett effektivt tillvägagångssätt för att analysera protein-proteininteraktioner, proteinsubcellulär lokalisering, rekombinant proteinproduktion, fytoremediering, mutagenes och genomomfattande effekter med hjälp av RNA-sekvensering13,14,15. Det kan också användas för att studera produktionen av specialiserade metaboliter som har värde i branschen, inklusive glyceolliner, som medicinerar sojabönans försvar mot den viktiga mikrobiella patogenen Phytophthora sojae och har imponerande anticancer och neuroprotektiva aktiviteter hos människor16,17.
Denna rapport visar ett enkelt och effektivt protokoll för att producera sojabönor. Jämfört med tidigare HR-transformationsmetoder ger detta protokoll en signifikant (33% -50%) förbättring av HR-bildningshastigheten genom prescreening av A. rhizogenes-transformanter för närvaron av Ti-plasmiden före inokulering av sojabönkotyledoner. Vi demonstrerar tillämpligheten av detta protokoll genom att transformera flera binära vektorer som överuttrycker eller tystar sojaböntranskriptionsfaktorgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Det rekommenderas att alla steg utförs under sterila förhållanden.
1. Sterilisering av sojabönor
- I ett biosäkerhetsskåp, placera 16-20 runda Williams 82 sojabönor i orört skick (dvs inga sprickor eller fläckar) i ett 50 ml centrifugrör.
- Tillsätt 30 ml 70% isopropylalkohol, skaka försiktigt i 30 sekunder och dekantera sedan alkoholen.
- Skaka försiktigt fröna med 30 ml 10% blekmedel i 10 sekunder och låt fröna sitta i lösningen i 5 minuter vid rumstemperatur (RT, 25 ° C). Efter 5 min, töm blekmedlet.
- Upprepa skakningen tre gånger med 30 ml steril ultraren H2O i 1 min per sköljning och kastaH2Omellan varje sköljning.
- Placera de steriliserade fröna på filterpapper mättat med 5 ml gronings- och samodlingsmedium (GC) medium (autoklav halvhållfast vätska Murashige och Skoog [MS] medium med 1% sackaros [pH = 5,8] och tillsätt sedan 2,5 ml / L vitaminer) i sterila petriskålar.
- Placera plattorna i mörker vid rumstemperatur (25 °C) i 3 dagar innan plattorna överförs vid 22 °C under 16 timmar kallvita T5-lysrör (100 μE m-2·s-1) i 4 dagar så att fröna kan gro.
OBS: Kassera frön som är skrynkliga eller spruckna. De bästa fröna är de som är stora och enhetligt gula. Sterilisera minst dubbelt så många frön som krävs för experimentet för att välja frön av god kvalitet, eftersom vissa frön kanske inte är optimala på grund av skador, sjukdomar eller misslyckande med att gro.
2. Infektion av hjärtblad med K599
OBS: Använd vektorer i pGWB-serien, eftersom deras dubbla urval säkerställer genomisk integration av hela T-DNA-kassetten. Elektroporering användes för att omvandla en binär vektor som innehåller genen av intresse till A. rhizogenes pRi265918.
- Baserat på sekvensen av A. rhizogenes pRi2659 plasmid18, designa primers för att detektera Ti-plasmidgenen VirD2 (VirD2 framåt: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 omvänd: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Förväntad förstärkningsstorlek: 221 bp). Efter omvandling, testa Agrobacterium-kolonierna för retention av VirD2 genom polymeraskedjereaktion (PCR) med hjälp av ett PCR-kit (se materialtabell). PCR-cykel: 94 °C i 3 minuter; 35 cykler (94 °C i 1 min, 58 °C i 30 sek, 72 °C i 1 min). och 72 °C i 10 minuter.
- Efter selektion av kolonin A. rhizogenes som innehåller både VirD2 och genen av intresse (GOI), stryk ut några på Luria-Bertani (LB) mediumplattor som innehåller lämpliga antibiotika (50 mg/L) för plasmiden av intresse och inkubera över natten vid 30 °C. Om spektinomycin används, tillsätt en koncentration på 100 mg/l.
- Använd en P200-pipettspets för att skrapa bort en ~ 1,5 cm längd av K599 Agrobacterium från LB-plattorna och resuspendera cellerna i 1 ml fosfatbuffert (PB; 0,01 MNa2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
- Späd Agrobacterium i steriliserad, ultrarenH2O(v/v = 1:1) och acetosyringon (AS; 100 mM lager i dimetylsulfoxid [DMSO], v/v = 1:1000). Mät absorbansen med ett kyvettrör med en optisk densitet på 600 nm (OD600). Det förväntade optimala intervallet är mellan 0,5 och 0,8.
- Doppa en steriliserad skalpell i K599 Agrobacterium-lösningen i ett biosäkerhetsskåp och gör flera 1 mm djupa snitt längs den inre ytan (adaxial, plan sida) av cotyledon. Under ympningen, använd steriliserade pincett för att stabilisera cotyledon.
- Placera cirka 6-8 kotyledoner skurna med sidan nedåt på en petriskål som innehåller filterpapper mättat med GC-medium med AS.
OBS: För att bereda 6 plattor är 50 ml GC-medium och 50 μL 100 mM AS för att uppnå en slutlig koncentration på 100 μM tillräcklig. - Inkubera plattorna vid rumstemperatur (25 °C) i 3 dagar under en fotoperiod på 16 timmar (~65 μE).
- Överför de infekterade kotyledonerna till håriga rottillväxtplattor (HRG) (autoklav halvstyrka MS med 3% sackaros [pH = 5,8] och 2,6 g / L Gelzan, tillsätt sedan 2,5 ml / L vitaminblandning och 500 mg / L timentin).
OBS: Det fanns några problem med timentin från vissa alternativa leverantörer, varav K599 inte eliminerades. Det rekommenderas att använda högre petriskålar (100 mm x 25 mm) för HRG-medium. - Inkubera HRG-plattorna vid 22 °C i en tillväxtkammare med parametrarna inställda på 100 μE ljus under en 16 timmars fotoperiod tills primära rötter med sekundära rötter 2-3 cm långa observeras (~3-4 veckor).
3. Urval och skörd av HRs
- Skörda primära rötter (5-7 cm långa) som växer från callus och innehåller sekundära rötter (2-3 cm långa) med en steril skalpell och pincett. Överför HRG-plattor som innehåller lämpliga antibiotika till urvalet. Låt HR: erna växa i ytterligare 5 dagar på HRG-plattorna.
OBS: Kanamycin (50 mg / L), hygromycin (50 mg / L) eller fosfinotricin (10 mg / L) används vanligtvis för urval. För uttrycksvektorer används pGWB2 för överuttryck, pANDA35HK används för RNAi-tystnad, pGWB6 används för subcellulär lokalisering och pMDC7 används för inducerbart uttryck. - På dag 5, skörda transgena HR med sekundära rötter 3-6 cm långa. Om man observerar fluorescerande proteiner har sekundärrötterna liten autofluorescens. Om du utför elicitor eller kemiska behandlingar, skär sekundärrötterna i 1 cm bitar och placera ~ 100 mg på HRG-agar i en hög. Mätt sedan pålarna med 80 μl lämplig behandling och låt plattorna inkubera vid rumstemperatur (25 °C).
- Efter önskad behandlingstid, fortsätt med RNA- eller metabolitextraktioner.
- För RNA, dutta snabbt rötterna torra på en steriliserad pappershandduk och skörda dem direkt i ett 2 ml mikrocentrifugrör.
- Försegla omedelbart toppen av röret med parafilm, gör två små hål med spetsiga pincett och sänk ner rören i flytande kväve. Frystorka i 3 dagar och förvara sedan proverna vid -80 °C.
OBS: Det är viktigt att välja HR som är vita. Efter 5 dagars tillväxt på den selektiva plattan kommer transgena HR att förbli vita, men icke-transgena rötter blir bruna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa resultaten är från publicerade data 19,20. Koloni-PCR-resultaten (cPCR) för den transformerade K599 Agrobacterium visas i figur 1. Som indikeras av de positiva kolonierna i figur 1 detekterades genen av intresse med cPCR (figur 1A). En tredjedel till hälften av kolonierna var dock negativa för VirD2-genscreening (figur 1B), vilket indikerar förlusten av Ti-plasmiden, och skulle inte kunna generera kallus eller håriga rötter. Figur 2 illustrerar den övergripande beredningsproceduren för sojabönor och genuttrycksanalys. Figur 3 visar den subcellulära lokaliseringen av GFP-GmJAZ1-6. Figur 4 är en genuttrycksanalys som visar överuttryck av glyceollintranskriptionsfaktorn GmHSF6-1 och RNAi-tystning av GmMYB29A2 i Williams 82 håriga rötter. Liknande resultat har erhållits i flera senaste rapporter20,21.
Figur 1: Koloni-PCR (cPCR) av K599 Agrobacterium med hjälp av koloni-PCR-primrar av genen av intresse eller VirD2. (A) Gen av intresse cPCR. b) VirD2 cPCR. Förkortningar: C = koloni; +ve = positiv kontroll; -ve = negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Översikt över sojabönans håriga rotkultur (HR) och genfunktionsanalysprocedur. Förhårdnader bildas på sårplatsen 2 veckor efter K599 Agrobacterium-infektion . Celldifferentiering inträffade efter 1 vecka, sedan 1 vecka förflutit för HR-förlängning. Detta följdes av HR-skörd och väggglukanelicitor (WGE)/mockbehandling i 24 timmar. HR: erna utsattes för metabolitextraktion för UPLC-analys (ultra performance liquid chromatography) respektive RNA-isolering för genuttrycksanalys. WGE är väggglukanframkallaren från Phytophthora sojae. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fluorescensmikroskopi av GmJAZ1-6 translationellt smält till ett grönt fluorescerande protein (GFP) i transgena Williams 82 håriga rötter. (A) Grön kanal (GFP). (B) Blå kanal (DAPI). (C) Sammanslagna gröna och blå kanaler. Alla bilder samlades in med hjälp av ett Zeiss-konfokalmikroskop. DAPI-bilder (6 μg/ml) indikerar kärnfärgning. Skalstrecken är 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av genuttryck. (A) Genuttryck vid överuttryck av GmHSF6-119 Williams 82 sojabönor under 24 timmars skenbehandling eller framkallad i 24 timmar med WGE. (B) Genuttryck i RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 sojabönor HRs framkallade i 24 timmar med WGE. WGE är väggglukanframkallaren från Phytophthora sojae. aSignifikant större och bbetydligt mindre än kontroll, parade studenter t-test (p < 0,01). Felstaplar representerar SE (n ≥ 3 biologiska replikat). Sekundära rötter som samlats in från en primärrot indikerade en biologisk replikat. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Lin et al.19 och Jahan et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under det senaste decenniet har sojabönans HR-metod utvecklats som ett kraftfullt verktyg för att studera gener involverade i kvävefixering 22,23, biotisk och abiotisk stresstolerans 24,25 och metabolitbiosyntetiska vägar 26,27. Kunskapen om hur växter producerar metaboliter har en uppsjö av fördelar för jordbruksproduktion och läkemedelsindustrin, eftersom den kan användas för att studera gennätverk som är involverade i att förmedla biokemiska försvar mot patogener28.
För att prioritera produktivitet och kostnadseffektivitet förenklar detta protokoll proceduren. Till exempel, istället för att använda dyrare fasta medier som innehåller ett gelningsmedel, groddar sojabönfrön under sterila förhållanden med hjälp av pappershanddukar av industriell kvalitet mättade med flytande tillväxtmedium. Aseptiska laboratorietekniker och upprätthållande av sterila arbetsförhållanden är avgörande för HR-transformationsexperiment, eftersom ett brett spektrum av mikroorganismer, såsom svampar och jäst, kan orsaka kontaminering av in vitro-kulturer .
Dessutom är det viktigt att använda lämplig ljusintensitet och fotoperiod för HR-kulturen. Växternas tillväxt- och utvecklingsprocess i in vitro-kulturer påverkas signifikant av kvaliteten på ljusintensitet och fotoperiod, vilket observerats i olika tidigare studier. Om ljusintensiteten är antingen för låg eller för hög kan det sakta ner processen med rotinduktion. På samma sätt, om fotoperioden är olämplig, kan det leda till misslyckande av kallusbildning och differentierad cellutveckling29. Dessutom, baserat på våra tidigare experiment, är icke-transgena HR resistenta mot kanamycin (50 mg / L) när de används som enda antibiotikum. Av denna anledning använder vi vanligtvis vektorer som kodar för dubbel resistens för hygromycin och kanamycin. Under detta stränga urval kan vi få en positiv transgen HR-hastighet på 15% -30% av de totala rötterna, men ~ 80% av dessa HR har signifikant överuttryckta / tystade gener som kodas av vektorerna.
För att säkerställa framgången för HR-transformationsexperiment är det viktigt att testa om A. rhizogenes-stammen som används i experimentet behåller Ti-plasmiden som kodar för virulensgener. Närvaron av Ti-plasmiden är nödvändig för framgångsrik integration av T-DNA i växtgenomet4. Användningen av cPCR för att detektera Ti-plasmiden har blivit ett viktigt steg i detta protokoll. Tidigare fann vi att 33% -50% av våra omvandlingar skulle misslyckas med att producera calli och rötter. Omedvetet berodde detta på förlusten av Ti-plasmiden under omvandlingen eller efterföljande odling av A. rhizogenes. Nu, genom PCR-analys av Agrobacterium-kolonierna efter deras omvandling, säkerställer vi att Ti-plasmiden är närvarande och att 100% av transformationsexperimenten producerar rötter. Användningen av cPCR i detta protokoll har visat sig vara ett värdefullt komplement till den vanliga HR-transformationsproceduren. Det har minskat antalet misslyckade experiment och därmed sparat både tid och resurser. cPCR-steget har också gjort det möjligt för oss att bekräfta att transformationsprocessen fungerar som avsett, vilket säkerställer att experimentens resultat är tillförlitliga och reproducerbara.
Trots detta har denna förenklade metod vissa begränsningar. Till exempel kan detta protokoll svara på grundläggande cellbiologiska frågor om genfunktioner i transgena HR. Frågor som rör andra växtvävnader, såsom skott och löv, kan dock inte testas i HR. Det är alltid viktigt att bekräfta att processen som studeras inte påverkas av ektopiska hormonnivåer eller andra faktorer som införts av A. rhizogenes. Forskare bör notera dess begränsningar och noggrant utforma experiment för att säkerställa exakta och meningsfulla resultat.
Sammanfattningsvis är protokollet som demonstreras här en mycket effektiv metod för att undersöka genfunktion i sojabönor. Vi har nyligen visat sitt värde för att studera multigentekniska metoder och förstå gennätverk som är involverade i reglering av sojabönors biokemiska försvar19. Tillvägagångssättets relativa effektivitet gör den idealisk för att svara på komplexa frågor inom växtbiologi som kräver undersökning av många gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) bidragsnummer RGPIN-2020-06111 och genom en generös donation från Brad Lace. Vi vill tacka Wayne Parrott (University of Georgia) för K599 Agrobacterium och det preliminära protokollet, och Nakagawa & Hachiya lab (Shimane University) för de tomma vektorerna pGWB2, pGWB6 och pANDA35HK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
References
- Li, S., et al.
- Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner. Scientific Reports. 10, 1619 (2020).
- Huang, X. -F., et al. Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities. Botany. 92 (4), 267-275 (2014).
- Ma, H., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus. Frontiers in Plant Science. 13, 1039094 (2022).
- Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications. The Arabidopsis Book. 15, e0186 (2017).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Chen, L., et al. Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).
- Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method. Current Protocols. 1 (7), e195 (2021).
- Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures. Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).
- Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I. Molecules. 22 (8), 1261 (2017).
- Cheng, Y., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean. Plant Methods. 17 (1), 73 (2021).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).
- Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation. Frontiers in Plant Science. 10, 1427 (2019).
- Ahmed, S., Kovinich, N. Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health. Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).
- Walker, R. R., et al. Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887 (2022).
- Tong, X., et al. The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots. International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).
- Lin, J., et al. RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1. Plants. 12 (3), 545 (2023).
- Jahan, M. A., et al. Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).
- Jahan, M. A., et al. The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean. BMC Genomics. 20, 149 (2019).
- Nguyen, C. X., et al. Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development. The Plant Genome. , e20171 (2021).
- Brear, E. M., et al. GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation. New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).
- Chen, Z., et al. Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants. Agronomy. 11 (1), 170 (2021).
- Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode. Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).
- Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.). Molecules. 27 (18), 6118 (2022).
- Lozovaya, V. V., et al. Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani. Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).
- Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).
