Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.
Abstract
La soja (Glycine max) es un cultivo valioso en la agricultura que tiene miles de usos industriales. Las raíces de soja son el sitio principal de interacción con los microbios transmitidos por el suelo que forman simbiosis para fijar nitrógeno y patógenos, lo que hace que la investigación que involucra la genética de la raíz de soja sea de suma importancia para mejorar su producción agrícola. La transformación genética de las raíces peludas de soja (HRs) está mediada por la cepa NCPPB2659 de Agrobacterium rhizogenes (K599) y es una herramienta eficiente para estudiar la función génica en las raíces de soja, tomando solo 2 meses de principio a fin. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado que describe el método para sobreexpresar y silenciar un gen de interés en las HR de soja. Esta metodología incluye la esterilización de semillas de soja, la infección de cotiledones con K599 y la selección y recolección de HR genéticamente transformadas para el aislamiento de ARN y, si se justifica, análisis de metabolitos. El rendimiento del enfoque es suficiente para estudiar simultáneamente varios genes o redes y podría determinar las estrategias de ingeniería óptimas antes de comprometerse con enfoques de transformación estables a largo plazo.
Introduction
La soja (Glycine max) es uno de los cultivos más valiosos en la agricultura. Tiene miles de usos comerciales e industriales, como alimentos, piensos, aceite y como fuente de materias primas para la fabricación1. Su capacidad para formar una relación simbiótica con los microorganismos del suelo fijadores de nitrógeno, a saber, los rizobios, eleva aún más la importancia de estudiar la genética de la soja2. Por ejemplo, ajustar las propiedades de fijación de nitrógeno en las raíces de soja puede conducir a la reducción de las emisiones de carbono y reducir en gran medida los requisitos de fertilizante nitrogenado3. Por lo tanto, comprender la genética que controla aspectos de la biología de la raíz de la soja, en particular, tiene amplias aplicaciones en la agricultura y la industria. Teniendo en cuenta estos beneficios, es importante contar con un protocolo confiable para analizar la función de los genes de la soja.
Agrobacterium tumefaciens es quizás la herramienta más utilizada para la transformación genética de plantas, ya que tiene la capacidad de integrar el ADN de transferencia (ADN-T) en el genoma nuclear de muchas especies de plantas. Cuando Agrobacterium infecta una planta, transfiere el plásmido inductor de tumores (Ti) al cromosoma huésped, lo que lleva a la formación de un tumor en el sitio de la infección. La transformación mediada por Agrobacterium ha sido ampliamente utilizada durante décadas para el análisis funcional de genes y para modificar los rasgos de los cultivos4. Aunque cualquier gen de interés puede transferirse fácilmente a las células vegetales huésped a través de la transformación mediada por A. tumefaciens, este método tiene varios inconvenientes; Requiere mucho tiempo, es costoso y requiere una amplia experiencia para muchas especies de plantas, como la soja. Aunque algunas variedades de soja pueden ser transformadas por el enfoque de nodo cotiledonario utilizando A. tumefaciens, la ineficiencia de este enfoque requiere la necesidad de una tecnología alternativa de transformación genética que sea rápida y altamente eficiente 4,5. Incluso un no experto puede usar este método de transformación de raíz pilosa (HR) mediado por Agrobacterium rhizogenes para superar estas desventajas.
La transformación de HR es una herramienta relativamente rápida, no solo para analizar la función de los genes, sino también para aplicaciones biotecnológicas, como la producción de metabolitos especializados y productos químicos finos, y glicoproteínas bioactivas complejas6. La producción de HRs de soja no requiere una amplia experiencia, ya que pueden generarse hiriendo las superficies de los cotiledones, seguido de la inoculación con Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes expresa genes de virulencia (Vir) codificados por su plásmido Ti que transfieren, transportan e integran su segmento de ADN-T en el genoma de las células vegetales mientras estimulan simultáneamente el crecimiento de raíces ectópicas8.
En comparación con otros sistemas de expresión génica de soja, como los biolistics o la transformación de tejidos, células y cultivos de órganos basados en A. tumefaciens, el sistema de expresión de HR exhibe varias ventajas. En primer lugar, los HR son genéticamente estables y se producen rápidamente en medios libres de hormonas 1,9,10. Además, los HR pueden producir metabolitos especializados en cantidades equivalentes o mayores que las raíces nativas11,12. Estas ventajas hacen de los HR una herramienta biotecnológica deseable para especies vegetales que son incompatibles con A. tumefaciens o que requieren condiciones especiales de cultivo de tejidos para formar tejidos compatibles. El método HR es un enfoque eficiente para analizar las interacciones proteína-proteína, la localización subcelular de proteínas, la producción de proteínas recombinantes, la fitorremediación, la mutagénesis y los efectos de todo el genoma utilizando la secuenciación de ARN13,14,15. También puede ser utilizado para estudiar la producción de metabolitos especializados que tienen valor en la industria, incluyendo glicomolinas, que medican la defensa de la soja contra el importante patógeno microbiano Phytophthora sojae y tienen impresionantes actividades anticancerígenas y neuroprotectoras en humanos16,17.
Este informe demuestra un protocolo fácil y eficiente para producir HR de soja. En comparación con los métodos anteriores de transformación de HR, este protocolo proporciona una mejora significativa (33% -50%) en la tasa de formación de HR mediante la preselección de transformadores de A. rhizogenes para detectar la presencia del plásmido Ti antes de inocular cotiledones de soja. Demostramos la aplicabilidad de este protocolo transformando varios vectores binarios que sobreexpresan o silencian los genes del factor de transcripción de soja.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la última década, el método HR de soja se ha desarrollado como una poderosa herramienta para estudiar genes involucrados en la fijación de nitrógeno 22,23, tolerancia al estrés biótico y abiótico 24,25 y vías biosintéticas de metabolitos 26,27. El conocimiento de cómo las plantas producen metabolitos tiene una gran cantidad de b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) número de subvención RGPIN-2020-06111 y por una generosa donación de Brad Lace. Nos gustaría agradecer a Wayne Parrott (Universidad de Georgia) por el K599 Agrobacterium y el protocolo preliminar, y al laboratorio Nakagawa & Hachiya (Universidad de Shimane) por los vectores vacíos pGWB2, pGWB6 y pANDA35HK.
Materials
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
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