Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la produzione ad alta efficienza di radici pelose di soia transgeniche.
Abstract
La soia (Glycine max) è una coltura preziosa in agricoltura che ha migliaia di usi industriali. Le radici di soia sono il sito primario di interazione con i microbi del suolo che formano simbiosi per fissare azoto e agenti patogeni, il che rende la ricerca che coinvolge la genetica delle radici di soia di primaria importanza per migliorare la sua produzione agricola. La trasformazione genetica delle radici pelose di soia (HR) è mediata dal ceppo Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) ed è uno strumento efficace per studiare la funzione genica nelle radici di soia, impiegando solo 2 mesi dall'inizio alla fine. Qui, forniamo un protocollo dettagliato che delinea il metodo per sovraesprimere e silenziare un gene di interesse nelle HR della soia. Questa metodologia include la sterilizzazione dei semi di soia, l'infezione dei cotiledoni con K599 e la selezione e la raccolta di HR geneticamente trasformati per l'isolamento dell'RNA e, se giustificato, l'analisi dei metaboliti. Il throughput dell'approccio è sufficiente per studiare simultaneamente diversi geni o reti e potrebbe determinare le strategie ingegneristiche ottimali prima di impegnarsi in approcci di trasformazione stabili a lungo termine.
Introduction
La soia (Glycine max) è tra le colture più preziose in agricoltura. Ha migliaia di usi commerciali e industriali, come cibo, mangimi, petrolio e come fonte di materie prime per la produzione1. La sua capacità di formare una relazione simbiotica con i microrganismi del suolo che fissano l'azoto, vale a dire la rizobia, eleva ulteriormente l'importanza di studiare la genetica della soia2. Ad esempio, la messa a punto delle proprietà di fissazione dell'azoto nelle radici di soia può portare alla riduzione delle emissioni di carbonio e ridurre notevolmente i requisiti per il fertilizzante azotato3. Pertanto, la comprensione della genetica che controlla gli aspetti della biologia delle radici di soia, in particolare, ha ampie applicazioni in agricoltura e nell'industria. Considerando questi benefici, è importante disporre di un protocollo affidabile per analizzare la funzione dei geni della soia.
Agrobacterium tumefaciens è forse lo strumento più comunemente usato per la trasformazione genetica delle piante in quanto ha la capacità di integrare il DNA di trasferimento (T-DNA) nel genoma nucleare di molte specie vegetali. Quando Agrobacterium infetta una pianta, trasferisce il plasmide che induce il tumore (Ti) nel cromosoma ospite, portando alla formazione di un tumore nel sito di infezione. La trasformazione mediata da Agrobacterium è stata ampiamente utilizzata per decenni per l'analisi funzionale genica e al fine di modificare i tratti delle colture4. Sebbene qualsiasi gene di interesse possa essere facilmente trasferito nelle cellule della pianta ospite attraverso la trasformazione mediata da A. tumefaciens, questo metodo presenta diversi inconvenienti; È dispendioso in termini di tempo, costoso e richiede una vasta esperienza per molte specie di piante, come la soia. Sebbene alcune varietà di soia possano essere trasformate dall'approccio del nodo cotiledonario utilizzando A. tumefaciens, l'inefficienza di questo approccio richiede la necessità di una tecnologia di trasformazione genetica alternativa che sia rapida e altamente efficiente 4,5. Anche un non esperto può utilizzare questo metodo di trasformazione della radice pelosa (HR) mediata da Agrobacterium rhizogenes per superare questi svantaggi.
La trasformazione HR è uno strumento relativamente veloce, non solo per analizzare la funzione genica, ma anche per applicazioni biotecnologiche, come la produzione di metaboliti specializzati e chimica fine e complesse glicoproteine bioattive6. La produzione di HR di soia non richiede competenze approfondite, in quanto possono essere generate ferendo le superfici dei cotiledoni, seguita dall'inoculazione con Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes esprime geni di virulenza (Vir) codificati dal suo plasmide Ti che trasferiscono, trasportano e integrano il suo segmento di T-DNA nel genoma delle cellule vegetali stimolando contemporaneamente la crescita delle radici ectopiche8.
Rispetto ad altri sistemi di espressione genica della soia, come la biolistica, la trasformazione basata su A. tumefaciens di tessuti, cellule e colture di organi, il sistema di espressione HR presenta diversi vantaggi. In primo luogo, le HR sono geneticamente stabili e prodotte rapidamente su terreni privi di ormoni 1,9,10. Inoltre, le HR possono produrre metaboliti specializzati in quantità equivalenti o superiori alle radici native11,12. Questi vantaggi rendono le HR uno strumento biotecnologico desiderabile per le specie vegetali che sono incompatibili con A. tumefaciens o che richiedono particolari condizioni di coltura tissutale per formare tessuti compatibili. Il metodo HR è un approccio efficiente per analizzare le interazioni proteina-proteina, la localizzazione subcellulare delle proteine, la produzione di proteine ricombinanti, la fitorimediazione, la mutagenesi e gli effetti dell'intero genoma utilizzando il sequenziamento dell'RNA13,14,15. Può anche essere usato per studiare la produzione di metaboliti specializzati che hanno valore nel settore, tra cui le gliceolline, che medicano la difesa della soia contro l'importante patogeno microbico Phytophthora sojae e hanno impressionanti attività antitumorali e neuroprotettive negli esseri umani16,17.
Questo rapporto dimostra un protocollo semplice ed efficiente per produrre HR di soia. Rispetto ai precedenti metodi di trasformazione HR, questo protocollo fornisce un miglioramento significativo (33% -50%) nel tasso di formazione di HR prescreening dei trasformanti A. rhizogenes per la presenza del plasmide Ti prima di inoculare i cotiledoni di soia. Dimostriamo l'applicabilità di questo protocollo trasformando diversi vettori binari che sovraesprimono o silenziano i geni del fattore di trascrizione della soia.
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Protocol
NOTA: Si raccomanda che tutte le fasi del procedimento siano condotte in condizioni sterili.
1. Sterilizzazione dei semi di soia
- In un armadio di biosicurezza, posizionare 16-20 semi di soia Williams 82 rotondi in ottime condizioni (cioè senza crepe o imperfezioni) in una provetta da centrifuga da 50 ml.
- Aggiungere 30 ml di alcool isopropilico al 70%, agitare delicatamente per 30 s, quindi decantare l'alcol.
- Agitare delicatamente i semi con 30 ml di candeggina al 10% per 10 s e lasciare riposare i semi nella soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente (RT, 25 °C). Dopo 5 minuti, scolare la candeggina.
- Ripetere l'agitazione tre volte con 30 ml di H 2 O ultrapuro sterile per1 minuto per risciacquo ed eliminare l'H2O tra ogni risciacquo.
- Posizionare i semi sterilizzati su carta da filtro satura di 5 ml di terreno di germinazione e co-coltivazione (GC) (mezzo di autoclave semi-forza liquido Murashige e Skoog [MS] con 1% di saccarosio [pH = 5,8] e quindi aggiungere 2,5 ml / L di vitamine) in piastre di Petri sterili.
- Porre le piastre al buio a RT (25 °C) per 3 giorni prima di trasferire le piastre a 22 °C sotto 16 h luci fluorescenti T5 bianco freddo (100 μE m-2·s-1) per 4 giorni per consentire ai semi di germinare.
NOTA: Scartare i semi rugosi o incrinati. I semi migliori sono quelli che sono grandi e uniformemente gialli. Sterilizzare almeno il doppio del numero di semi necessari per l'esperimento per selezionare semi di buona qualità, poiché alcuni semi potrebbero non essere ottimali a causa di danni, malattie o mancata germinazione.
2. Infezione di cotiledoni con K599
NOTA: Utilizzare vettori della serie pGWB, poiché la loro doppia selezione garantisce l'integrazione genomica dell'intera cassetta T-DNA. L'elettroporazione è stata utilizzata per trasformare un vettore binario che ospita il gene di interesse in A. rhizogenes pRi265918.
- Sulla base della sequenza del plasmide 18 di A. rhizogenes pRi2659, progettare primer per rilevare il gene plasmidico Ti VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 inverso: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Dimensione di amplificazione prevista: 221 bp). Dopo la trasformazione, testare le colonie di Agrobacterium per la ritenzione di VirD2 mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando un kit PCR (vedere Tabella dei materiali). Ciclo PCR: 94 °C per 3 min; 35 cicli (94 °C per 1 min, 58 °C per 30 sec, 72 °C per 1 min); e 72 °C per 10 min.
- Dopo aver selezionato la colonia di A. rhizogenes che contiene sia VirD2 che il gene di interesse (GOI), striarne alcune su piastre medie Luria-Bertani (LB) contenenti gli antibiotici appropriati (50 mg/L) per il plasmide di interesse e incubare per una notte a 30 °C. Se si utilizza la spectinomicina, aggiungere una concentrazione di 100 mg / L.
- Utilizzare una punta di pipetta P200 per raschiare via una lunghezza di ~ 1,5 cm di K599 Agrobacterium dalle piastre LB e risospendere le cellule in 1 mL di tampone fosfato (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
- Diluire l'Agrobacterium in H2O (v/v = 1:1) e acetosiringone sterilizzato ultrapuro (AS; 100 mM di stock in dimetilsolfossido, v/v = 1:1000). Misurare l'assorbanza utilizzando un tubo cuvette a una densità ottica di 600 nm (OD600). L'intervallo ottimale previsto è compreso tra 0,5 e 0,8.
- In un armadio di biosicurezza, immergere un bisturi sterilizzato nella soluzione K599 Agrobacterium ed eseguire diversi tagli profondi di 1 mm lungo la superficie interna (lato adasassiale, piatto) del cotiledone. Durante l'inoculazione, utilizzare una pinza sterilizzata per stabilizzare il cotiledone.
- Posizionare circa 6-8 cotiledoni tagliati con il lato rivolto verso il basso su una piastra di Petri contenente carta da filtro satura di mezzo GC con AS.
NOTA: Per preparare 6 piastre, sono sufficienti 50 ml di terreno GC e 50 μL di 100 mM AS per ottenere una concentrazione finale di 100 μM. - Incubare le lastre a RT (25 °C) per 3 giorni sotto un fotoperiodo di 16 ore (~65 μE).
- Trasferire i cotiledoni infetti su piastre di crescita delle radici pelose (HRG) (MS autoclave a mezza forza con saccarosio al 3% [pH = 5,8] e 2,6 g / L di Gelzan, quindi aggiungere 2,5 ml / L di miscela di vitamine e 500 mg / L di timentina).
NOTA: Ci sono stati alcuni problemi con timentin da alcuni fornitori alternativi, di cui il K599 non è stato eliminato. Si consiglia di utilizzare piastre di Petri più alte (100 mm x 25 mm) per il mezzo HRG. - Incubare le piastre HRG a 22 °C in una camera di crescita con i parametri impostati su 100 μE di luce su un fotoperiodo di 16 ore fino a quando non si osservano radici primarie con radici secondarie lunghe 2-3 cm (~3-4 settimane).
3. Selezione e raccolta delle risorse umane
- Raccogliere radici primarie (5-7 cm di lunghezza) che crescono dal callo e contengono radici secondarie (2-3 cm di lunghezza) usando un bisturi sterile e una pinza. Trasferire alla selezione piastre HRG contenenti gli antibiotici appropriati. Lascia crescere le HR per altri 5 giorni sulle piastre HRG di selezione.
NOTA: Kanamicina (50 mg / L), igromicina (50 mg / L), o fosfinotricina (10 mg / L) sono tipicamente utilizzati per la selezione. Per i vettori di espressione, pGWB2 è usato per la sovraespressione, pANDA35HK è usato per il silenziamento dell'RNAi, pGWB6 è usato per la localizzazione subcellulare e pMDC7 è usato per l'espressione inducibile. - Il giorno 5, raccogliere HR transgenici con radici secondarie lunghe 3-6 cm. Se si osservano le proteine fluorescenti, le radici secondarie hanno poca autofluorescenza. Se si eseguono trattamenti elicitori o chimici, tagliare le radici secondarie in pezzi di 1 cm e posizionare ~ 100 mg su agar HRG in una pila. Quindi, saturare le pile con 80 μL del trattamento appropriato e lasciare che le piastre incubano a RT (25 °C).
- Dopo il tempo di trattamento desiderato, procedere con estrazioni di RNA o metaboliti.
- Per l'RNA, tamponare rapidamente le radici secche su un tovagliolo di carta sterilizzato e raccoglierle direttamente in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
- Sigillare immediatamente la parte superiore del tubo usando il parafilm, praticare due piccoli fori con una pinza appuntita e immergere i tubi in azoto liquido. Liofilizzare per 3 giorni, quindi conservare i campioni a -80 °C.
NOTA: è essenziale selezionare HR bianchi. Dopo 5 giorni di crescita sulla piastra selettiva, le HR transgeniche rimarranno bianche, ma le radici non transgeniche diventeranno marroni.
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Representative Results
I risultati rappresentativi sono tratti dai dati pubblicati19,20. I risultati della PCR di colonia (cPCR) dell'agrobatterio K599 trasformato sono mostrati nella Figura 1. Come indicato dalle colonie positive nella Figura 1, il gene di interesse è stato rilevato mediante cPCR (Figura 1A). Tuttavia, da un terzo alla metà delle colonie erano negative per lo screening del gene VirD2 (Figura 1B), indicando la perdita del plasmide Ti, e sarebbero incapaci di generare callo o radici pelose. La figura 2 illustra la procedura complessiva di preparazione delle HR della soia e l'analisi dell'espressione genica. La Figura 3 illustra la localizzazione subcellulare di GFP-GmJAZ1-6. La Figura 4 è un'analisi dell'espressione genica che mostra la sovraespressione del fattore di trascrizione della gliceollina GmHSF6-1 e il silenziamento dell'RNAi di GmMYB29A2 nelle radici pelose di Williams 82. Risultati simili sono stati ottenuti in diversi rapporti recenti20,21.
Figura 1: Colony PCR (cPCR) dell'agrobatterio K599 utilizzando primer per colony PCR del gene di interesse o VirD2. (A) Gene di interesse cPCR. (B) VirD2 cPCR. Abbreviazioni: C = colonia; +ve = controllo positivo; -ve = controllo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Panoramica della coltura della radice pelosa di soia (HR) e della procedura di analisi della funzione genica. I calli si sono formati sul sito di ferita 2 settimane dopo l'infezione da K599 Agrobacterium . La differenziazione cellulare si è verificata dopo 1 settimana, quindi è trascorsa 1 settimana per l'allungamento HR. Questo è stato seguito dalla raccolta HR e dal trattamento Wall glucan elicitor (WGE) / mock per 24 ore. Le HR sono state sottoposte rispettivamente all'estrazione dei metaboliti per l'analisi della cromatografia liquida ad ultra prestazioni (UPLC) e all'isolamento dell'RNA per l'analisi dell'espressione genica. WGE è l'elicitore di glucano murale di Phytophthora sojae. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Microscopia a fluorescenza di GmJAZ1-6 traslazionalmente fuso in una proteina fluorescente verde (GFP) nelle radici pelose transgeniche di Williams 82. (A) Canale verde (GFP). (B) Canale blu (DAPI). (C) Canali verdi e blu uniti. Tutte le immagini sono state raccolte utilizzando un microscopio confocale Zeiss. Le immagini DAPI (6 μg/mL) indicano la colorazione nucleare. Le barre della scala sono 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi dell'espressione genica. (A) Espressione genica nella sovraespressione di GmHSF6-119 Williams 82 HR di soia sotto trattamento simulato di 24 ore o indotta per 24 ore con WGE. (B) Espressione genica in RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 HRs di soia suscitati per 24 ore con WGE. WGE è l'elicitore di glucano murale di Phytophthora sojae. unSignificativamente maggiore e bsignificativamente inferiore al controllo, gli studenti accoppiati t-test (p < 0,01). Le barre di errore rappresentano SE (n ≥ 3 repliche biologiche). Le radici secondarie raccolte da una radice primaria indicavano una replica biologica. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Lin et al.19 e Jahan et al.20. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Negli ultimi dieci anni, il metodo HR della soia è stato sviluppato come un potente strumento per studiare i geni coinvolti nella fissazione dell'azoto 22,23, la tolleranza allo stress biotico e abiotico 24,25 e le vie biosintetiche dei metaboliti 26,27. La conoscenza di come le piante producono metaboliti ha una pletora di benefici per la produzione agricola e l'industria farmaceutica, in quanto può essere utilizzata per studiare le reti geniche coinvolte nella mediazione delle difese biochimiche contro i patogeni28.
Per dare priorità alla produttività e all'efficienza dei costi, questo protocollo semplifica la procedura. Ad esempio, invece di utilizzare terreni solidi più costosi contenenti un agente gelificante, i semi di soia vengono germinati in condizioni sterili utilizzando asciugamani di carta di livello industriale saturi di terreno di crescita liquido. Le tecniche di laboratorio asettico e il mantenimento di condizioni di lavoro sterili sono essenziali per gli esperimenti di trasformazione HR, poiché una vasta gamma di microrganismi, come funghi e lieviti, può causare la contaminazione delle colture in vitro .
Inoltre, l'utilizzo dell'intensità appropriata della luce e del fotoperiodo è fondamentale per la cultura delle risorse umane. Il processo di crescita e sviluppo delle piante in colture in vitro è significativamente influenzato dalla qualità dell'intensità luminosa e del fotoperiodo, come osservato in vari studi precedenti. Se l'intensità luminosa è troppo bassa o troppo alta, può rallentare il processo di induzione delle radici. Allo stesso modo, se il fotoperiodo è inappropriato, può portare al fallimento della formazione del callo e allo sviluppo differenziato delle cellule29. Inoltre, sulla base dei nostri esperimenti passati, le HR non transgeniche sono resistenti alla kanamicina (50 mg / L) se usate come unico antibiotico. Per questo motivo, in genere utilizziamo vettori che codificano la doppia resistenza per igromicina e kanamicina. Sotto questa rigorosa selezione, siamo in grado di ottenere un tasso di HR transgenico positivo del 15% -30% delle radici totali, ma ~ 80% di quelle HR hanno significativamente sovraespresso / silenziato i geni codificati dai vettori.
Per garantire il successo degli esperimenti di trasformazione HR, è fondamentale verificare se il ceppo di A. rhizogenes utilizzato nell'esperimento conserva il plasmide Ti che codifica i geni di virulenza. La presenza del plasmide Ti è necessaria per il successo dell'integrazione del T-DNA nel genoma vegetale4. L'uso della cPCR per rilevare il plasmide Ti è diventato un passo essenziale in questo protocollo. In passato, abbiamo scoperto che il 33%-50% delle nostre trasformazioni non riusciva a produrre calli e radici. Inconsapevolmente, ciò era dovuto alla perdita del plasmide Ti durante la trasformazione o la successiva coltura di A. rhizogenes. Ora, mediante l'analisi PCR delle colonie di Agrobacterium dopo la loro trasformazione, ci assicuriamo che il plasmide Ti sia presente e che il 100% degli esperimenti di trasformazione produca radici. L'uso della cPCR in questo protocollo ha dimostrato di essere una preziosa aggiunta alla procedura standard di trasformazione HR. Ha ridotto il numero di esperimenti falliti, risparmiando così tempo e risorse. La fase cPCR ci ha anche permesso di confermare che il processo di trasformazione funziona come previsto, assicurando che i risultati degli esperimenti siano affidabili e riproducibili.
Tuttavia, questo metodo semplificato presenta alcune limitazioni. Ad esempio, questo protocollo può rispondere a domande biologiche cellulari di base sulle funzioni geniche nelle HR transgeniche. Tuttavia, le domande relative ad altri tessuti vegetali, come germogli e foglie, potrebbero non essere verificabili nelle HR. È sempre importante confermare che il processo studiato non è influenzato dai livelli di ormone ectopico o da altri fattori introdotti da A. rhizogenes. I ricercatori dovrebbero prendere nota dei suoi limiti e progettare attentamente gli esperimenti per garantire risultati accurati e significativi.
In sintesi, il protocollo qui dimostrato è un metodo altamente efficiente per studiare la funzione genica nelle radici di soia. Abbiamo recentemente dimostrato il suo valore nello studio di approcci di ingegneria multigenica e nella comprensione delle reti geniche coinvolte nella regolazione delle difese biochimiche della soia19. La relativa efficienza dell'approccio lo rende ideale per rispondere a domande complesse in biologia vegetale che richiedono l'indagine di numerosi geni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal numero di sovvenzione RGPIN-2020-06111 del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) e da una generosa donazione di Brad Lace. Vorremmo ringraziare Wayne Parrott (Università della Georgia) per il K599 Agrobacterium e il protocollo preliminare, e il laboratorio Nakagawa & Hachiya (Università di Shimane) per i vettori vuoti pGWB2, pGWB6 e pANDA35HK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
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