Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.
Abstract
La soja (Glycine max) es un cultivo valioso en la agricultura que tiene miles de usos industriales. Las raíces de soja son el sitio principal de interacción con los microbios transmitidos por el suelo que forman simbiosis para fijar nitrógeno y patógenos, lo que hace que la investigación que involucra la genética de la raíz de soja sea de suma importancia para mejorar su producción agrícola. La transformación genética de las raíces peludas de soja (HRs) está mediada por la cepa NCPPB2659 de Agrobacterium rhizogenes (K599) y es una herramienta eficiente para estudiar la función génica en las raíces de soja, tomando solo 2 meses de principio a fin. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado que describe el método para sobreexpresar y silenciar un gen de interés en las HR de soja. Esta metodología incluye la esterilización de semillas de soja, la infección de cotiledones con K599 y la selección y recolección de HR genéticamente transformadas para el aislamiento de ARN y, si se justifica, análisis de metabolitos. El rendimiento del enfoque es suficiente para estudiar simultáneamente varios genes o redes y podría determinar las estrategias de ingeniería óptimas antes de comprometerse con enfoques de transformación estables a largo plazo.
Introduction
La soja (Glycine max) es uno de los cultivos más valiosos en la agricultura. Tiene miles de usos comerciales e industriales, como alimentos, piensos, aceite y como fuente de materias primas para la fabricación1. Su capacidad para formar una relación simbiótica con los microorganismos del suelo fijadores de nitrógeno, a saber, los rizobios, eleva aún más la importancia de estudiar la genética de la soja2. Por ejemplo, ajustar las propiedades de fijación de nitrógeno en las raíces de soja puede conducir a la reducción de las emisiones de carbono y reducir en gran medida los requisitos de fertilizante nitrogenado3. Por lo tanto, comprender la genética que controla aspectos de la biología de la raíz de la soja, en particular, tiene amplias aplicaciones en la agricultura y la industria. Teniendo en cuenta estos beneficios, es importante contar con un protocolo confiable para analizar la función de los genes de la soja.
Agrobacterium tumefaciens es quizás la herramienta más utilizada para la transformación genética de plantas, ya que tiene la capacidad de integrar el ADN de transferencia (ADN-T) en el genoma nuclear de muchas especies de plantas. Cuando Agrobacterium infecta una planta, transfiere el plásmido inductor de tumores (Ti) al cromosoma huésped, lo que lleva a la formación de un tumor en el sitio de la infección. La transformación mediada por Agrobacterium ha sido ampliamente utilizada durante décadas para el análisis funcional de genes y para modificar los rasgos de los cultivos4. Aunque cualquier gen de interés puede transferirse fácilmente a las células vegetales huésped a través de la transformación mediada por A. tumefaciens, este método tiene varios inconvenientes; Requiere mucho tiempo, es costoso y requiere una amplia experiencia para muchas especies de plantas, como la soja. Aunque algunas variedades de soja pueden ser transformadas por el enfoque de nodo cotiledonario utilizando A. tumefaciens, la ineficiencia de este enfoque requiere la necesidad de una tecnología alternativa de transformación genética que sea rápida y altamente eficiente 4,5. Incluso un no experto puede usar este método de transformación de raíz pilosa (HR) mediado por Agrobacterium rhizogenes para superar estas desventajas.
La transformación de HR es una herramienta relativamente rápida, no solo para analizar la función de los genes, sino también para aplicaciones biotecnológicas, como la producción de metabolitos especializados y productos químicos finos, y glicoproteínas bioactivas complejas6. La producción de HRs de soja no requiere una amplia experiencia, ya que pueden generarse hiriendo las superficies de los cotiledones, seguido de la inoculación con Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes expresa genes de virulencia (Vir) codificados por su plásmido Ti que transfieren, transportan e integran su segmento de ADN-T en el genoma de las células vegetales mientras estimulan simultáneamente el crecimiento de raíces ectópicas8.
En comparación con otros sistemas de expresión génica de soja, como los biolistics o la transformación de tejidos, células y cultivos de órganos basados en A. tumefaciens, el sistema de expresión de HR exhibe varias ventajas. En primer lugar, los HR son genéticamente estables y se producen rápidamente en medios libres de hormonas 1,9,10. Además, los HR pueden producir metabolitos especializados en cantidades equivalentes o mayores que las raíces nativas11,12. Estas ventajas hacen de los HR una herramienta biotecnológica deseable para especies vegetales que son incompatibles con A. tumefaciens o que requieren condiciones especiales de cultivo de tejidos para formar tejidos compatibles. El método HR es un enfoque eficiente para analizar las interacciones proteína-proteína, la localización subcelular de proteínas, la producción de proteínas recombinantes, la fitorremediación, la mutagénesis y los efectos de todo el genoma utilizando la secuenciación de ARN13,14,15. También puede ser utilizado para estudiar la producción de metabolitos especializados que tienen valor en la industria, incluyendo glicomolinas, que medican la defensa de la soja contra el importante patógeno microbiano Phytophthora sojae y tienen impresionantes actividades anticancerígenas y neuroprotectoras en humanos16,17.
Este informe demuestra un protocolo fácil y eficiente para producir HR de soja. En comparación con los métodos anteriores de transformación de HR, este protocolo proporciona una mejora significativa (33% -50%) en la tasa de formación de HR mediante la preselección de transformadores de A. rhizogenes para detectar la presencia del plásmido Ti antes de inocular cotiledones de soja. Demostramos la aplicabilidad de este protocolo transformando varios vectores binarios que sobreexpresan o silencian los genes del factor de transcripción de soja.
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Protocol
NOTA: Se recomienda que todos los pasos del procedimiento se lleven a cabo en condiciones estériles.
1. Esterilización de semillas de soja
- En un gabinete de bioseguridad, coloque 16-20 semillas de soja Williams 82 redondas en perfectas condiciones (es decir, sin grietas ni manchas) en un tubo de centrífuga de 50 ml.
- Agregue 30 ml de alcohol isopropílico al 70%, agite suavemente durante 30 s y luego decanta el alcohol.
- Agitar suavemente las semillas con 30 ml de lejía al 10% durante 10 s y dejar que las semillas reposen en la solución durante 5 min a temperatura ambiente (RT, 25 °C). Después de 5 minutos, escurrir la lejía.
- Repita la agitación tres veces con 30 mL de H2O ultrapuro estéril durante 1 minuto por enjuague y deseche elH2Oentrecada enjuague.
- Coloque las semillas esterilizadas en papel de filtro saturado con 5 ml de medio de germinación y cocultivo (GC) (medio líquido de autoclave de media fuerza Murashige y Skoog [MS] con 1% de sacarosa [pH = 5.8] y luego agregue 2.5 ml / L de vitaminas) en placas de Petri estériles.
- Coloque las placas en la oscuridad a RT (25 °C) durante 3 días antes de transferir las placas a 22 °C bajo 16 h de luces fluorescentes T5 de color blanco frío (100 μE m-2·s-1) durante 4 días para permitir que las semillas germinen.
NOTA: Deseche las semillas que están arrugadas o agrietadas. Las mejores semillas son aquellas que son grandes y uniformemente amarillas. Esterilice al menos el doble del número de semillas requeridas para el experimento para seleccionar semillas de buena calidad, ya que algunas semillas pueden no ser óptimas debido a daños, enfermedades o falta de germinación.
2. Infección de cotiledones con K599
NOTA: Utilice vectores de la serie pGWB, ya que su selección dual garantiza la integración genómica de todo el casete de ADN-T. La electroporación se utilizó para transformar un vector binario que alberga el gen de interés en A. rhizogenes pRi265918.
- En base a la secuencia del plásmido A. rhizogenes pRi265918, se diseñaron cebadores para detectar el plásmido Ti del gen VirD2 (VirD2 hacia adelante: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; Reverso de VirD2: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Tamaño de amplificación esperado: 221 pb). Después de la transformación, pruebe las colonias de Agrobacterium para la retención de VirD2 por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un kit de PCR (consulte la Tabla de materiales). Ciclo de PCR: 94 °C durante 3 min; 35 ciclos (94 °C durante 1 min, 58 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 min); y 72 °C durante 10 min.
- Tras la selección de la colonia de A. rhizogenes que contiene tanto VirD2 como el gen de interés (GOI), colocar algunas placas medianas de Luria-Bertani (LB) que contengan los antibióticos apropiados (50 mg/L) para el plásmido de interés e incubar durante la noche a 30 °C. Si usa espectinomicina, agregue una concentración de 100 mg / L.
- Utilice una punta de pipeta P200 para raspar una longitud de ~1,5 cm de la K599 Agrobacterium de las placas LB y resuspender las células en 1 ml de tampón fosfato (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
- Diluir el Agrobacterium enH2Oultrapuro esterilizado (v/v = 1:1) y acetosiringona (AS; 100 mM de stock en dimetilsulfóxido [DMSO], v/v = 1:1000). Mida la absorbancia utilizando un tubo de cubeta a una densidad óptica de 600 nm (OD600). El rango óptimo esperado está entre 0,5 y 0,8.
- En un gabinete de bioseguridad, sumerja un bisturí esterilizado en la solución K599 Agrobacterium y haga varios cortes profundos de 1 mm a lo largo de la superficie interna (adaxial, lado plano) del cotiledón. Durante la inoculación, use fórceps esterilizados para estabilizar el cotiledón.
- Coloque alrededor de 6-8 cotiledones cortados con el lado hacia abajo en una placa de Petri que contenga papel de filtro saturado con medio GC con AS.
NOTA: Para preparar 6 placas, 50 mL de medio GC y 50 μL de 100 mM AS para alcanzar una concentración final de 100 μM es suficiente. - Incubar las placas a RT (25 °C) durante 3 días bajo un fotoperiodo de 16 h (~65 μE).
- Transfiera los cotiledones infectados a placas de crecimiento de raíces peludas (HRG) (MS de fuerza media en autoclave con sacarosa al 3% [pH = 5.8] y 2.6 g / L de Gelzan, luego agregue una mezcla de vitaminas de 2.5 ml / L y 500 mg / L de timentina).
NOTA: Hubo algunos problemas con la timentina de algunos proveedores alternativos, de los cuales el K599 no fue eliminado. Se recomienda utilizar placas de Petri más altas (100 mm x 25 mm) para el medio HRG. - Incubar las placas de HRG a 22 °C en una cámara de crecimiento con los parámetros ajustados a 100 μE de luz en un fotoperiodo de 16 h hasta que se observen raíces primarias con raíces secundarias de 2-3 cm de longitud (~3-4 semanas).
3. Selección y recolección de HRs
- Cosecha raíces primarias (5-7 cm de longitud) que crecen desde el callo y contienen raíces secundarias (2-3 cm de longitud) usando un bisturí estéril y fórceps. Transfiera a la selección las placas de HRG que contienen los antibióticos apropiados. Deje que los HR crezcan durante 5 días más en las placas HRG de selección.
NOTA: Kanamicina (50 mg/L), higromicina (50 mg/L) o fosfinotricina (10 mg/L) se utilizan típicamente para la selección. Para vectores de expresión, pGWB2 se usa para la sobreexpresión, pANDA35HK se usa para silenciar ARNi, pGWB6 se usa para localización subcelular y pMDC7 se usa para expresión inducible. - En el día 5, cosechar HRs transgénicos con raíces secundarias de 3-6 cm de longitud. Si se observan proteínas fluorescentes, las raíces secundarias tienen poca autofluorescencia. Si realiza tratamientos elicitores o químicos, corte las raíces secundarias en trozos de 1 cm y coloque ~ 100 mg en agar HRG en una pila. A continuación, saturar las pilas con 80 μL del tratamiento adecuado y dejar que las placas se incuben a RT (25 °C).
- Después del tiempo de tratamiento deseado, proceda con extracciones de ARN o metabolitos.
- Para el ARN, seque rápidamente las raíces en una toalla de papel esterilizada y coseche directamente en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
- Selle inmediatamente la parte superior del tubo con parafilm, haga dos orificios pequeños con pinzas puntiagudas y sumerja los tubos en nitrógeno líquido. Liofilizar durante 3 días, luego almacenar las muestras a -80 °C.
NOTA: Es esencial seleccionar HR que sean blancos. Después de 5 días de crecimiento en la placa selectiva, las HR transgénicas permanecerán blancas, pero las raíces no transgénicas se volverán marrones.
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Representative Results
Los resultados representativos provienen de los datos publicados19,20. Los resultados de la PCR de colonias (cPCR) de la K599 Agrobacterium transformada se muestran en la Figura 1. Como indican las colonias positivas en la Figura 1, el gen de interés fue detectado por cPCR (Figura 1A). Sin embargo, entre un tercio y la mitad de las colonias fueron negativas para el cribado del gen VirD2 (Figura 1B), lo que indica la pérdida del plásmido Ti, y serían incapaces de generar callos o raíces peludas. La Figura 2 ilustra el procedimiento general de preparación de HR de soja y el análisis de expresión génica. La Figura 3 muestra la localización subcelular de GFP-GmJAZ1-6. La Figura 4 es un análisis de expresión génica que muestra la sobreexpresión del factor de transcripción de gliceolina GmHSF6-1 y el silenciamiento de ARNi de GmMYB29A2 en raíces peludas de Williams 82. Resultados similares se han obtenido en varios informes recientes20,21.
Figura 1: PCR de colonias (cPCR) de la Agrobacteria K599 utilizando cebadores de PCR de colonias del gen de interés o VirD2. (A) Gen de interés cPCR. (B) VirD2 cPCR. Abreviaturas: C = colonia; +ve = control positivo; -ve = control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción general del cultivo de raíz pilosa de soja (HR) y procedimiento de análisis de la función génica. Callos formados en el sitio de la herida 2 semanas después de la infección por K599 Agrobacterium . La diferenciación celular ocurrió después de 1 semana, luego transcurrió 1 semana para el alargamiento de la FC. Esto fue seguido por la recolección HR y el elicitor de glucano de pared (WGE) / tratamiento simulado durante 24 h. Los HR se sometieron a extracción de metabolitos para análisis de cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC) y aislamiento de ARN para análisis de expresión génica, respectivamente. WGE es el elicitor de glucano de pared de Phytophthora sojae. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Microscopía de fluorescencia de GmJAZ1-6 fusionada traduccionalmente a una proteína fluorescente verde (GFP) en raíces transgénicas Williams 82 peludas. (A) Canal verde (GFP). (B) Canal azul (DAPI). (C) Canales verdes y azules fusionados. Todas las imágenes fueron recolectadas usando un microscopio confocal Zeiss. Las imágenes DAPI (6 μg/mL) indican tinción nuclear. Las barras de escala son de 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de expresión génica. (A) Expresión génica en la sobreexpresión de GmHSF6-119 Williams 82 HRs de soja bajo tratamiento simulado de 24 h o provocado durante 24 h con WGE. (B) Expresión génica en RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 HRs de soja provocados durante 24 h con WGE. WGE es el elicitor de glucano de pared de Phytophthora sojae. unSignificativamente mayor y bsignificativamente menor que el control, estudiantes pareados t-test (p < 0,01). Las barras de error representan SE (n ≥ 3 réplicas biológicas). Las raíces secundarias recolectadas de una raíz primaria indicaron una réplica biológica. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Lin et al.19 y Jahan et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante la última década, el método HR de soja se ha desarrollado como una poderosa herramienta para estudiar genes involucrados en la fijación de nitrógeno 22,23, tolerancia al estrés biótico y abiótico 24,25 y vías biosintéticas de metabolitos 26,27. El conocimiento de cómo las plantas producen metabolitos tiene una gran cantidad de beneficios para la producción agrícola y la industria farmacéutica, ya que puede ser utilizado para estudiar las redes de genes que están involucradas en la mediación de las defensas bioquímicas contra patógenos28.
Para priorizar la productividad y la rentabilidad, este protocolo simplifica el procedimiento. Por ejemplo, en lugar de utilizar medios sólidos más caros que contienen un agente gelificante, las semillas de soja se germinan en condiciones estériles utilizando toallas de papel de grado industrial saturadas con medio de crecimiento líquido. Las técnicas de laboratorio aséptico y el mantenimiento de condiciones de trabajo estériles son esenciales para los experimentos de transformación de HR, ya que una amplia gama de microorganismos, como hongos y levaduras, pueden causar contaminación de cultivos in vitro .
Además, utilizar la intensidad adecuada de luz y fotoperiodo es crucial para la cultura de RRHH. El proceso de crecimiento y desarrollo de las plantas en cultivos in vitro se ve afectado significativamente por la calidad de la intensidad de la luz y el fotoperiodo, como se observó en diversos estudios previos. Si la intensidad de la luz es demasiado baja o demasiado alta, puede ralentizar el proceso de inducción de la raíz. Del mismo modo, si el fotoperíodo es inapropiado, puede conducir a la falla de la formación de callos y al desarrollo celular diferenciado29. Además, según nuestros experimentos anteriores, los HR no transgénicos son resistentes a la kanamicina (50 mg / L) cuando se usan como único antibiótico. Por esta razón, normalmente utilizamos vectores que codifican resistencia dual para la higrogicina y la kanamicina. Bajo esta estricta selección, podemos obtener una tasa de HR transgénica positiva del 15% -30% del total de raíces, sin embargo, ~ 80% de esas HR tienen genes significativamente sobreexpresados / silenciados codificados por los vectores.
Para garantizar el éxito de los experimentos de transformación de HR, es crucial probar si la cepa A. rhizogenes utilizada en el experimento conserva el plásmido Ti que codifica los genes de virulencia. La presencia del plásmido Ti es necesaria para la integración exitosa del ADN-T en el genoma de la planta4. El uso de cPCR para detectar el plásmido Ti se ha convertido en un paso esencial en este protocolo. En el pasado, encontramos que el 33% -50% de nuestras transformaciones no producirían callos y raíces. Sin saberlo, esto se debió a la pérdida del plásmido Ti durante la transformación o posterior cultivo de A. rhizogenes. Ahora, mediante el análisis de PCR de las colonias de Agrobacterium después de su transformación, aseguramos que el plásmido Ti está presente y que el 100% de los experimentos de transformación producen raíces. El uso de cPCR en este protocolo ha demostrado ser una valiosa adición al procedimiento estándar de transformación de recursos humanos. Ha reducido el número de experimentos fallidos, ahorrando así tiempo y recursos. El paso cPCR también nos ha permitido confirmar que el proceso de transformación funciona según lo previsto, asegurando que los resultados de los experimentos sean confiables y reproducibles.
No obstante, este método simplificado tiene algunas limitaciones. Por ejemplo, este protocolo puede responder preguntas biológicas celulares básicas sobre las funciones de los genes en los HR transgénicos. Sin embargo, las preguntas relacionadas con otros tejidos vegetales, como brotes y hojas, pueden no ser comprobables en los HR. Siempre es importante confirmar que el proceso que se está estudiando no se ve afectado por los niveles de hormonas ectópicas u otros factores introducidos por A. rhizogenes. Los investigadores deben tomar nota de sus limitaciones y diseñar cuidadosamente experimentos para garantizar resultados precisos y significativos.
En resumen, el protocolo demostrado aquí es un método altamente eficiente para investigar la función génica en las raíces de soja. Recientemente hemos demostrado su valor en el estudio de enfoques de ingeniería multigénica y la comprensión de las redes de genes involucradas en la regulación de las defensas bioquímicas de la soja19. La eficiencia relativa del enfoque lo hace ideal para responder preguntas complejas en biología vegetal que requieren la investigación de numerosos genes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) número de subvención RGPIN-2020-06111 y por una generosa donación de Brad Lace. Nos gustaría agradecer a Wayne Parrott (Universidad de Georgia) por el K599 Agrobacterium y el protocolo preliminar, y al laboratorio Nakagawa & Hachiya (Universidad de Shimane) por los vectores vacíos pGWB2, pGWB6 y pANDA35HK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
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