Summary
Her præsenterer vi en protokol for højeffektiv produktion af transgene sojabønnehårede rødder.
Abstract
Sojabønner (Glycine max) er en værdifuld afgrøde i landbruget, der har tusindvis af industrielle anvendelser. Sojabønnerødder er det primære sted for interaktion med jordbårne mikrober, der danner symbiose for at fiksere nitrogen og patogener, hvilket gør forskning, der involverer sojabønnerodgenetik, af største betydning for at forbedre landbrugsproduktionen. Den genetiske transformation af sojabønnehårede rødder (HR'er) medieres af Agrobacterium rhizogenes-stammen NCPPB2659 (K599) og er et effektivt værktøj til at studere genfunktionen i sojabønnerødder, der kun tager 2 måneder fra start til slut. Her giver vi en detaljeret protokol, der skitserer metoden til overekspression og hæmning af et gen af interesse for sojabønne-HR'er. Denne metode omfatter sterilisering af sojabønnefrø, infektion af kimblade med K599 og udvælgelse og høst af genetisk transformerede HR'er til RNA-isolering og, hvis det er berettiget, metabolitanalyser. Tilgangens gennemstrømning er tilstrækkelig til samtidig at studere flere gener eller netværk og kunne bestemme de optimale tekniske strategier, inden man forpligter sig til langsigtede stabile transformationsmetoder.
Introduction
Sojabønne (Glycine max) er blandt de mest værdifulde afgrøder i landbruget. Det har tusindvis af kommercielle og industrielle anvendelser, såsom mad, dyrefoder, olie og som kilde til råvarer til fremstilling1. Dens evne til at danne et symbiotisk forhold til kvælstoffikserende jordmikroorganismer, nemlig rhizobia, øger yderligere vigtigheden af at studere sojabønnegenetik2. For eksempel kan finjustering af kvælstoffikseringsegenskaber i sojabønnerødder føre til reduktion af kulstofemissioner og i høj grad reducere kravene til kvælstofgødning3. Således har forståelsen af genetikken, der styrer aspekter af sojabønnerotbiologi, især brede anvendelser inden for landbrug og industri. I betragtning af disse fordele er det vigtigt at have en pålidelig protokol til at analysere funktionen af sojabønnegener.
Agrobacterium tumefaciens er måske det mest almindeligt anvendte værktøj til plantegenetisk transformation, da det har evnen til at integrere overførsels-DNA (T-DNA) i det nukleare genom hos mange plantearter. Når Agrobacterium inficerer en plante, overfører den det tumorinducerende (Ti) plasmid til værtskromosomet, hvilket fører til dannelsen af en tumor på infektionsstedet. Den Agrobacterium-medierede transformation har været meget udbredt i årtier til genfunktionel analyse og for at ændre afgrødeegenskaber4. Selvom ethvert gen af interesse let kan overføres til værtsplanteceller gennem A. tumefaciens-medieret transformation, har denne metode flere ulemper; Det er tidskrævende, dyrt og kræver omfattende ekspertise for mange plantearter, såsom sojabønner. Selvom nogle få sorter af sojabønner kan transformeres ved hjælp af cotyledonary node-tilgangen ved hjælp af A. tumefaciens, nødvendiggør ineffektiviteten af denne tilgang behovet for en alternativ genetisk transformationsteknologi, der er hurtig og yderst effektiv 4,5. Selv en ikke-ekspert kan bruge denne Agrobacterium rhizogenes-medieret håret rod (HR) transformationsmetode til at overvinde disse ulemper.
HR-transformation er et relativt hurtigt værktøj, ikke kun til analyse af genfunktion, men også til bioteknologiske anvendelser, såsom produktion af specialiserede metabolitter og finkemikalier og komplekse bioaktive glycoproteiner6. Produktionen af sojabønne-HR'er kræver ikke omfattende ekspertise, da de kan genereres ved at såre overfladerne af cotyledoner efterfulgt af podning med Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes udtrykker virulens (Vir) gener kodet af dets Ti-plasmid, der overfører, bærer og integrerer dets T-DNA-segment i genomet af planteceller, samtidig med at det stimulerer ektopisk rodvækst8.
Sammenlignet med andre sojabønnegenekspressionssystemer, såsom biolistik eller A. tumefaciens-baseret transformation af vævs-, celle- og organkultur, udviser HR-ekspressionssystemet flere fordele. For det første er HR'er genetisk stabile og produceres hurtigt på hormonfrie medier 1,9,10. Derudover kan HR'er producere specialiserede metabolitter i mængder, der svarer til eller er større end indfødte rødder11,12. Disse fordele gør HR'er til et ønskeligt bioteknologisk værktøj til plantearter, der er uforenelige med A. tumefaciens, eller som kræver særlige vævskulturbetingelser for at danne kompatibelt væv. HR-metoden er en effektiv tilgang til analyse af protein-proteininteraktioner, proteinsubcellulær lokalisering, rekombinant proteinproduktion, fytoremediering, mutagenese og genomdækkende effekter ved hjælp af RNA-sekventering13,14,15. Det kan også bruges til at studere produktionen af specialiserede metabolitter, der har værdi i branchen, herunder glyceolliner, som medicinerer sojabønnens forsvar mod det vigtige mikrobielle patogen Phytophthora sojae og har imponerende anticancer og neurobeskyttende aktiviteter hos mennesker16,17.
Denne rapport demonstrerer en nem og effektiv protokol til fremstilling af sojabønne-HR'er. Sammenlignet med tidligere HR-transformationsmetoder giver denne protokol en signifikant (33% -50%) forbedring i HR-dannelseshastigheden ved at præscreene A. rhizogenes-transformanter for tilstedeværelsen af Ti-plasmidet inden podning af sojabønnekimbladede. Vi demonstrerer anvendeligheden af denne protokol ved at transformere flere binære vektorer, der overudtrykker eller tavse sojabønnetranskriptionsfaktorgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Det anbefales, at alle de igangværende trin udføres under sterile forhold.
1. Sterilisering af sojabønnefrø
- I et biosikkerhedsskab placeres 16-20 runde Williams 82 sojabønnefrø i uberørt tilstand (dvs. ingen revner eller pletter) i et 50 ml centrifugerør.
- Tilsæt 30 ml 70% isopropylalkohol, ryst forsigtigt i 30 sekunder, og dekanter derefter alkoholen.
- Ryst forsigtigt frøene med 30 ml 10% blegemiddel i 10 s og lad frøene sidde i opløsningen i 5 minutter ved stuetemperatur (RT, 25 °C). Efter 5 minutter drænes blegemidlet.
- Omrystningen gentages tre gange med 30 ml steril ultraren H 2 O i 1 minpr. skylning, og H2O kasseres mellem hver skylning.
- Placer de steriliserede frø på filterpapir mættet med 5 ml spiring og co-dyrkning (GC) medium (autoklave halv styrke væske Murashige og Skoog [MS] medium med 1% saccharose [pH = 5,8] og tilsæt derefter 2,5 ml / L vitaminer) i sterile petriskåle.
- Pladerne anbringes i mørke ved RT (25 °C) i 3 dage, før pladerne overføres ved 22 °C under 16 timers køligt, hvidt T5-lysstofrør (100 μE m-2·s-1) i 4 dage, så frøene kan spire.
BEMÆRK: Kassér frø, der er rynket eller revnet. De bedste frø er dem, der er store og ensartet gule. Steriliser mindst det dobbelte antal frø, der kræves til eksperimentet for at vælge frø af god kvalitet, da nogle frø muligvis ikke er optimale på grund af skader, sygdomme eller manglende spiring.
2. Infektion af cotyledoner med K599
BEMÆRK: Brug vektorer i pGWB-serien, da deres dobbelte selektion sikrer genomisk integration af hele T-DNA-kassetten. Elektroporation blev brugt til at omdanne en binær vektor, der indeholdt genet af interesse, til A. rhizogenes pRi265918.
- Baseret på sekvensen af A. rhizogenes pRi2659 plasmid18, design primere til påvisning af Ti-plasmidgenet VirD2 (VirD2 fremad: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; VirD2 omvendt: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Forventet forstærkningsstørrelse: 221 bp). Efter transformation testes Agrobacterium-kolonierne for tilbageholdelse af VirD2 ved polymerasekædereaktion (PCR) ved hjælp af et PCR-kit (se materialetabel). PCR-cyklus: 94 °C i 3 min; 35 cyklusser (94 °C i 1 min, 58 °C i 30 sek., 72 °C i 1 min) og 72 °C i 10 min.
- Efter udvælgelsen af A. rhizogenes-kolonien , der indeholder både VirD2 og det pågældende gen (GOI), streges nogle ud på Luria-Bertani (LB) mellemplader, der indeholder de relevante antibiotika (50 mg/l) til det pågældende plasmid, og inkuberes natten over ved 30 °C. Hvis du bruger spectinomycin, tilsættes en koncentration på 100 mg / l.
- Brug en P200-pipettespids til at skrabe en ~1,5 cm længde af K599 Agrobacterium af LB-pladerne og resuspender cellerne i 1 ml fosfatbuffer (PB; 0,01 MNa2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
- Agrobakterien fortyndes i steriliseret, ultrarentH2O(v/v = 1:1) og acetosyringon (AS; 100 mM stamolie i dimethylsulfoxid [DMSO], v/v = 1:1000). Absorbansen måles ved hjælp af et kuvetterør med en optisk densitet på 600 nm (OD600). Det forventede optimale interval er mellem 0,5 og 0,8.
- I et biosikkerhedsskab dyppes en steriliseret skalpel i K599 Agrobacterium-opløsningen og foretages flere 1 mm dybe snit langs cotyledonens indre overflade (adaxial, flad side). Under podningen skal du bruge steriliseret tang til at stabilisere cotyledonen.
- Læg ca. 6-8 kimblade skåret med siden nedad på en petriskål, der indeholder filterpapir mættet med GC-medium med AS.
BEMÆRK: For at forberede 6 plader er 50 ml GC-medium og 50 μL 100 mM AS for at opnå en slutkoncentration på 100 μM tilstrækkelig. - Pladerne inkuberes ved RT (25 °C) i 3 dage under en 16 timers fotoperiode (~65 μE).
- Overfør de inficerede kimblade til hårede rodvækstplader (HRG) (autoklave halv styrke MS med 3% saccharose [pH = 5,8] og 2,6 g / L Gelzan, tilsæt derefter 2,5 ml / L vitaminblanding og 500 mg / L timentin).
BEMÆRK: Der var nogle problemer med timentin fra nogle alternative leverandører, hvoraf K599 ikke blev elimineret. Det anbefales at bruge højere petriskålplader (100 mm x 25 mm) til HRG-medium. - HRG-pladerne inkuberes ved 22 °C i et vækstkammer med parametrene indstillet til 100 μE lys i en 16 timers fotoperiode, indtil primære rødder med sekundære rødder på 2-3 cm i længden observeres (~3-4 uger).
3. Udvælgelse og høst af HR'er
- Høst primære rødder (5-7 cm i længden), der vokser fra callus og indeholder sekundære rødder (2-3 cm i længden) ved hjælp af en steril skalpel og tang. Overfør til udvælgelse HRG-plader, der indeholder passende antibiotika. Lad HR'erne vokse i yderligere 5 dage på de udvalgte HRG-plader.
BEMÆRK: Kanamycin (50 mg / L), hygromycin (50 mg / L) eller phosphinothricin (10 mg / L) anvendes typisk til udvælgelse. Til ekspressionsvektorer bruges pGWB2 til overekspression, pANDA35HK bruges til RNAi-hæmning, pGWB6 bruges til subcellulær lokalisering, og pMDC7 bruges til inducerbar ekspression. - På dag 5 høstes transgene HR'er med sekundære rødder 3-6 cm i længden. Hvis man observerer fluorescerende proteiner, har de sekundære rødder lidt autofluorescens. Hvis du udfører elicitor eller kemiske behandlinger, skal du skære de sekundære rødder i stykker på 1 cm og placere ~ 100 mg på HRG-agar i en bunke. Derefter mættes pælene med 80 μL af den passende behandling, og pladerne inkuberes ved RT (25 °C).
- Efter den ønskede behandlingstid fortsættes med RNA- eller metabolitekstraktioner.
- For RNA dupper rødderne hurtigt tørre på et steriliseret papirhåndklæde og høster dem direkte i et 2 ml mikrocentrifugerør.
- Forsegl straks toppen af røret ved hjælp af parafilm, lav to små huller ved hjælp af spidse tang, og nedsænk rørene i flydende nitrogen. Frysetørres i 3 dage, og prøverne opbevares derefter ved -80 °C.
BEMÆRK: Det er vigtigt at vælge HR'er, der er hvide. Efter 5 dages vækst på den selektive plade forbliver transgene HR'er hvide, men ikke-transgene rødder bliver brune.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De repræsentative resultater er fra de offentliggjorte data19,20. Resultaterne af koloniens PCR (cPCR) for den transformerede K599 Agrobacterium er vist i figur 1. Som det fremgår af de positive kolonier i figur 1, blev det interessante gen påvist ved cPCR (figur 1A). Imidlertid var en tredjedel til halvdelen af kolonierne negative for VirD2-genscreeningen (figur 1B), hvilket indikerer tabet af Ti-plasmidet, og ville være ude af stand til at generere hård hud eller hårede rødder. Figur 2 illustrerer den overordnede forberedelsesprocedure for sojabønne-HR'er og genekspressionsanalyse. Figur 3 viser den subcellulære lokalisering af GFP-GmJAZ1-6. Figur 4 er en genekspressionsanalyse, der viser overekspression af glyceollintranskriptionsfaktoren GmHSF6-1 og RNAi-hæmning af GmMYB29A2 i Williams 82 hårede rødder. Lignende resultater er opnået i flere nylige rapporter20,21.
Figur 1: Koloni PCR (cPCR) af K599 Agrobacterium ved anvendelse af koloni PCR-primere af genet af interesse eller VirD2. (A) Gen af interesse cPCR. (B) VirD2 cPCR. Forkortelser: C = koloni; +ve = positiv kontrol; -ve = negativ kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over sojabønnebehåret rodkultur (HR) og genfunktionsanalyseprocedure. Hård hud dannet på sårstedet 2 uger efter K599 Agrobacterium infektion. Celledifferentiering opstod efter 1 uge, derefter gik der 1 uge for HR-forlængelse. Dette blev efterfulgt af HR-høst og vægglucanelicitor (WGE) / mock-behandling i 24 timer. HR'erne blev udsat for metabolitekstraktion til henholdsvis ultra performance væskekromatografi (UPLC) analyse og RNA-isolering til genekspressionsanalyse. WGE er vægglucanelicitor fra Phytophthora sojae. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fluorescensmikroskopi af GmJAZ1-6 translationelt smeltet sammen med et grønt fluorescerende protein (GFP) i transgene Williams 82 hårede rødder. (A) Grøn kanal (GFP). (B) Blå kanal (DAPI). (C) Fusionerede grønne og blå kanaler. Alle billeder blev indsamlet ved hjælp af et Zeiss konfokalmikroskop. DAPI-billeder (6 μg/ml) indikerer nuklear farvning. Vægtbjælker er 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Genekspressionsanalyse. (A) Genekspression ved overekspression af GmHSF6-119 Williams 82 sojabønne-HR'er under 24 timer mock behandling eller fremkaldt i 24 timer med WGE. (B) Genekspression i RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 sojabønne HR'er fremkaldt i 24 timer med WGE. WGE er vægglucanelicitor fra Phytophthora sojae. enSignifikant større og bbetydeligt mindre end kontrol, parrede elever t-test (p < 0,01). Fejlbjælker repræsenterer SE (n ≥ 3 biologiske replikater). Sekundære rødder indsamlet fra en primær rod indikerede en biologisk replikation. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Lin et al.19 og Jahan et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løbet af det sidste årti er sojabønnens HR-metode blevet udviklet som et kraftfuldt værktøj til at studere gener, der er involveret i kvælstoffiksering 22,23, biotisk og abiotisk stresstolerance 24,25 og metabolitbiosyntetiske veje 26,27. Viden om, hvordan planter producerer metabolitter, har en lang række fordele for landbrugsproduktionen og medicinalindustrien, da den kan bruges til at studere gennetværk, der er involveret i formidling af biokemiske forsvar mod patogener28.
For at prioritere produktivitet og omkostningseffektivitet forenkler denne protokol proceduren. For eksempel, i stedet for at bruge dyrere faste medier, der indeholder et geleringsmiddel, spires sojabønnefrø under sterile forhold ved hjælp af papirhåndklæder af industriel kvalitet mættet med flydende vækstmedium. Aseptiske laboratorieteknikker og opretholdelse af sterile arbejdsforhold er afgørende for HR-transformationseksperimenter, da en lang række mikroorganismer, såsom svampe og gær, kan forårsage forurening af in vitro-kulturer .
Derudover er brug af den passende intensitet af lys og fotoperiode afgørende for HR-kulturen. Vækst- og udviklingsprocessen af planter i in vitro-kulturer påvirkes signifikant af kvaliteten af lysintensitet og fotoperiode, som observeret i forskellige tidligere undersøgelser. Hvis lysintensiteten enten er for lav eller for høj, kan det bremse processen med rodinduktion. Tilsvarende, hvis fotoperioden er uhensigtsmæssig, kan det føre til svigt i callusdannelse og differentieret celleudvikling29. Baseret på vores tidligere eksperimenter er ikke-transgene HR'er desuden resistente over for kanamycin (50 mg / L), når de anvendes som det eneste antibiotikum. Af denne grund bruger vi typisk vektorer, der koder for dobbelt resistens for hygromycin og kanamycin. Under denne strenge udvælgelse er vi i stand til at få en positiv transgen HR-rate på 15% -30% af de samlede rødder, men ~ 80% af disse HR'er har signifikant overudtrykt / tavse gener som kodet af vektorerne.
For at sikre succes med HR-transformationseksperimenter er det afgørende at teste, om A. rhizogenes-stammen , der anvendes i eksperimentet, bevarer Ti-plasmidet, der koder for virulensgener. Tilstedeværelsen af Ti-plasmidet er nødvendig for en vellykket integration af T-DNA'et i plantegenomet4. Anvendelsen af cPCR til påvisning af Ti-plasmidet er blevet et væsentligt skridt i denne protokol. Tidligere fandt vi, at 33% -50% af vores transformationer ikke ville producere calli og rødder. Ubevidst skyldtes dette tabet af Ti-plasmidet under transformationen eller efterfølgende dyrkning af A. rhizogenes. Ved PCR-analyse af Agrobacterium-kolonierne efter deres transformation sikrer vi nu, at Ti-plasmidet er til stede, og at 100% af transformationseksperimenterne producerer rødder. Brugen af cPCR i denne protokol har vist sig at være en værdifuld tilføjelse til standard HR-transformationsproceduren. Det har reduceret antallet af mislykkede eksperimenter og derved sparet både tid og ressourcer. cPCR-trinnet har også givet os mulighed for at bekræfte, at transformationsprocessen fungerer efter hensigten, hvilket sikrer, at eksperimenternes resultater er pålidelige og reproducerbare.
Ikke desto mindre har denne forenklede metode nogle begrænsninger. For eksempel kan denne protokol besvare grundlæggende cellebiologiske spørgsmål om genfunktioner i transgene HR'er. Spørgsmål vedrørende andet plantevæv, f.eks. skud og blade, kan dog muligvis ikke testes i HR-registre. Det er altid vigtigt at bekræfte, at processen, der undersøges, ikke påvirkes af ektopiske hormonniveauer eller andre faktorer indført af A. rhizogenes. Forskere bør være opmærksomme på dens begrænsninger og omhyggeligt designe eksperimenter for at sikre nøjagtige og meningsfulde resultater.
Sammenfattende er den her demonstrerede protokol en yderst effektiv metode til undersøgelse af genfunktion i sojabønnerødder. Vi har for nylig demonstreret sin værdi i at studere multigene engineering tilgange og forstå gennetværk involveret i regulering af sojabønner biokemiske forsvar19. Den relative effektivitet af tilgangen gør den ideel til at besvare komplekse spørgsmål inden for plantebiologi, der kræver undersøgelse af adskillige gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) bevillingsnummer RGPIN-2020-06111 og af en generøs donation fra Brad Lace. Vi vil gerne takke Wayne Parrott (University of Georgia) for K599 Agrobacterium og den foreløbige protokol og Nakagawa & Hachiya lab (Shimane University) for de tomme vektorer pGWB2, pGWB6 og pANDA35HK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Cayman | 23224 | |
| Bleach | lavo | 21124 | |
| DMSO | Fisher bioreagents | 195679 | |
| Gelzan | Phytotech | HYY3251089A | |
| Hygromycin | Phytotech | HHA0397050B | |
| Isopropyl alcohol | Fisher chemical | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LB powder | Fisher bioreagents | 200318 | |
| MS powder | Caisson labs | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisher bioreagents | 194171 | |
| NaCl | Fisher chemical | 192946 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| Phosphinothricin | Cedarlane | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR Kit | Sigma | R4775 | |
| Sucrose | Bioshop | 2D76475 | |
| Timentin | Caisson labs | 12222002 | |
| Vitamins | Caisson labs | 2211010 |
References
- Li, S., et al.
- Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner. Scientific Reports. 10, 1619 (2020).
- Huang, X. -F., et al. Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities. Botany. 92 (4), 267-275 (2014).
- Ma, H., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus. Frontiers in Plant Science. 13, 1039094 (2022).
- Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications. The Arabidopsis Book. 15, e0186 (2017).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Chen, L., et al. Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).
- Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method. Current Protocols. 1 (7), e195 (2021).
- Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures. Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).
- Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I. Molecules. 22 (8), 1261 (2017).
- Cheng, Y., et al. Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean. Plant Methods. 17 (1), 73 (2021).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).
- Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation. Frontiers in Plant Science. 10, 1427 (2019).
- Ahmed, S., Kovinich, N. Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health. Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).
- Walker, R. R., et al. Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887 (2022).
- Tong, X., et al. The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots. International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).
- Lin, J., et al. RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1. Plants. 12 (3), 545 (2023).
- Jahan, M. A., et al. Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).
- Jahan, M. A., et al. The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean. BMC Genomics. 20, 149 (2019).
- Nguyen, C. X., et al. Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development. The Plant Genome. , e20171 (2021).
- Brear, E. M., et al. GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation. New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).
- Chen, Z., et al. Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants. Agronomy. 11 (1), 170 (2021).
- Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode. Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).
- Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.). Molecules. 27 (18), 6118 (2022).
- Lozovaya, V. V., et al. Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani. Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).
- Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).
