利用表面增强拉曼散射光谱与显微技术在单个纳米颗粒上追踪电化学过程

摘要

该方案描述了如何利用表面增强拉曼散射光谱和成像技术监测单个纳米颗粒上的电化学事件。

摘要

研究单个纳米颗粒上的电化学反应对于理解单个纳米颗粒的非均一性性能至关重要。这种纳米尺度的异质性在纳米颗粒的系综平均表征中往往被掩盖。虽然已开发出一些电化学技术用于测量单个纳米颗粒的电流，但这些技术无法提供在电极表面发生反应的分子结构和身份信息。光学技术（如表面增强拉曼散射（SERS）显微镜和光谱学）能够在单个纳米颗粒上检测电化学事件，同时提供电极表面物种振动模式的信息。本文展示了一种利用SERS显微镜和光谱学追踪单个银（Ag）纳米颗粒上尼罗蓝（Nile Blue, NB）电化学氧化还原反应的实验方案。首先，详细描述了在光滑且半透明的银薄膜上制备银纳米颗粒的实验步骤。单个银纳米颗粒与银膜之间会形成一个沿光轴方向对齐的偶极等离激元模式。固定在纳米颗粒与薄膜之间的NB分子产生的SERS发射会耦合进入该等离激元模式，并通过显微镜物镜收集高角度发射光，形成环形（甜甜圈状）发射图案。这种环形SERS发射图案可明确识别基底上的单个纳米颗粒，从而实现对单个纳米颗粒SERS光谱的采集。本研究提供了一种将SERS基底用作工作电极的方法，该电化学池与倒置光学显微镜兼容。最后，展示了在单个银纳米颗粒上追踪NB分子电化学氧化还原过程的实验结果。本文所述的装置与实验方案可经适当修改，用于研究各类单个纳米颗粒上的电化学反应。

引言

电化学是一门重要的测量科学，用于研究电荷转移、电荷存储、物质传输等过程，在生物学、化学、物理学和工程学等多个学科中具有广泛应用。^{1,2,3,4,5,6,7}通常，电化学涉及对整体集合的测量—— 大量单个实体（如分子、晶畴、纳米粒子和表面位点）的集合。然而，由于复杂电化学环境中电极表面的异质性，理解这些单个实体如何贡献于系综平均响应，对于推动化学及相关领域新的基础性和机理性认识至关重要。^8,9例如，系综还原法揭示了特定位点的还原/氧化电位¹⁰中间体的形成与次要催化作用 产物¹¹，位点特异性反应动力学^12,13以及载流子动力学^14,15减少系综平均对于提升我们对实际应用体系（如生物细胞、电催化和电池）的理解尤为重要，因为在这些体系中通常存在显著的异质性。^{16,17,18,19,20,21,22}.

在过去十年左右，出现了一系列用于研究单实体电化学的技术^{1,2,9,10,11,12}这些电化学测量方法使得在多个系统中测量微小的电学和离子电流成为可能，并揭示了新的基本化学与物理特性^{23,24,25,26,27,28}然而，电化学测量无法提供电极表面分子或中间体的身份或结构信息^29,30,31,32电极-电解质界面的化学信息对于理解电化学反应至关重要。通常通过将电化学与光谱学联用来获取界面化学信息。^31,32振动光谱技术，例如拉曼散射，非常适用于提供 电化学系统中电荷转移及相关过程的补充化学信息，此类系统主要（但不限于）使用水性溶剂³⁰结合显微技术，拉曼散射光谱可实现接近光的衍射极限的空间分辨率^33,34衍射存在局限性，因为纳米颗粒和活性表面位点的尺寸小于光学衍射极限，因而无法对单个实体进行研究³⁵.

表面增强拉曼散射（SERS）已被证明是研究电化学反应中界面化学的有力工具^{20,30,36,37,38}。SERS不仅能提供反应物分子、溶剂分子、添加剂以及电极表面化学的振动模式信息，还能产生一种局限于支持集体表面电子振荡（即局域表面等离激元共振）材料表面的信号。等离激元共振的激发会导致电磁辐射在金属表面聚集，从而增强入射光通量以及表面吸附物的拉曼散射。纳米结构的贵金属（如 Ag 和 Au）通常被用作等离激元材料，因为它们支持可见光范围内的等离激元共振，这有利于利用高灵敏度和高效率的电荷耦合器件检测发射信号。尽管SERS中最大的增强效应通常来自纳米粒子的聚集体^39,40，但目前已开发出一种新型SERS基底，可实现对单个纳米粒子的SERS测量：间隙模式SERS基底 （图1）^41,42。在间隙模式SERS基底中，首先制备金属镜面并涂覆待分析物，随后将纳米粒子分散在基底上。当使用圆偏振激光照射时，纳米粒子与基底耦合形成的偶极等离激元共振被激发，从而实现对单个纳米粒子的SERS测量。SERS发射与沿光轴方向取向的偶极等离激元共振相耦合^43,44,45。由于辐射电偶极子与收集光学系统的平行对准，仅收集高角度发射光，因而形成明显的环形（甜甜圈状）发射图案^46,47,48,49，并可用于识别单个纳米粒子。基底上纳米粒子的聚集体包含不平行于光轴的辐射偶极子⁵⁰。在这种情况下，低角度和高角度发射光均被收集，形成实心发射图案⁴⁶。

本文介绍了一种制备间隙模式表面增强拉曼散射（SERS）基底的方案，以及将其用作工作电极以通过SERS监测单个银纳米颗粒上电化学氧化还原过程的操作步骤。重要的是，利用间隙模式SERS基底的该方案能够通过SERS成像明确识别单个纳米颗粒，这正是当前单纳米颗粒电化学研究方法中的一个关键挑战。作为模型体系，我们展示了SERS在单个银纳米颗粒上对尼罗蓝A（NB）的电化学还原与氧化进行检测的应用，该过程由扫描或阶跃电位（即循环伏安法、计时电流法）驱动。NB经历多质子、多电子的还原/氧化反应，其电子结构在反应过程中被调制至偏离或进入与激发光源的共振状态，从而在相应的SERS光谱中产生明显的信号对比^10,51,52。本文所述方案同样适用于非共振型氧化还原活性分子及各类电化学技术，因此可能在电催化等应用中具有重要意义。

方案

1. 间隙模式表面增强拉曼散射基底的制备

1. 使用丙酮和水清洗盖玻片（见材料表），具体步骤如下。此步骤应在洁净室中进行，以确保无任何碎屑或其他不需要的物质沉积在盖玻片上。
   1. 将盖玻片放入载玻片架中。移动盖玻片/基底时使用镊子。将载玻片架放入玻璃容器中，并用丙酮充满。
      注意：丙酮高度易燃，且可能对健康产生不良影响。应在通风良好的区域操作，并佩戴手套、护目镜和口罩。
   2. 将超声波发生器的功率调节至8，对装有载玻片架的玻璃容器进行15分钟的超声处理。
   3. 从容器中取出载玻片架，用超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）彻底冲洗载玻片架和盖玻片。
   4. 将带有盖玻片的载玻片架放入玻璃容器中，并用超纯水充满。使用相同设置对装有载玻片架的玻璃容器再进行15分钟的超声处理。
   5. 从容器中取出载玻片架，用超纯水彻底清洗载玻片架和盖玻片。
   6. 使用喷枪，用高纯度N₂气体气流吹干盖玻片。
2. 在已清洗的盖玻片上沉积Cu和Ag。为此，请按照制造商在官方用户手册中推荐的标准程序，使用电子束薄膜沉积系统。
   注：对于其他任何沉积操作，请遵循机构设施提供的制造商说明⁵³。
   1. 将基板台位置设为180°，并对真空腔室通气。
   2. 将清洁的盖玻片并排放置在仪器的基板台上，确保它们不重叠。使用耐高温胶带（聚酰亚胺薄膜）将盖玻片固定在基板台上。
      注：这可确保盖玻片在操作过程中不会移动或掉落。
   3. 将石墨坩埚填充一半的Cu颗粒，并插入坩埚支架中。对Ag颗粒在第二个坩埚中进行相同操作。关闭真空腔室并开始抽真空；推荐的沉积压力约为10⁻⁷ – 10⁻⁶ Torr。
   4. 在传感器的应用程序中加载Cu的参数。开启基板台旋转，转速设为20 RPM。将基板台位置设为225°。
      注：这将使位于基板台底部的反射镜能够从观察窗看到电子束。
   5. 打开电子束电源的断路器，等待至少2分钟。开启电子束，再等待2分钟。打开基底快门。
      注：这使得通过反射镜可以看见电子束和坩埚。
   6. 逐步（约10 mA/min）增加发射电流，直到传感器读取的沉积速率接近10 Å/s。关闭快门，并将基板台位置设为0°。
      注：在此过程中，电子束的形状可能会发生变化。重要的是要定期检查并使用相应的旋钮调整其位置、振幅和频率。电子束必须均匀加热坩埚内容物。在此时关闭快门可确保当基板台旋转使盖玻片进入蒸发金属路径时，无金属沉积到样品上。
   7. 打开快门开始沉积，并通过传感器显示监控厚度。当达到所需厚度时（Cu为1 nm），关闭快门，该厚度由沉积传感器确定。
   8. 逐步降低电子束电流，直到传感器读数接近0 A，但电流仍需足够高以使坩埚可见。
   9. 将基板台位置设为225°，并打开快门以便观察坩埚。
   10. 使用旋钮旋转坩埚支架，使电子束对准装有Ag颗粒的坩埚。
   11. 在传感器的应用程序中加载Ag的参数。重复步骤1.2.6 – 1.2.7，但使用20 Å/s的沉积速率和25 nm的Ag厚度。
   12. 逐步将电流降至0 A，关闭电子束和断路器。将基板台位置设为180°，并对真空腔室通气。打开真空腔室。
   13. 盖玻片应保持在原来的位置，无外来物质或灰尘颗粒，表面呈镜面状。缓慢而小心地移除耐高温胶带。
       注：应平行于基板台表面向后拉胶带；否则有导致盖玻片破裂的风险。薄膜应均匀且部分透明（见图2A）。
3. 将Ag薄膜与Nile Blue溶液孵育，具体步骤如下。
   1. 在Ag薄膜表面滴加500 µL的50 µM NB溶液。
   2. 15分钟后，用超纯水彻底冲洗Ag薄膜，以去除任何弱吸附的NB分子。用N₂气体吹干Ag薄膜。
   3. 将Ag纳米颗粒滴涂到经NB孵育的Ag薄膜上。在Ag薄膜上先前滴加并孵育NB溶液的同一区域，滴加500 µL稀释100倍的Ag纳米颗粒胶体。
      注意：金属纳米颗粒对人体有毒。应在通风良好的区域操作，并佩戴手套和护目镜。
   4. 20分钟后，用超纯水冲洗（间隙模式SERS）基底。用N₂气体吹干基底。

2. 间隙模式 SERS 基底的表征

1. 紫外-可见光谱法
   1. 按下电源按钮打开仪器。通过双击桌面上的快捷方式启动 Scan 软件。
   2. 点击 Setup 以打开设置窗口。在 Y Mode 下，点击 Mode 下拉菜单，选择 %T 以测量透射率。在 X Mode 下，将 Start 更改为 800，Stop 更改为 200，以实现从 800 nm 到 200 nm 的扫描。
   3. 在 Baseline 选项卡中，选择 Baseline correction 单选按钮，然后关闭设置窗口。点击 Baseline 以使用大气空气进行背景校正。
   4. 打开样品室。用胶带将 Ag 薄膜的一端固定在样品 holder 上，使其垂直于光束路径。
   5. 点击 Start 以获取样品的透射光谱。
2. 原子力显微镜（AFM）测量
   1. 将 AFM 通过 USB 接口连接至计算机，开启 AFM 仪器电源，并启动 Nanosurf Easyscan 2 软件。
   2. 小心地将 AFM 探头（其底面装有 AFM 悬臂）从样品台取下，并倒置放置在一旁。
   3. 使用胶带将 Ag 薄膜基底固定在样品台上。将 AFM 探头置于样品台上方，确保 AFM 探头与样品台平行（通过水平指示器监测）。若 AFM 探头与样品台不水平，使用调平螺丝调节样品台，使水平指示器内的气泡居中。
   4. 利用软件中的侧视图和顶视图，小心移动样品台，使其尽可能接近 AFM 探头（AFM 悬臂），但不发生接触。确保样品台未触碰到 AFM 探头上的悬臂。
   5. 在 Acquisition 选项卡下，选择 Phase Contrast 作为成像模式，PPP-XYNCHR 作为悬臂类型。点击 Laser Align，确保激光聚焦在悬臂尖端，且从尖端反射的光束击中光电二极管探测器的中心。
   6. 通过点击 Frequency Sweep 按钮，使用 AFM 软件测量悬臂的共振振动频率，并确保频率曲线呈钟形。点击 Approach，使悬臂尖端接触 Ag 薄膜表面。
   7. 在成像向导中，选择 Imaging Size 为 10.8 µm x 10.8 µm，扫描速度为 0.5 s/line。在 Z 控制器下，使用 Setpoint 为 50%，P-Gain 为 2,500，I-Gain 为 2,500。在 Mode Properties 下，使用 Free Vibration Amplitude 为 300 mV。
   8. 点击 Start 开始获取图像。右键点击图像，选择 Copy，将其粘贴至图像处理软件中保存。
   9. 在 AFM 软件中，点击所要处理的图像进行选中。在 Analysis 选项卡下，分别点击 Calculate Line Roughness 和 Calculate Area，进行线粗糙度和面粗糙度分析。
   10. 点击 Withdraw 将悬臂尖端从 Ag 薄膜表面撤回。通过侧视图和顶视图监控，将样品台移离探头。取下 样品。
3. 扫描电子显微镜（SEM）测量⁵⁴
   1. 将 30 µL 的原始 Ag 纳米粒子胶体滴加到 Si 晶圆上，并使其完全自然干燥。使用双面导电胶带将 Si 晶圆固定在样品 stub 上。
   2. 通过仪器用户界面对 SEM 腔室进行放气。滑开 SEM 腔室，将 stub 安装在样品台的其中一个孔位上。
   3. 关闭 SEM 腔室，并通过仪器用户界面对腔室抽真空。
   4. 将样品定位在距离电子束枪约 10 mm 的位置。通过仪器用户界面开启电子束。
   5. 使用 Everhart-Thornley 探测器对样品成像，束斑大小为 6，束流为 25 pA，高压为 5 kV。
   6. 双击感兴趣区域，使电子枪自动对准电子束。通过仪器用户界面以 3,500 倍放大倍数进行成像（图 3A）。
   7. 成像完成后，关闭电子束，并将样品移离电子束枪至少 20 mm。
   8. 对 SEM 腔室进行放气。滑开 SEM 腔室，从样品台上取下样品 stub。关闭 SEM 腔室，并通过仪器用户界面再次抽真空。

3. 电化学池的制备

1. 通过使用玻璃管切割器切割玻璃管，获得一段长度为 5 cm 的玻璃小室，具体步骤如下：
   1. 将玻璃管切割器的链条缠绕在玻璃管上。将链条的最后一节固定在工具的另一侧。
   2. 用一只手握住工具的手柄，另一只手固定玻璃管。持续旋转玻璃管，使链条中的轮子开始切割玻璃。
   3. 逐渐用力挤压工具手柄，施加轻微压力。当声音从滑动声变为刮擦声时，表明玻璃小室（小段）即将从玻璃管上分离。
   4. 使用 120 目（或更粗）的砂纸打磨玻璃小室断裂端的边缘。再用 220 目（或更细）的砂纸进行抛光处理。
2. 使用金刚石刻划笔切割间隙模式基底，具体步骤如下：
   1. 将间隙模式基底放置在平坦表面上。在基底中部轻轻施加压力，上下移动金刚石刻划笔。
   2. 当表面出现明显划痕后，手动将基底折断为两部分。
3. 将切割好的玻璃小室（来自步骤 3.1）固定在基底表面，具体操作如下：
   1. 将双组分环氧树脂滴加到一小片铝箔上，使用搅拌棒或移液器吸头充分混合。
   2. 将混合物涂覆在玻璃小室的底缘。尽可能少量涂抹，仅覆盖切割后玻璃小室的边缘，以最大限度减少树脂向细胞内部扩散。
   3. 将玻璃小室粘接到间隙模式基底表面。在小室外侧与基底接触的区域涂覆剩余的混合树脂，防止倒入玻璃小室内的溶液发生泄漏（见 图 4A）。
   4. 静置让环氧树脂固化 5 分钟，期间避免扰动。
4. 将电连接引线连接至间隙模式 SERS 基底，具体步骤如下：
   1. 取一段 5 cm 长的铜导线。将双组分导电环氧树脂滴加到一小片铝箔上，使用铜导线混合各组分。
   2. 将导线连接至基底表面（位于小室外侧，但需接触导电的银薄膜；见 图 4A）。按照推荐时间静置，使导电环氧树脂完全固化。
      注：建议在室温下固化导电环氧树脂，以尽量减少对银膜基底的热退火效应。

4. 体相循环伏安法测量

1. 向一个 20 mL 烧杯中加入 10 mL 的 0.5 mM NB 溶液和 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH = 5）。将一根机械抛光的 Ag 圆盘电极、一根 Pt 丝以及一根 Ag/AgCl（3 M KCl）电极插入电解液中。
2. 将各电极连接至电化学工作站对应的夹子上（由电化学工作站制造商确定）。确保电极之间互不接触。
3. 进行循环伏安法（CV）测试，电位扫描范围为 0 至 −0.6 V，扫描速率为 50 mV/s。

5. 单纳米粒子电化学表面增强拉曼散射显微与光谱测量

1. 将使用间隙模式SERS基底制备的电化学池置于倒置光学显微镜的载物台上。
2. 用胶带将基底边缘固定在显微镜载物台上，以防止在光谱电化学测量过程中因连接电解池与恒电位仪的导线张力导致基底移动（参见 图4B).
3. 将Ag/AgCl（3 M KCl）参比电极插入自制支架中，并通过拧紧电极支架上的螺丝固定其位置。
4. 将参比电极夹在恒电位仪的参比电极鳄鱼夹（白色）上。将铂丝对电极夹在恒电位仪的对电极鳄鱼夹（红色）上。将连接在银膜上的铜丝夹在恒电位仪的工作电极鳄鱼夹（绿色）上。
5. 将铂丝连同鳄鱼夹插入电极架中，并拧紧螺丝以固定其位置。
6. 将电极架放置在电化学池上方，以将电极插入池中。注意避免电极接触银膜；否则不仅会形成短路，还可能损坏薄膜。
7. 打开光谱仪和EMCCD相机，并启动 "LightField" 软件
8. 打开642 nm激光器，并将激光功率调整至500 µW。
   警告：激光照射可能对眼睛和皮肤造成永久性损伤。请查阅并遵守您所在国家/地区相关官方监管机构的安全指南。
9. 在物镜上滴加一滴浸油。调节焦距旋钮，小心地提升物镜，直至浸油接触到基底的下表面。
   注意：由于细胞已被胶带固定，强行将物镜压向基底可能会破坏细胞和/或损坏物镜。
10. 将激光聚焦到间隙模式SERS基底表面。通过移动显微镜载物台扫描间隙模式SERS基底（覆盖有玻璃小室），寻找孤立的环形纳米棒SERS发射图案（参见 图 5A).
    注意：NB 浓度越低，越难找到环形发射模式，但最终获得孤立环形发射模式的可能性越高。可从咖啡环区域开始寻找，然后逐渐向间隙增强拉曼散射（gap-mode SERS）基底上 NB 与 Ag 纳米颗粒孵育区域的内侧移动。此过程中使用相机（见下一步）非常有帮助，因为在扫描间隙增强拉曼散射基底时，相机对光的敏感度高于人眼。
11. 将手机连接至显微镜手机适配器。为使手机摄像头与适配器镜头对齐，请打开手机上的相机应用程序，并调整设备位置，通过镜头观察画面。
12. 取下显微镜的一个目镜，将适配器插入其位置。在相机应用程序中，将模式切换为视频，并尽可能放大。可清晰观察到环形发光图案。
13. 一旦清晰观察到环形发射光模式，移动显微镜的光路分流杆，将发射光引导至光谱仪。
14. 在 实验 LightField 选项卡，单击 常见采集参数设置，并调整 曝光时间 至 0.1 秒和 要保存的帧数 至50。 导出数据，选择 导出获取的数据，并更换 文件类型 导出为 CSV (.csv) 文件。
15. 下 感兴趣区域，选择 自定义感兴趣区域 单选按钮。单击 编辑感兴趣区域在新窗口中，通过修改 X、Y、W 和 H 的数值，在环形发射区域周围创建一个 25 像素 × 25 像素的感兴趣区域（ROI）。
16. 在下方 光谱仪，选择 600 g/mm，750 nm 闪耀光栅. 更换 中心波长 至 642 nm。单击 获取 开始测量。
17. 采集完成后，前往 数据 标签。打开最近执行的实验，然后点击 过程 然后 帧组合.
18. 在合并光谱中，记录观察到最高强度时的激光波长。
19. 返回到 实验，以及在……之下 光谱仪，点击 纳米米在弹出窗口中，将测量模式更改为相对波数，并在输入框中输入测得的激光波长。将光栅位置调整为1,000/cm，以检测从约400/cm到1,600/cm范围内的斯托克斯位移拉曼散射。
20. 采集至少50帧窄带表面增强拉曼光谱（NB SERS），每帧曝光时间为0.1秒（参见 图5C在 592/cm 处寻找一个强峰 以确认发射信号来自NB（参见 图5C)⁵²取环形发射区域附近（无发射区域）的SERS光谱，以校正背景信号。
21. 保持激光束聚焦在环形发射图案上，使用5 mL可调移液器向电化学池中加入3 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH = 5）。
    注意：一旦加入电解质溶液，原本的环形发射模式可能会消失，并出现实心发射模式，这是因为偏离光轴的单个纳米颗粒的偶极模式会辐射出电解质和溶剂分子的表面增强拉曼散射（SERS）光谱。
22. 如有必要，重新对焦，并确保激光光束仍聚焦在发射图案上。
23. 在恒电位仪软件中，设置一个循环伏安图实验，至少进行三个循环，电位范围为 0 至 −0.6 V（相对于 Ag/AgCl（3 M KCl）），扫描速率为 50 mV/s。为同步光谱与电化学数据采集，将恒电位仪设置为由光谱仪的光谱采集信号触发。
24. 同时进行循环伏安法和表面增强拉曼散射实验。间隙模式表面增强拉曼散射基底所施加的电势应能调控对硝基苯硫酚的表面增强拉曼散射光谱（参见 图6B).
25. 移动光路分流杆，使光线导向手机摄像头。开始录制视频，并按照所述方法运行CV实验。SERS图像强度应随施加在间隙模式SERS基底上的电势变化而调制（参见插图） 图 6A).

6. 成像分析

1. 按照以下方法对采集的图像进行处理，以增强其清晰度和对比度。
   注意：图像处理使用 Python 中的 OpenCV 库完成，相关脚本可在 GitHub 上获取（github.com/jvhemmer/jove_specsers）。
   1. 裁剪图像，去除大部分空白区域，并以发射图案为中心。
   2. 删除帧中的绿色和蓝色通道。通过减去该帧的高斯模糊掩膜来提高图像锐度。
   3. 使用幂函数运算进行动态范围扩展，以增强对比度。
2. 使用 ImageJ 在图像上添加标尺，具体步骤如下：
   1. 使用手机相机适配器拍摄一个具有已知尺寸的物体，例如显微镜校准载玻片。
   2. 在 ImageJ 中加载所采集的图像。在图像中具有已知尺寸的区域上绘制一条线段。
   3. 利用 Set Scale 功能，根据所绘线段的长度设置比例尺（即每单位距离对应的像素数）。使用 Scale 工具添加标尺。

7. 纳米颗粒尺寸分析

1. 将SEM图像导入ImageJ。在仪器提供的标尺上绘制一条线段，并使用设置比例尺功能进行标定。
2. 进入图像 > 类型 > 16位。然后进入图像 > 调整 > 自动阈值，在下拉菜单中选择Default。
3. 使用矩形工具，选中并删除非单个纳米颗粒的特征结构。
4. 使用分析颗粒工具，基于测得的面积并假设颗粒为圆形，计算其直径。

8. 光谱电化学数据分析

1. 对采集的光谱数据进行背景校正。在 MATLAB 中进行数据处理和绘图；相关脚本可在前述相同的 GitHub 仓库中获取。
2. 对三次不同背景实验的光谱数据（与表面增强拉曼散射发射图样同时采集的光谱数据）取平均值，并从样品的光谱中减去该平均背景光谱。
3. 创建一个从 0 到实验总时间（循环伏安法）的时间数组，其中时间间隔为曝光时间、EMCCD 读出时间以及快门开启和关闭时间的总和。
4. 利用激光波长将波长测量值转换为 拉曼位移。
5. 使用 MATLAB 的 mesh 函数生成瀑布图，其中 X 轴为拉曼位移，Y 轴为时间，Z 轴为强度。

结果

图2A展示了使用电子束金属沉积系统制备的银薄膜基底。“良好”的基底如图2A所示，在玻璃盖玻片表面具有均匀的银金属覆盖层，而“不良”基底的银覆盖则不均匀。图2B展示了“良好”银薄膜的紫外-可见光谱，表明该薄膜对电磁波谱的可见光区域部分透明。在本实验方案的光谱电化学实验中，所用642 nm激光光下，“良好”银薄膜基底的光学透明度为34%。图2C展示了“良好”基底上10.8 µm × 10.8 µm区域的典型原子力显微镜（AFM）图像。该区域的均方根粗糙度为0.7 nm，表明银薄膜在原子级别上是光滑的。银薄膜基底高度变化由图2D所示的线轮廓图表示，进一步证明了薄膜的均匀性和光滑性。

图3A 显示了滴加并风干在硅片上的银纳米颗粒的典型扫...

讨论

在洁净的盖玻片上沉积铜（Cu）和银（Ag）薄膜至关重要，以确保最终薄膜的粗糙度不超过两到四个原子层（或均方根粗糙度小于或等于约0.7 nm）。在金属沉积前，盖玻片表面存在的灰尘、划痕和碎屑是常见问题，会阻碍形成产生环形发射图案所需的光滑薄膜。因此，建议在金属沉积前使用不同溶剂对盖玻片进行超声清洗，并尽可能在洁净室环境中进行该操作。此外，应仔细关注沉积过程。有必要清洁真空腔室内的所有表面（包括坩埚支架抽屉）以及坩埚本身，因为这些部件容易积聚灰尘和碎屑。

在金属沉积过程中使用的高沉积速率可使沉积薄膜达到原子级平整，但也可能更难控制。若薄膜厚度传感器读数不准确，可能导致薄膜不均匀、过厚或过薄。若金属膜过薄，可能形成材料岛状结构，而非连续的表面。若薄膜过厚，则会使基底不透明，阻碍激发光有效激发纳米棒（NB）分子，并影响发射光的收集；这将降低方法的整体灵敏度，导致表面增强拉曼散射（SERS）图像和光谱质量较差，信噪比较低。在沉积银（Ag）之前先沉积铜（Cu）对后者金属的附着力至关重要，但若铜沉积过量，会降低基底的光学透明性，而铜量不足则会导致银从玻璃盖玻片上剥离。此外，若样品托盘的尺寸大于快...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮，微电子级	J. T. Baker	9005-05
可调移液器，Eppendorf Reference 2 5000 mL	Eppendorf	4924000100
分析天平，AB54-S/FACT	Metter Toledo	N.A.
原子力显微镜，Easy scan 2	Nanosurf	N.A.
AXXIS 电子束薄膜沉积系统	Kurt J. Lesker	N.A.
Cary 60 紫外-可见分光光度计	安捷伦	N.A.
导电环氧树脂，双组分	电子显微镜科学公司	12642-14
铜粒，纯度99.99%	Kurt J. Lesker	EVMCU40EXE
铜线，裸线，18 AWG	VWR	66248-040
石墨电子束坩埚	Kurt J. Lesker	EVCEB-23
金刚石刻划器	Ted Pella	54484
EMCCD相机，ProEM HS：1024BX3	Teledyne Princeton Instruments	N.A.
环氧树脂，透明	Gorilla Glue	N.A.
玻璃管切割器	Wheeler-Rex	69012
玻璃管，硼硅酸盐（外径 0.75"，ID 0.62"，L 12")	McMaster-Carr	8729K45
浸油，F型	Olympus	IMMOIL-F30CC
倒置显微镜，IX73	Olympus	N.A.
激光器，Excelsior One 642 nm 自由空间	Spectra-Physics	N.A.
LightField	Teledyne Princeton Instruments	N.A.
MATLAB 2022b	MathWorks	N.A.
微型盖玻片（盖玻片），24×60 mm No. 1	VWR	48404-455
显微镜智能手机相机适配器	qhma	QHMC017A-S01
尼罗蓝A，纯品	Acros Organics	415690100
氮气，超纯，压缩	特种气体	N.A.
目标，UPLanXApo 100× 油镜 immersion	Olympus	14-910
聚酰亚胺薄膜，Kapton	3M	16089-4
磷酸二氢钾	VWR	P285
恒电位仪，660E	CH Instruments	N.A.
铂丝	Alfa Aesar	10956-BS
扫描电子显微镜，Apreo C SEM	赛默飞世尔科技	N.A.
硅片	Ted Pella	16006
银纳米颗粒（纳米球），NanoXact 0.02 mg/mL，溶于 2 mM 柠檬酸盐	nanoComposix	AGCN60
银颗粒，纯度99.99%	Kurt J. Lesker	EVMAG40EXE-A
载玻片架，洗干两用	Diversified Biotech	WSDR-2000
智能手机，iPhone 13 mini	苹果	N.A.
磷酸氢二钠七水合物	VWR	0348
光谱仪，IsoPlane SCT320	Teledyne Princeton Instruments	N.A.
轻型组织擦拭纸	VWR	82003-820
镊子，KS-04	凯思硬件	N.A.
超声波发生器，sweepSONIK	Blackstone-NEY 超声设备	809379
水超纯化系统，Sartorius Arium mini	赛多利斯	N.A.