Summary
Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.
Abstract
A soja (Glycine max) é uma cultura valiosa na agricultura que tem milhares de usos industriais. As raízes de soja são o principal sítio de interação com micróbios de solo que formam simbiose para fixar nitrogênio e patógenos, o que torna as pesquisas envolvendo genética de raízes de soja de importância primordial para melhorar sua produção agrícola. A transformação genética de raízes pilosas (HRs) de soja é mediada pela linhagem Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) e é uma ferramenta eficiente para estudar a função gênica em raízes de soja, levando apenas 2 meses do início ao fim. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado que descreve o método para superexpressar e silenciar um gene de interesse em HRs de soja. Essa metodologia inclui a esterilização de sementes de soja, a infecção de cotilédones com K599 e a seleção e colheita de HRs geneticamente transformados para isolamento de RNA e, se necessário, análises de metabólitos. O rendimento da abordagem é suficiente para estudar simultaneamente vários genes ou redes e pode determinar as estratégias de engenharia ótimas antes de se comprometer com abordagens de transformação estável de longo prazo.
Introduction
A soja (Glycine max) está entre as culturas mais valiosas na agricultura. Possui milhares de usos comerciais e industriais, como alimentos, ração animal, óleo e como fonte de matéria-prima para a fabricação1. Sua capacidade de formar uma relação simbiótica com microrganismos fixadores de nitrogênio do solo, nomeadamente rizóbios, eleva ainda mais a importância do estudo da genética dasoja2. Por exemplo, o ajuste fino das propriedades de fixação de nitrogênio em raízes de soja pode levar à redução das emissões de carbono e reduzir significativamente as necessidades de fertilizantes nitrogenados3. Assim, o entendimento da genética que controla aspectos da biologia radicular da soja, em particular, tem amplas aplicações na agricultura e na indústria. Considerando esses benefícios, é importante ter um protocolo confiável para analisar a função dos genes da soja.
Agrobacterium tumefaciens é talvez a ferramenta mais comumente usada para transformação genética de plantas, pois tem a capacidade de integrar DNA DE TRANSFERÊNCIA (T-DNA) no genoma nuclear de muitas espécies vegetais. Quando a Agrobacterium infecta uma planta, ela transfere o plasmídeo indutor de tumor (Ti) para o cromossomo hospedeiro, levando à formação de um tumor no local da infecção. A transformação mediada por Agrobacterium tem sido amplamente utilizada há décadas para análise funcional de genes e modificação de características de culturas4. Embora qualquer gene de interesse possa ser prontamente transferido para células hospedeiras através da transformação mediada por A. tumefaciens, este método tem várias desvantagens; É demorado, caro e requer ampla experiência para muitas espécies de plantas, como a soja. Embora algumas variedades de soja possam ser transformadas pela abordagem do nó cotiledonar utilizando A. tumefaciens, a ineficiência dessa abordagem requer a necessidade de uma tecnologia alternativa de transformação genética que seja rápida e altamente eficiente 4,5. Mesmo um não especialista pode usar este método de transformação de raiz pilosa (HR) mediada por Agrobacterium rhizogenes para superar essas desvantagens.
A transformação da RH é uma ferramenta relativamente rápida, não só para analisar a função gênica, mas também para aplicações biotecnológicas, como a produção de metabólitos especializados e química fina, e glicoproteínas bioativascomplexas6. A produção de HRs de soja não requer grande especialização, pois podem ser geradas pela lesão das superfícies dos cotilédones, seguida da inoculação com Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes expressa genes de virulência (Vir) codificados por seu plasmídeo Ti que transferem, carregam e integram seu segmento de T-DNA no genoma de células vegetais e, ao mesmo tempo, estimulam o crescimento ectópico de raízes8.
Comparado a outros sistemas de expressão gênica de soja, como biolistics ou transformação baseada em A. tumefaciens de cultura de tecidos, células e órgãos, o sistema de expressão de HR apresenta várias vantagens. Em primeiro lugar, as HRs são geneticamente estáveis e produzidas rapidamente em meios livres de hormônios 1,9,10. Além disso, as HRs podem produzir metabólitos especializados em quantidades equivalentes ou superiores às raízes nativas11,12. Essas vantagens fazem dos HRs uma ferramenta biotecnológica desejável para espécies vegetais incompatíveis com A. tumefaciens ou que necessitam de condições especiais de cultura de tecidos para formar tecidos compatíveis. O método HR é uma abordagem eficiente para analisar interações proteína-proteína, localização subcelular de proteínas, produção de proteínas recombinantes, fitorremediação, mutagênese e efeitos genômicos amplos usando o sequenciamento de RNA13,14,15. Também pode ser utilizado para estudar a produção de metabólitos especializados que têm valor na indústria, incluindo as gliceolinas, que medicam a defesa da soja contra o importante patógeno microbiano Phytophthora sojae e têm impressionantes atividades anticâncer e neuroprotetoras em humanos16,17.
Este relato demonstra um protocolo fácil e eficiente para produzir HRs de soja. Em comparação com métodos anteriores de transformação da HR, este protocolo proporciona uma melhora significativa (33%-50%) na taxa de formação de FC por pré-triagem de transformadores de A. rhizogenes para a presença do plasmídeo Ti antes da inoculação de cotilédones de soja. Nós demonstramos a aplicabilidade deste protocolo através da transformação de vários vetores binários que superexpressam ou silenciam genes de fatores de transcrição de soja.
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Protocol
NOTA: Recomenda-se que todas as etapas do processo sejam conduzidas em condições estéreis.
1. Esterilização de sementes de soja
- Em um gabinete de biossegurança, coloque 16-20 sementes redondas de soja Williams 82 em estado puro (ou seja, sem rachaduras ou manchas) em um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Adicione 30 mL de álcool isopropílico a 70%, agite suavemente por 30 s e, em seguida, decante o álcool.
- Agitar suavemente as sementes com 30 mL de água sanitária a 10% por 10 s e deixar as sementes permanecerem na solução por 5 min à temperatura ambiente (TR, 25 °C). Após 5 min, escorra a água sanitária.
- Repita o agitar três vezes com 30 mL de H 2 O ultrapuro estéril por1 min por enxágue e descarte o H2O entre cada enxágue.
- Colocar as sementes esterilizadas em papel filtro saturado com 5 mL de germinação e meio de co-cultivo (GC) (líquido de meia resistência em autoclave Murashige e meio Skoog [MS] com 1% de sacarose [pH = 5,8] e, em seguida, adicionar 2,5 mL/L de vitaminas) em placas de Petri estéreis.
- Colocar as placas no escuro a RT (25 °C) durante 3 dias antes de transferir as placas a 22 °C sob 16 h de luzes fluorescentes T5 branco-frias (100 μE m-2·s-1) durante 4 dias para permitir que as sementes germinem.
OBS: Descarte as sementes que estão enrugadas ou rachadas. As melhores sementes são aquelas grandes e uniformemente amarelas. Esterilizar pelo menos o dobro do número de sementes necessárias para o experimento para selecionar sementes de boa qualidade, pois algumas sementes podem não ser ideais devido a danos, doenças ou falha na germinação.
2. Infecção de cotilédones com K599
NOTA: Use vetores da série pGWB, pois sua seleção dupla garante a integração genômica de todo o de T-DNA. A eletroporação foi utilizada para transformar um vetor binário que abriga o gene de interesse em A. rhizogenes pRi265918.
- Com base na sequência do plasmídeo18 de A. rhizogenes pRi2659, projetamos primers para detectar o gene do plasmídeo Ti VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 reverso: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Tamanho esperado da amplificação: 221 pb). Após a transformação, teste as colônias de Agrobacterium para a retenção de VirD2 por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando um Kit de PCR (ver Tabela de Materiais). Ciclo de PCR: 94 °C por 3 min; 35 ciclos (94 °C por 1 min, 58 °C por 30 seg, 72 °C por 1 min); e 72 °C por 10 min.
- Após a seleção da colônia de A. rhizogenes que contém tanto VirD2 quanto o gene de interesse (GOI), coloque algumas em placas de meio Luria-Bertani (LB) contendo os antibióticos apropriados (50 mg/L) para o plasmídeo de interesse e incube durante a noite a 30 °C. Se utilizar espectinomicina, adicionar uma concentração de 100 mg/L.
- Use uma ponta de pipeta P200 para raspar um comprimento de ~1,5 cm da Agrobactéria K599 das placas LB e ressuspender as células em 1 mL de tampão fosfato (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
- Diluir o Agrobacterium em esterilizados, ultrapuros H2O (v/v = 1:1) e acetoseringona (AS; estoque de 100 mM em dimetilsulfóxido [DMSO], v/v = 1:1000). Medir a absorbância utilizando um tubo de cubeta a uma densidade óptica de 600 nm (OD600). A faixa ótima esperada está entre 0,5 e 0,8.
- Em um gabinete de biossegurança, mergulhe um bisturi esterilizado na solução K599 Agrobacterium e faça vários cortes de 1 mm de profundidade ao longo da superfície interna (lado adaxial, plano) do cotilédone. Durante a inoculação, utilizar pinça esterilizada para estabilizar o cotilédone.
- Coloque cerca de 6-8 cotilédones cortados lateralmente em uma placa de Petri contendo papel de filtro saturado com meio GC com AS.
NOTA: Para preparar 6 placas, 50 mL de meio GC e 50 μL de 100 mM AS para atingir uma concentração final de 100 μM é suficiente. - Incubar as placas em TR (25 °C) durante 3 dias sob fotoperíodo de 16 h (~65 μE).
- Transferir os cotilédones infectados para placas de crescimento radicular piloso (HRG) (autoclave de meia força MS com 3% de sacarose [pH = 5,8] e 2,6 g/L de Gelzan, em seguida adicionar 2,5 mL/L de mistura de vitaminas e 500 mg/L de timentin).
NOTA: Houve alguns problemas com timentin de alguns fornecedores alternativos, dos quais o K599 não foi eliminado. Recomenda-se o uso de placas de placa de Petri mais altas (100 mm x 25 mm) para o meio HRG. - Incubar as placas de HRG a 22 °C em uma câmara de crescimento com os parâmetros ajustados para 100 μE de luz em um fotoperíodo de 16 h até que raízes primárias com raízes secundárias de 2-3 cm de comprimento sejam observadas (~3-4 semanas).
3. Seleção e colheita de RHs
- Colher raízes primárias (5-7 cm de comprimento) que crescem a partir do calo e contêm raízes secundárias (2-3 cm de comprimento) usando um bisturi estéril e pinças. Transfira para a seleção placas HRG contendo os antibióticos apropriados. Deixe os HRs crescerem por mais 5 dias nas placas HRG de seleção.
NOTA: Kanamicina (50 mg/L), higromicina (50 mg/L) ou fosfinotricina (10 mg/L) são normalmente usados para seleção. Para vetores de expressão, pGWB2 é usado para superexpressão, pANDA35HK é usado para silenciamento de RNAi, pGWB6 é usado para localização subcelular e pMDC7 é usado para expressão induzível. - No dia 5, colher HRs transgênicas com raízes secundárias de 3 a 6 cm de comprimento. Se observarmos proteínas fluorescentes, as raízes secundárias têm pouca autofluorescência. Se estiver realizando elicitor ou tratamentos químicos, corte as raízes secundárias em pedaços de 1 cm e coloque ~100 mg em ágar HRG em uma pilha. Em seguida, saturar as estacas com 80 μL do tratamento adequado e deixar as placas incubarem em TR (25 °C).
- Após o tempo de tratamento desejado, prossiga com extrações de RNA ou metabólito.
- Para o RNA, seque rapidamente as raízes em um papel toalha esterilizado e colete-as diretamente em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
- Sele imediatamente a parte superior do tubo usando parafilme, faça dois pequenos furos usando pinças pontiagudas e submerja os tubos em nitrogênio líquido. Liofilizar durante 3 dias e, em seguida, armazenar as amostras a -80 °C.
NOTA: É essencial selecionar HRs que são brancos. Após 5 dias de crescimento na placa seletiva, as HRs transgênicas permanecerão brancas, mas as raízes não transgênicas ficarão marrons.
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Representative Results
Os resultados representativos são provenientes dos dados publicados19,20. Os resultados da PCR de colônia (cPCR) da K599 transformada Agrobacterium são mostrados na Figura 1. Como indicado pelas colônias positivas na Figura 1, o gene de interesse foi detectado por PCRc (Figura 1A). No entanto, um terço a metade das colônias foram negativas para a pesquisa do gene VirD2 (Figura 1B), indicando a perda do plasmídeo Ti, e seriam incapazes de gerar calos ou raízes pilosas. A Figura 2 ilustra o procedimento global de preparo das HRs de soja e a análise da expressão gênica. A Figura 3 demonstra a localização subcelular da GFP-GmJAZ1-6. A Figura 4 é uma análise da expressão gênica mostrando superexpressão do fator de transcrição GmHSF6-1 da gliceolina e silenciamento de RNAi de GmMYB29A2 em raízes pilosas Williams 82. Resultados semelhantes foram obtidos em vários relatos recentes20,21.
Figura 1: PCR de colônia (cPCR) da Agrobactéria K599 utilizando iniciadores de PCR de colônia do gene de interesse ou VirD2. (A) Gene de interesse cPCR. (B) PCRc VirD2 . Abreviações: C = colônia; +ve = controle positivo; -ve = controle negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral do procedimento de cultura da raiz pilosa (HR) da soja e da função gênica. Calos formados no local da ferida 2 semanas após a infecção por K599 Agrobacterium . A diferenciação celular ocorreu após 1 semana, depois decorreu 1 semana para alongamento da FC. Seguiu-se a coleta da FC e o elicitor glucano de parede (WGE)/tratamento simulado por 24 h. Os HRs foram submetidos à extração de metabólitos para análise por cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) e isolamento de RNA para análise de expressão gênica, respectivamente. WGE é o eliciador glucano de parede de Phytophthora sojae. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microscopia de fluorescência de GmJAZ1-6 translacionalmente fundido a uma proteína verde fluorescente (GFP) em raízes pilosas transgênicas Williams 82. (A) Canal verde (GFP). (B) Canal azul (DAPI). (C) Canais verdes e azuis mesclados. Todas as imagens foram coletadas em microscópio confocal Zeiss. Imagens DAPI (6 μg/mL) indicam coloração nuclear. As barras de escala são de 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise da expressão gênica. (A) Expressão gênica na superexpressão de GmHSF6-119 Williams 82 HRs de soja sob tratamento simulado de 24 h ou eliciado por 24 h com WGE. (B) Expressão gênica em RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 HRs de soja eliciados por 24 h com WGE. WGE é o eliciador glucano de parede de Phytophthora sojae. umSignificativamente maior e bsignificativamente menor que o controle, teste t de estudantes pareados (p < 0,01). As barras de erro representam SE (n ≥ 3 réplicas biológicas). Raízes secundárias coletadas de uma raiz primária indicaram uma réplica biológica. Esse valor foi modificado com permissão de Lin et al.19 e Jahan et al.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Durante a última década, o método HR da soja tem sido desenvolvido como uma poderosa ferramenta para estudar genes envolvidos na fixação de nitrogênio 22,23, tolerância ao estresse biótico e abiótico 24,25 e vias biossintéticas de metabólitos 26,27. O conhecimento de como as plantas produzem metabólitos traz uma infinidade de benefícios para a produção agrícola e para a indústria farmacêutica, pois pode ser utilizado para estudar redes gênicas envolvidas na mediação de defesas bioquímicas contra patógenos28.
Para priorizar a produtividade e a eficiência de custos, esse protocolo simplifica o procedimento. Por exemplo, em vez de usar meios sólidos mais caros contendo um agente gelificante, as sementes de soja são germinadas em condições estéreis usando toalhas de papel de grau industrial saturadas com meio de crescimento líquido. Técnicas laboratoriais assépticas e a manutenção de condições de trabalho estéreis são essenciais para experimentos de transformação de RH, uma vez que uma ampla gama de microrganismos, como fungos e leveduras, pode causar contaminação de culturas in vitro .
Além disso, o uso da intensidade adequada de luz e fotoperíodo é crucial para a cultura da FC. O processo de crescimento e desenvolvimento das plantas em culturas in vitro é significativamente afetado pela qualidade da intensidade luminosa e fotoperíodo, como observado em vários estudos anteriores. Se a intensidade da luz for muito baixa ou muito alta, pode retardar o processo de indução da raiz. Da mesma forma, se o fotoperíodo for inadequado, pode levar à falha na formação de calos e no desenvolvimento celulardiferenciado29. Além disso, com base em nossos experimentos anteriores, HRs não transgênicos são resistentes à canamicina (50 mg/L) quando usados como antibiótico único. Por esta razão, normalmente usamos vetores que codificam dupla resistência para higromicina e canamicina. Sob esta seleção rigorosa, somos capazes de obter uma taxa de HR transgênica positiva de 15%-30% do total de raízes, mas ~80% desses HRs têm genes significativamente superexpressos/silenciados como codificados pelos vetores.
Para garantir o sucesso dos experimentos de transformação de RH, é crucial testar se a cepa de A. rhizogenes usada no experimento retém o plasmídeo Ti que codifica genes de virulência. A presença do plasmídeo Ti é necessária para o sucesso da integração do DNA-T no genoma vegetal4. O uso da PCRc para detecção do plasmídeo Ti tornou-se uma etapa essencial neste protocolo. No passado, descobrimos que 33%-50% de nossas transformações deixavam de produzir calos e raízes. Sem saber, isso ocorreu devido à perda do plasmídeo Ti durante a transformação ou posterior cultivo de A. rhizogenes. Agora, pela análise por PCR das colônias de Agrobacterium após sua transformação, garantimos que o plasmídeo de Ti está presente e que 100% dos experimentos de transformação produzem raízes. O uso de PCRc neste protocolo provou ser uma adição valiosa ao procedimento padrão de transformação da FC. Reduziu o número de experiências falhadas, poupando tempo e recursos. A etapa de PCRc também nos permitiu confirmar que o processo de transformação funciona como pretendido, garantindo que os resultados dos experimentos sejam confiáveis e reprodutíveis.
No entanto, esse método simplificado apresenta algumas limitações. Por exemplo, este protocolo pode responder a questões básicas de biologia celular sobre funções gênicas em HRs transgênicos. No entanto, questões relativas a outros tecidos vegetais, como brotos e folhas, podem não ser testáveis em HRs. É sempre importante confirmar que o processo em estudo não é afetado pelos níveis hormonais ectópicos ou outros fatores introduzidos por A. rhizogenes. Os pesquisadores devem tomar nota de suas limitações e planejar cuidadosamente os experimentos para garantir resultados precisos e significativos.
Em resumo, o protocolo aqui demonstrado é um método altamente eficiente para investigar a função gênica em raízes de soja. Recentemente, demonstramos seu valor no estudo de abordagens de engenharia multigênica e no entendimento de redes gênicas envolvidas na regulação das defesas bioquímicas da soja19. A relativa eficiência da abordagem a torna ideal para responder a questões complexas em biologia vegetal que requerem a investigação de numerosos genes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) número de concessão RGPIN-2020-06111 e por uma generosa doação de Brad Lace. Gostaríamos de agradecer a Wayne Parrott (University of Georgia) pela K599 Agrobacterium e pelo protocolo preliminar, e ao Nakagawa & Hachiya lab (Shimane University) pelos vetores vazios pGWB2, pGWB6 e pANDA35HK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
References
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