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Chemistry

表面増強ラマン散乱分光法および顕微鏡法による単一ナノ粒子の電気化学の追跡

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65486
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

このプロトコルでは、表面増強ラマン散乱分光法とイメージングを使用して、単一ナノ粒子上の電気化学的事象をモニタリングする方法について説明しています。

Abstract

単一ナノ粒子の電気化学反応を研究することは、個々のナノ粒子の不均一性能を理解するために重要です。このナノスケールの不均一性は、ナノ粒子のアンサンブル平均特性評価中に隠されたままです。電気化学的手法は、単一のナノ粒子からの電流を測定するために開発されていますが、電極表面で反応する分子の構造と同一性に関する情報は提供されていません。表面増強ラマン散乱(SERS)顕微鏡や分光法などの光学技術は、個々のナノ粒子の電気化学的事象を検出すると同時に、電極表面種の振動モードに関する情報を提供することができます。この論文では、SERS顕微鏡と分光法を使用して、単一のAgナノ粒子上のナイルブルー(NB)の電気化学的酸化還元を追跡するプロトコルが示されています。まず、平滑で半透明のAg膜上にAgナノ粒子を作製するための詳細なプロトコルについて説明する。光軸に沿って整列した双極プラズモンモードが、単一のAgナノ粒子とAg膜との間に形成される。ナノ粒子と膜の間に固定されたNBからのSERS発光をプラズモンモードに結合し、高角度発光を顕微鏡対物レンズで収集してドーナツ型の発光パターンを形成します。これらのドーナツ型のSERS発光パターンにより、基板上の単一のナノ粒子を明確に識別でき、そこからSERSスペクトルを収集することができます。この研究では、倒立光学顕微鏡と互換性のある電気化学セルにおける作用電極としてSERS基板を採用するための方法が提供される。最後に、個々のAgナノ粒子上のNB分子の電気化学的酸化還元の追跡が示されている。ここで説明するセットアップとプロトコルを変更して、個々のナノ粒子上のさまざまな電気化学反応を研究することができます。

Introduction

電気化学は、電荷移動、電荷貯蔵、物質輸送などを研究するための重要な測定科学であり、生物学、化学、物理学、工学など、さまざまな分野で応用されています1,2,3,4,5,6,7 .従来、電気化学には、分子、結晶ドメイン、ナノ粒子、表面サイトなどの単一のエンティティの大規模なコレクションであるアンサンブルを介した測定が含まれます。しかし、このような単一の実体がアンサンブル平均応答にどのように寄与するかを理解することは、複雑な電気化学的環境における電極表面の不均一性のために、化学および関連分野で新しい基本的および機構的理解をもたらすための鍵となります8,9。例えば、アンサンブル還元は、部位特異的な還元/酸化電位10、中間体およびマイナー触媒生成物11の形成、部位特異的反応速度論12,13、および電荷担体ダイナミクス14,15を明らかにした。アンサンブル平均化を減らすことは、モデルシステムを超えて、広範な異質性がしばしば見られる生物細胞、電気触媒、電池などの応用システムへの理解を深める上で特に重要です16,17,18,19,20,21,22。

過去10年ほどで、単一エンティティ電気化学1,2,9,10,11,12を研究する技術が登場しました。これらの電気化学的測定は、いくつかのシステムにおいて小さな電気およびイオン電流を測定する能力を提供し、新しい基本的な化学的および物理的特性を明らかにした23、24、25、26、27、28。しかしながら、電気化学的測定は、電極表面29、30、31、32における分子または中間体の同一性または構造に関する情報を提供しない。電極-電解質界面の化学情報は、電気化学反応を理解する上で中心的な役割を果たします。界面化学的知識は、典型的には、電気化学を分光法31、32と結合させることによって得られる。ラマン散乱などの振動分光法は、水性溶媒30を主として利用する電気化学システムにおける電荷移動および関連事象に関する補完的な化学情報を提供するのに適している。顕微鏡と組み合わせたラマン散乱分光法は、光の回折限界までの空間分解能を提供します33,34。しかしながら、ナノ粒子および活性表面部位は光学回折限界よりも長さが短いため、回折は限界を提示し、したがって、個々の実体の研究を排除する35。

表面増強ラマン散乱(SERS)は、電気化学反応における界面化学を研究する上で強力なツールであることが実証されています20,30,36,37,38。SERSは、反応分子、溶媒分子、添加剤、および電極の表面化学の振動モードを提供することに加えて、局在型表面プラズモン共鳴として知られる集団表面電子振動をサポートする材料の表面に局在する信号を提供します。プラズモン共鳴の励起は、金属の表面での電磁放射の濃度をもたらし、したがって、表面吸着物への光束および表面吸着物からのラマン散乱の両方を増加させる。AgやAuなどのナノ構造貴金属は、可視光プラズモン共鳴を支持するため、プラズモニック材料として一般的に用いられており、高感度で効率的な電荷結合素子による発光検出に望ましい。SERSの最大の強化はナノ粒子の凝集体によるものですが39,40、個々のナノ粒子からのSERS測定を可能にする新しいSERS基板が開発されました:ギャップモードSERS基板(図1)41,42。ギャップモードSERS基板では、金属ミラーが製造され、分析種でコーティングされています。次に、ナノ粒子を基板上に分散させる。円偏光レーザー光を照射すると、ナノ粒子と基板の結合によって形成される双極プラズモン共鳴が励起され、ナノ粒子単体のSERS測定が可能になります。SERS発光は、光軸に沿って配向された双極プラズモン共鳴43、44、45に結合される。放射する電気双極子と収集光学系の平行な位置合わせにより、高角度の発光のみが収集され、明確なドーナツ型の発光パターン46、47、48、49を形成し、単一のナノ粒子の識別を可能にします。基板上のナノ粒子の凝集体は、光軸50に平行でない放射双極子を含む。この後者の場合、低角および高角度放射が収集され、固体放出パターン46を形成する。

ここでは、ギャップモードSERS基板を作製するためのプロトコルと、SERSを使用して単一のAgナノ粒子上の電気化学的酸化還元イベントをモニターするための作用電極として使用する手順について説明します。重要なことに、ギャップモードSERS基質を使用するプロトコルは、単一ナノ粒子電気化学における現在の方法論にとって重要な課題であるSERSイメージングによる単一ナノ粒子の明確な同定を可能にします。モデルシステムとして、SERSを使用して、スキャンまたは段階電位によって駆動される単一のAgナノ粒子上のナイルブルーA(NB)の電気化学的還元と酸化の読み取り値を提供する方法を示します(つまり、サイクリックボルタンメトリー、クロノアンペロメトリー)。NBは、その電子構造が励起源と共鳴して変調される多プロトン、多電子還元/酸化反応を受け、対応するSERSスペクトル10,51,52にコントラストを提供します。ここで説明するプロトコルは、非共鳴酸化還元活性分子および電気化学的手法にも適用可能であり、電気触媒などの用途に関連する可能性があります。

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Protocol

1. ギャップモードSERS基板作製

  1. No.1カバースリップ( 材料表を参照)は、以下に説明するように、アセトンと水洗浄を使用して清掃します。クリーンルームでこの手順を実行して、破片やその他の不要な物質がカバーガラスに堆積しないようにします。
    1. カバーガラスをスライドラックに置きます。カバーガラス/基板を移動するときはピンセットを使用してください。スライドラックをガラス容器に入れ、アセトンで満たします。
      注意: アセトンは非常に可燃性であり、健康に悪影響を与える可能性があります。手袋、ゴーグル、マスクを使用して換気の良い場所で取り扱ってください。
    2. 超音波発生器の電力制御を8に調整し、スライドラックでガラス容器を15分間超音波処理します。
    3. スライドラックを容器から取り出し、スライドラックとカバーガラスを超純水(抵抗率18.2MΩ・cm)で十分にすすいでください。
    4. カバーガラス付きのスライドラックをガラス容器に入れ、超純水を入れます。同じ設定を使用して、スライドラックでガラス容器をさらに15分間超音波処理します。
    5. スライドラックを容器から取り出し、スライドラックとカバーガラスを超純水で十分に洗浄します。
    6. スプレーガンを使用して、高純度のN2 ガスの流れでカバーガラスを乾燥させます。
  2. クリーニングしたカバーガラスにCuとAgを堆積させます。これを行うには、公式のユーザーマニュアルで製造元が推奨しているように、標準的な手順に従って電子ビーム薄膜堆積システムを使用します。
    注意: その他の寄託については、施設53で提供されているように、製造元の指示に従ってください。
    1. プラテンの位置を180°に設定し、真空チャンバーを通気します。
    2. きれいなカバースリップを機器のプラテンに並べて配置し、重ならないようにします。耐熱粘着テープ(ポリイミドフィルム)を使用して、カバーガラスをプラテンに貼り付けます。
      注意: これにより、手順中にカバーガラスが移動したり落下したりすることがなくなります。
    3. 黒鉛るつぼの半分にCuペレットを充填し、るつぼホルダーに挿入します。2番目のるつぼのAgについても同じことを行います。真空チャンバーを閉じて、ポンプダウンを開始します。推奨される堆積圧力は10−7〜10−6Torr のオーダーです。
    4. Cu特性をセンサーのアプリケーションにロードします。プラテンの回転を20RPMでオンにします。プラテンの位置を225°に設定します。
      注意: これにより、電子ビームがビューポートから見えるようにミラーがプラテンの底に配置されます。
    5. 電子ビーム電源へのブレーカーをオンにし、少なくとも2分間待ちます。電子ビームをオンにして、さらに2分間待ちます。基板シャッターを開きます。
      注意: これにより、ビームとるつぼが鏡を通して見えるようになります。
    6. センサーが10 Å/sに近い堆積速度を読み取るまで、徐々に(約10 mA/minで)放射電流を増やします。シャッターを閉じ、プラテン位置を0°に設定します。
      注意: このプロセス中にビームの形状が変わる場合があります。このステップでは定期的にチェックし、それぞれのノブを使用して位置、振幅、周波数を修正することが重要です。ビームはるつぼの内容物を均一に加熱していなければなりません。この時点でシャッターを閉じると、プラテンが回転してカバースリップが蒸発した金属の経路に配置されるときに、サンプルに金属が堆積することはありません。
    7. シャッターを開いて堆積を開始し、センサーに表示される厚さを監視します。蒸着センサーによって決定されたように、所望の厚さ(Cuの場合は1nm)に達したらシャッターを閉じます。
    8. センサーが0 A近くを読み取るまで電子ビームの電流を徐々に減らしますが、電流はるつぼが見えるほど十分に高くなります。
    9. プラテンの位置を225°に設定し、シャッターを開いてるつぼが見えるようにします。
    10. ノブを使用してるつぼホルダーを回転させ、ビームがAgペレットでるつぼに向けられるようにします。
    11. Ag プロパティをセンサーのアプリケーションに読み込みます。手順1.2.6〜1.2.7を繰り返しますが、Agには20 Å / sの堆積速度と25nmの厚さを使用します。
    12. 電流を徐々に0Aに減らし、電子ビームとブレーカーをオフにします。プラテンの位置を180°に設定し、真空チャンバーを通気します。真空チャンバーを開きます。
    13. カバーガラスは、以前と同じ場所に、異物やほこりの粒子がなく、鏡の外観である必要があります。耐熱粘着テープをゆっくりと慎重にはがします。
      注意: プラテンの表面と平行にテープを引き戻します。カバーガラスを壊す危険があります。フィルムは均質で部分的に透明でなければなりません( 図2Aを参照)。
  3. 以下に説明するように、Ag薄膜をナイルブルー溶液でインキュベートします。
    1. 500 μLの50 μM NB溶液をAg薄膜の表面に加えます。
    2. 15分後、Ag薄膜を超純水で十分にすすぎ、弱く吸着したNB分子を除去します。Ag薄膜をN2 ガスで乾燥させる。
    3. NBインキュベートしたAg薄膜上にAgナノ粒子をドロップキャストします。NB溶液をドロップキャストしてインキュベートしたAg薄膜の同じ領域に、Agナノ粒子コロイドの100倍希釈液500 μLを加えます。
      注意: 金属ナノ粒子は人体に有毒です。手袋とゴーグルを使用して、換気の良い場所で取り扱ってください。
    4. 20分後、(ギャップモードSERS)基板を超純水ですすいでください。基板をN2 ガスで乾燥させます。

2. ギャップモードSERS基板の特性評価

  1. 紫外可視分光法
    1. 電源ボタンを押して機器の電源を入れます。デスクトップ上のショートカットをダブルクリックして、スキャンソフトウェアを起動します。
    2. [セットアップ]をクリックして、 セットアップ ウィンドウを開きます。 Yモードで、 モード ドロップダウンメニューをクリックし、 %T を選択して透過率を測定します。 X モードで、 800 nm から 200 nm までスキャンするために 開始 を 800 に そして 停止 を 200 に変更して下さい。
    3. [ベースライン ] タブで、[ ベースライン補正 ]ラジオボタンを選択し、設定ウィンドウを閉じます。[ ベースライン ]をクリックして、大気でバックグラウンド補正を実行します。
    4. サンプル・コンパートメントを開きます。Agフィルムの一端を、ビームの経路に垂直にサンプルホルダーにテープで留めます。
    5. 開始をクリックして、サンプルから透過率スペクトルを取得します。
  2. 原子間力顕微鏡(AFM)測定
    1. AFMをコンピュータに接続し(USBポートを使用)、AFM機器の電源を入れて、Nanosurf Easyscan 2を起動します。
    2. AFMヘッド(AFMカンチレバーが下側に付いている)をサンプルステージからそっと取り外し、逆さまに置きます。
    3. Ag薄膜基板をテープで試料ステージに固定します。AFMヘッドをサンプルステージの上に置きます。AFMヘッドがサンプルステージと平行であることを確認してください(レベルインジケーター付きのモニター)。AFMヘッドとサンプルステージが水平でない場合は、レベリングネジを使用してステージを調整し、レベリングバブルをレベルインジケーターの中央に配置します。
    4. ソフトウェアの側面図と上面図を使用して、サンプルステージをAFMヘッド(AFMカンチレバー)にできるだけ近づけて、接触しないように静かに動かします。サンプルステージがAFMヘッドのAFMカンチレバーに触れていないことを確認してください。
    5. [ 取り込み ]タブで、イメージングモードとして [位相コントラスト ]を選択し、カンチレバータイプとして [PPP-XYNCHR ]を選択します。 Laser Align をクリックして、レーザーがカンチレバー先端に集束され、先端から反射されたビームがフォトダイオード検出器の中心に当たるようにします。
    6. 周波数 スイープ ボタンをクリックしてAFMソフトウェアでカンチレバーの共振振動周波数を測定し、周波数曲線がベル型であることを確認します。 アプローチをクリックして、カンチレバーの先端をAg薄膜の表面に着地させます。
    7. イメージングウィザードで、 イメージングサイズ を10.8 μm x 10.8 μm、スキャン速度を0.5 s/ラインに選択します。Zコントローラで、 50 %のセットポイント、2,500の Pゲイン 、および2,500の Iゲイン を使用します。 [モード プロパティ]で、300 mV の自由振動振幅 を使用します。
    8. [ 開始 ]をクリックして画像を取得します。画像を右クリックして保存し、[ コピー]を選択して、画像プロセッサに貼り付けます。
    9. AFMソフトウェアで、処理する画像をクリックして選択します。[解析]タブで、[線の粗さを計算]と[面積を計算]をクリックして、面積解析と線粗さ解析を実行します。
    10. Withdrawをクリックして、カンチレバーチップをAg薄膜表面から引き出します。側面図と上面図を使用して動きを監視し、サンプルステージを先端から離します。サンプルを削除します。
  3. 走査型電子顕微鏡(SEM)測定54
    1. 受け取った状態のAgナノ粒子コロイド30 μLをSiウェーハ上にドロップキャストし、完全に風乾させます。Siウェーハを両面導電性テープでサンプルスタブに固定します。
    2. 機器のユーザーインターフェイスを使用してSEMチャンバーを通気します。SEMチャンバーをスライドさせて開き、ステージの穴の1つにスタブを取り付けます。
    3. SEMチャンバーを閉じ、機器のユーザーインターフェイスを使用してSEMチャンバーをポンプダウンします。
    4. サンプルを電子ビームガンから約10mm離して配置します。機器のユーザーインターフェイスを使用して電子ビームをオンにします。
    5. スポットサイズ6、ビーム電流25pA、高電圧5kVのエバーハートソーンリー検出器を使用してサンプルを画像化します。
    6. 電子銃の関心領域をダブルクリックすると、電子ビームが自動的に位置合わせされます。機器のユーザーインターフェースを使用して、3,500倍の倍率でイメージングを実行します(図3A)。
    7. イメージングが完了したら、電子ビームをオフにし、サンプルを電子ビームガンから少なくとも20 mm離します。
    8. SEMチャンバーを通気します。SEMチャンバーをスライドさせて開き、サンプルスタブをステージから取り出します。SEMチャンバーを閉じ、機器のユーザーインターフェイスを使用してポンプダウンします。

3.電気化学セルの準備

  1. 以下に説明するように、ガラス管カッターでガラス管を切断することにより、長さ5cmのガラスウェルを得る。
    1. ガラス管カッターのチェーンを管に巻き付けます。チェーンの最後のセグメントをツールの反対側に取り付けます。
    2. 片手でツールのハンドルを持ちます。もう一方の手で、ガラス管を持ちます。チェーン内のホイールがガラスの切断を開始するように、ガラス管を連続的に回転させます。
    3. ハンドルに徐々に力を加えて、ツールをそっと握ります。音が滑りから引っかき傷に変わるとき、それはガラス片(井戸)がガラス管から分離しようとしているときです。
    4. ガラスの壊れた端を120グリット(または粗い)のサンドペーパーでよく滑らかにします。220グリット(またはより細かい)のサンドペーパーで磨きます。
  2. 以下に説明するように、ダイヤモンドスクライブでギャップモード基板を切り取ります。
    1. ギャップモード基板を平らな面に置きます。ダイヤモンドスクライブをギャップモード基板の中央で上下に動かし、基板の表面に軽い圧力をかけます。
    2. 傷が見えたら、手動で素材を2つに分割します。
  3. 以下に説明するように、カットしたガラスウェル(手順3.1から)を基板の表面に取り付けます。
    1. 2液性エポキシ樹脂をアルミホイルの小さなシートにディスペンスします。攪拌スティックまたはピペットチップを使用して製品を混合します。
    2. 混合物をガラスの底縁によく塗ります。セルの内側への樹脂の広がりを最小限に抑えるために、カットガラスの縁をよく覆うために、可能な限り最小限の混合物を塗布します。
    3. ガラスをギャップモード基板の表面にしっかりと接着します。残りの混合生成物をウェルの外側、それが基板と出会う場所に塗布して、ガラスウェルの内側に注がれた溶液の漏れの可能性を排除します( 図4Aを参照)。
    4. エポキシを5分間邪魔されずに硬化させます。
  4. 以下に説明するように、電気接続をギャップモードSERS基板に取り付けます。
    1. 長さ5 cmの銅線を入手してください。2液性導電性エポキシ樹脂をアルミホイルの小さなシートに塗布します。銅線を使用して製品成分を混合します。
    2. ワイヤを基板の表面に取り付けます(ウェルの外側ですが、導電性Ag薄膜に取り付けられています; 図4Aを参照)。導電性エポキシを推奨時間邪魔されずに硬化させます。
      注:Agフィルム基板の熱アニールを最小限に抑えるために、導電性エポキシを室温で硬化させることをお勧めします。

4. バルクサイクリックボルタンメトリー測定

  1. 10 mLの0.5 mM NBおよび0.1 Mリン酸バッファー(pH = 5)を20 mLビーカーに加えます。機械的に研磨されたAgディスク電極、Ptワイヤ、およびAg/AgCl(3 M KCl)電極を電解液に挿入します。
  2. 各電極をそれぞれのポテンショスタットクリップ(ポテンショスタットの製造元が決定)に取り付けます。電極が互いに接触していないことを確認してください。
  3. 0〜−0.6Vのサイクリックボルタンメトリー(CV)を50mV/sのスキャンレートで実行します。

5. 単一ナノ粒子電気化学SERS顕微鏡および分光測定

  1. ギャップモードSERS基板を用いて作製した電気化学セルを倒立光学顕微鏡のステージ上に置く。
  2. 基板の端を顕微鏡ステージにテープで固定して、セルをポテンショスタットに接続するワイヤの張力によって分光電気化学測定中に動かないようにします( 図4Bを参照)。
  3. Ag/AgCl(3 M KCl)参照電極を自作スタンドに入れ、電極ホルダースタンドのネジを締めてその位置を固定します。
  4. 参照電極をポテンショスタットの参照電極ワニ口クリップ(白色)にクリップします。Ptワイヤーの対電極をポテンショスタットの対電極ワニ口クリップ(赤色)にクリップします。Agフィルムに取り付けられたCu線をポテンショスタットの作用電極ワニ口クリップ(緑色)にクリップします。
  5. ワニ口クリップと一緒にPtワイヤーを電極ホルダーに挿入し、ネジを締めてその位置を固定します。
  6. 電極ホルダーを電気化学セルの上に置き、電極をセルに挿入します。電極がAg膜に触れないように注意してください。これは短絡を形成するだけでなく、フィルムを損傷します。
  7. 分光器とEMCCDカメラの電源を入れ、「ライトフィールド」ソフトウェアを起動します。
  8. 642 nmレーザーをオンにし、レーザーを500 μWの出力に調整します。
    注意: レーザー光にさらされると、目や皮膚に永久的な損傷を与える可能性があります。お住まいの国/地域の関連する公式規制機関の安全ガイドラインを参照し、それに従ってください。
  9. 対物レンズに液浸オイルを一滴加えます。フォーカスノブを動かして、オイルが基板の底部に接触するまで対物レンズを慎重に持ち上げます。
    注意: セルはテープで固定されているため、対物レンズを基板に押し付けると、セルが破損したり、対物レンズが損傷したりする可能性があります。
  10. レーザーをギャップモードSERS基板の表面に集束させます。ギャップモードSERS基板(ガラスウェルで覆われている)をスキャンし、顕微鏡ステージを移動して孤立したドーナツ型のNB SERS発光パターンを検索します( 図5Aを参照)。
    注:NBの濃度が低いほど、ドーナツ型の発光パターンを見つけるのは難しくなりますが、最終的にドーナツ型の発光パターンが分離される可能性が高くなります。コーヒーリングは開始するのに適した場所であり、ギャップモードSERS基板上のNBおよびAgナノ粒子インキュベーション領域に対して内側に移動することができます。カメラ(次のステップを参照)は、ギャップモードSERS基板の周囲をスキャンするときに人間の目よりも光に敏感であるため、このプロセスに役立ちます。
  11. 顕微鏡の電話アダプターに電話を取り付けます。電話のカメラをアダプターのレンズに合わせるには、電話のカメラ アプリケーションをオンにし、レンズが透けて見えるようにデバイスの位置を変更します。
  12. 顕微鏡の接眼レンズの1つを取り外し、アダプターをその場所に挿入します。カメラアプリケーションで、モードをビデオに変更し、可能な限りズームインします。ドーナツ型の発光パターンがはっきりと見えます。
  13. ドーナツ型の発光パターンがはっきりと特定されたら、顕微鏡の光ダイバータレバーを動かして、放出された光を分光器に向けます。
  14. LightField の [実験] タブで、[一般的な取り込み設定] をクリックし、[露出時間] を 0.1 秒に、[保存するフレーム] を 50 秒に調整します。[データのエクスポート]で[集録データのエクスポート]を選択し、[ファイルの種類]を[CSV(.csv)]に変更します。
  15. [ 関心領域] で、[ カスタム関心領域] ラジオ ボタンを選択します。[ ROIの編集]をクリックし、新しいウィンドウで、X、Y、W、Hの値を変更して、ドーナツ型の放出の周りに25ピクセルx25ピクセルのROIを作成します。
  16. 分光計で、600 g/mm、750 nmのブレイズグレーティングを選択します。[中心波長] を 642 nm に変更します。[取得]をクリックして測定を開始します。
  17. 取得が完了したら、[データ] タブに移動します。最後に実行した実験を開き、[プロセス]、[フレームの組み合わせ] の順にクリックします。
  18. 複合スペクトルで、最高強度が観測されるレーザー波長に注意してください。
  19. 実験に戻り、[分光計] で [nm] をクリックします。ポップアップウィンドウで、測定モードを相対波数に変更し、測定されたレーザー波長をボックスに入力します。ストークスシフトしたラマン散乱を約400/cmから1,600/cmに検出するには、グレーティングの位置を1,000/cmに変更します。
  20. 0.1秒の露光時間を使用して、少なくとも50フレームのNB SERSスペクトルを収集して合計します( 図5Cを参照)。592/cmに強いピークを探して、NBからの放出であることを確認します( 図5Cを参照)52。ドーナツ型の発光パターンに隣接する領域(発光のない領域)のSERSスペクトルを取り、バックグラウンド信号を補正します。
  21. レーザー光をドーナツ型の発光パターンに合わせたまま、5 mLの調整可能なピペットを使用して、3 mLの0.1 Mリン酸緩衝溶液(pH = 5)を電気化学セルに追加します。
    注:電解質溶液を添加すると、光軸から外れた単一ナノ粒子の双極子モードが電解質分子と溶媒分子のSERSスペクトルを放射するため、ドーナツ型の発光パターンが消え、固体の発光パターンが現れることがあります。
  22. 必要に応じて焦点を合わせ直し、レーザー光がまだ発光パターンに焦点を合わせていることを確認します。
  23. ポテンショスタットのソフトウェアで、Ag/AgCl(3 M KCl)に対して0〜-0.6 Vの少なくとも3サイクル、スキャンレート50 mV/sのサイクリックボルタモグラム実験を準備します。スペクトルと電気化学のデータ収集を同期させるには、分光器のスペクトル取得によってトリガーされるようにポテンショスタットを構成します。
  24. CV と SERS の実験を同時に実行します。NB SERSスペクトルは、ギャップモードSERS基板に印加される電位によって変調する必要があります ( 図6Bを参照)。
  25. ライトが電話のカメラに向けられるようにライトダイバータレバーを動かします。ビデオの録画を開始し、説明に従って CV 実験を実行します。SERS画像強度は、ギャップモードSERS基板に印加される電位に従って変調する必要があります(図 6Aの挿入図を参照)。

6. イメージング解析

  1. 収集した画像を処理して、以下で説明するようにシャープネスとコントラストを向上させます。
    注: 画像処理は Python の OpenCV ライブラリを使用して実行され、スクリプトは GitHub (github.com/jvhemmer/jove_specsers) で入手できます。
    1. 画像をトリミングして空白の大部分を削除し、発光パターンを中心に配置します。
    2. フレームの緑と青のチャンネルを削除します。フレームのガウスぼかしマスクを差し引いてシャープネスを上げます。
    3. 昇電演算子によるダイナミックレンジの拡大によりコントラストを高めます。
  2. 以下で説明するように、ImageJ を使用して画像に縮尺記号を追加します。
    1. 電話のカメラ アダプターを使用して、顕微鏡キャリブレーション スライドなど、既知の寸法のオブジェクトを画像化します。
    2. ImageJ を使用して、収集した画像を読み込みます。既知の寸法でイメージされたオブジェクトの領域にセグメントを描画します。
    3. スケール設定機能を使用して、描画されたセグメントの長さに基づいてスケール(つまり、単位距離あたりのピクセル数)を設定します。[縮尺] ツールを使用して縮尺を追加します。

7. ナノ粒子サイズ分析

  1. SEM画像をイメージJに読み込みます。計器付属のスケールバーにセグメントを描画し、 スケールを設定機能を使用して 設定します。
  2. [16 ビット] > [画像] > [タイプ] に移動します。画像>自動しきい値>調整に移動します。ドロップダウン メニューから [既定] を選択します。
  3. [矩形] ツールを使用して、単一のナノ粒子ではないフィーチャを選択して削除します。
  4. パーティクルの分析ツールを使用します。円形を仮定して、得られた面積で粒子の直径を計算します。

8. 分光電気化学データ解析

  1. 収集したスペクトルデータに対してバックグラウンド補正を実行します。MATLABでデータ処理とプロットを実行します。スクリプトは、前述のものと同じ GitHub リポジトリで入手できます。
  2. 3つの異なるバックグラウンド実験からのスペクトルデータ(SERS発光パターンと一緒に収集されたスペクトルデータ)を平均します。サンプルのスペクトルから平均バックグラウンドスペクトルを引きます。
  3. 0から実験の合計時間(サイクリックボルタンメトリー)までの時間配列を作成し、間隔は露光時間、EMCCD読み出し時間、シャッター開閉時間の合計です。
  4. レーザー波長を使用して波長測定値をラマンシフトに変換します。
  5. MATLAB のメッシュ関数を使用してウォーターフォールプロットを生成します (X はラマンシフト、Y は時間、Z は強度)。

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Representative Results

図2A は、電子線金属蒸着システムを用いて作製したAg薄膜基板を示す。 図2A に示す「良好な」基板は、ガラスカバーガラス上のAg金属の均一な被覆率を有するが、「不良」基板はAgの不均一な被覆を有する。「良好な」Ag薄膜の紫外可視スペクトルを 図2Bに示しており、これは膜が電磁スペクトルの可視部分に対して部分的に透明であることを示しています。「良好な」Ag薄膜基板は、現在のプロトコルで分光電気化学実験に使用される642nmのレーザー光に対して34%の光透過性を有する。 図2C は、「良好な」基板の10.8 μm x 10.8 μmの領域の代表的なAFM画像を示しています。代表領域の二乗平均平方根粗さ値は0.7nmであり、Ag薄膜が原子レベルで平滑であることを示している。Ag薄膜基板の高さの変化は、 図2Dに示すラインプロファイルによって表され、膜の均一性と平滑性をさらに実証しています。

図3A は、Siウェハ上にドロップキャストおよび風乾されたAgナノ粒子の代表的なSEM画像を示す。243個のナノ粒子の分析から、このプロトコルで使用されたAgナノ粒子の平均直径は79.2nm±8.4nmであった。異なるサイズのAuまたはAgナノ粒子も使用することができることに留意されたい55。さらに、このプロトコルは高度に単分散のナノ粒子を使用しますが、このプロトコルは単一のナノ粒子の測定を可能にするため、分散性の要件はありません。ギャップモードSERS基板を構築するために、この研究では、Agナノ粒子を、NBで以前にインキュベートしたAg薄膜基板の表面に堆積させました(図3B)。

ギャップモードSERS基板を作用電極として使用して、 図4Aに示すように電気化学セルを構築しました。電気化学セルを顕微鏡ステージに固定化し、 図4Bに示すようにポテンショスタットに接続しました。電気化学セルを倒立光学顕微鏡に取り付けた状態で、642 nmのレーザーを落射照明形状のギャップモードSERS基板作用電極に集束させました。空気中のAg薄膜上の個々のAgナノ粒子は、 図5Aに示すように、ドーナツ型の発光パターンによって明確に識別することができる。これらのドーナツ状の発光パターンは、個々のAgナノ粒子49を識別するためのシグネチャとして確実に使用することができる。複数のナノ粒子(二量体、三量体、または多量体)が照明体積中に存在する場合、 図5Bに示すように、固体発光パターンが観察される。電解液の導入に際し、ドーナツ状の発光パターンは、典型的には、固体の発光パターンに変換される。この理由は、単一のナノ粒子内の双極プラズモンモード(光軸と整列していない)が溶媒および電解質分子からの発光を全方向に放射するためである。したがって、発光パターンは、ナノ粒子・基板間隙からの高角NB SERS発光と電解質および溶媒分子からの低角度SERS発光との重ね合わせである。電解液を除去すると、ドーナツ状の発光パターンが回復します。このプロトコルでは、SERSイメージングによる単一ナノ粒子の同定に続いて、SERS分光法を使用して酸化還元プローブ分子を同定する。図 5C のSERSスペクトルは、 図5Aに示すドーナツ型の発光パターンに対応しています。振動モードは、NB分子のフィンガープリントを表します。

図6A は、Agディスク作用電極およびPtワイヤ対極を用いて得られたリン酸緩衝液(pH=5)中のNBの代表的なサイクリックボルタモグラムを示す。単一ナノ粒子の分光電気化学測定の前にサイクリックボルタモグラムを取得し、プローブ分子(この場合はNB)のアンサンブル酸化還元挙動を理解します。この研究では、印加電位を0 Vから-0.6 Vに掃引すると、Ag/AgCl(3 M KCl)に対して-0.27 Vに陰極ピークが観察されました。電位を0Vに戻すと、−0.21Vに陽極ピークが観察されました。 図6Bに示すように、同じ印加電位範囲を分光電気化学測定に使用しました。ドーナツ状の発光パターンを示す単一のAgナノ粒子を同定した後、電解質溶液を電気化学セルにピペットで入れた。次に、レーザー照明下で、印加電位が50 mV/sのスキャン速度で0〜-0.6 Vの間で掃引されるにつれて、SERSスペクトルを連続的に収集しました(図6B)。Agナノ粒子とAg膜の間のギャップ内およびその周辺のNB分子は電気化学的に減少し(オフ状態)、SERSスペクトルのウォーターフォールプロット(図 6Aの挿入図)に示すようにSERS強度が減少しました。印加電位が−0.6Vから0Vに掃引されると、NB分子が電気化学的に酸化される(オン状態)ため、SERS強度が増加した。SERS信号の変調は、単一のナノ粒子上のNBの還元電位と酸化電位を決定する方法を表しています。他の電気化学的手法をボルタンメトリーの代わりにして、酸化還元反応をさらに特徴付けることができます。 図7A は、作用電極の電位を−0.4VにステップしたときのNBからのSERS応答を示しています(すなわち、クロノアンペロメトリー)。電極電位を-0.4Vにステップすると、NBの減少によりSERS信号が減衰しました。この分光電気化学的手法により、酸化還元反応の過渡挙動を単一ナノ粒子レベルで調査することができます。 図7B は、592/cmのピークの下の領域の減衰によって証明されるように、加えられた電気バイアスの大きさによって還元速度がどのように変化したかを示しています。興味深いことに、正規化された領域の急激な変動は、確率的事象がこのスケールでどのように大きな役割を果たすかを示しています。従来のボルタンメトリーとクロノアンペロメトリーで実証されているように、この記事で説明されているプロトコルにより、研究者は単一のナノ粒子上で電気化学的に還元または酸化される分子の振動モードを追跡できます。さらに、単一ナノ粒子表面の分子の振動解析は、化学的ステップと電気化学的ステップを区別することを可能にし、反応機構の研究に役立ちます。

Figure 1
図1:ギャップモードSERS基板。 金属ミラー上に個々の金属ナノ粒子を配置して作製したギャップモード基板の概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:Ag薄膜基板の特性評価。 (A)電子ビーム金属蒸着装置により作製したAg薄膜基板の良品と不良品のデジタル写真。(b)紫外可視透過率が良好な基板のスペクトル。(C)良好な基板の代表的な10.8 μm x 10.8 μmの領域のAFM画像。(D)(C)に示す黒破線で示すAFM画像のラインプロファイル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:Agナノ粒子の特性評価。 (A)水性Agナノ粒子コロイドドロップキャストおよびSiウェハ上で風乾したSEM画像。ナノ粒子の平均直径は79.2nmであり、標準偏差は8.4nmである。(b)ギャップモードSERS基板の模式図。青い星はNB分子を表しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:分光電気化学セルの作製 。 (a)作用極としてギャップモードSERS基板を用いて作製した代表的な分光電気化学セル。(B)単一ナノ粒子電気化学分光および顕微鏡実験用の倒立型光学顕微鏡ステージに固定化された分光電気化学セル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:Ag薄膜基板上の単一のAgナノ粒子の同定 。 (a)ドーナツ状のNB SERS発光パターンであって、シグナルが個々のAgナノ粒子に由来することを示す。(B)固体NB SERS発光パターンであって、シグナルが複数のナノ粒子に由来することを示す。(C)(A)に示すドーナツ型発光のSERSスペクトルを、NB52のリング変形振動モードから592/cmに特徴的なピークを示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:NBの電気化学と分光電気化学 。 (A)Agディスク作用電極を使用した0.1 Mリン酸緩衝液(pH = 5)中の0.5 mM NBのサイクリックボルタモグラム。挿入図は、NB酸化(下の画像)および還元(上の画像)電位におけるギャップモードSERS基板上の個々のAgナノ粒子上のNBの電気化学的SERS画像を示しています。スケールバーは300nmを表す。(B)ギャップモードSERS基板上の単一のAgナノ粒子上でのサイクリックボルタンメトリーによるNB SERSスペクトルの電気化学的変調。PtワイヤとAg/AgCl(3 M KCl)電極をそれぞれ対電極と参照電極として使用しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:NBの電位ステップ分光電気化学 。 (A)t = 0(破線)で適用された0から-0.4 V(対Ag/AgCl)の電位ステップによるNB SERSスペクトルの電気化学的変調。592/cmのピークの強度は、Agナノ粒子近傍のNB分子の減少により時間とともに減少する。(B)印加電位の関数としての592/cmピーク下の正規化領域の過渡プロファイル:−0.2V(青い曲線)、−0.4V(緑の曲線)、および−0.6V(赤い曲線)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

CuおよびAg薄膜の金属膜をきれいなカバーガラスに堆積させることは、最終的な膜の粗さが2〜4原子層以下(または約0.7nm以下の二乗平均平方根粗さ)であることを保証するために不可欠です。金属蒸着前のカバーガラスに存在するほこり、引っかき傷、破片は、ドーナツ型の発光パターンを生成するために必要な滑らかなフィルムの製造を妨げる一般的な問題です。したがって、金属堆積の前に異なる溶媒でカバーガラスを超音波処理し、可能であれば、クリーンルームでこのプロセスを実行することをお勧めします。さらに、堆積手順には細心の注意を払う必要があります。真空チャンバー内のすべての表面(るつぼホルダー引き出しを含む)とるつぼは、ほこりや破片が蓄積する傾向があるため、これらの表面を清掃する必要がある場合があります。

金属堆積プロセス中に使用される高い堆積速度は、堆積膜を原子的に滑らかにすることを可能にするが、制御がより困難であり得る。膜厚センサーの読み取りを誤ると、不均一、過度に厚い、または過度に薄いフィルムが発生する可能性があります。金属膜が薄すぎると、連続面の代わりに材料の島が堆積する可能性があります。膜が厚すぎると基板が不透明になり、励起光がNB分子を効率的に励起するのを妨げ、発光光の収集が妨げられます。これにより、メソッドの全体的な感度が低下し、S/N比の低い低品質のSERS画像とスペクトルが得られます。Agの前にCuを堆積させることは、後者の金属の接着にとって重要ですが、過剰なCuを堆積させると基板の光透過性が低下し、Cuの量が不十分な場合はガラスカバーガラスからのAgの層間剥離につながります。さらに、サンプルプラテンの寸法がシャッターの寸法よりも大きい場合、 図2Aに示すように、シャッターが閉じている間に蒸発した金属がカバーガラスに堆積し、基板の不均一性が生じる可能性があります。

NB溶液とAgナノ粒子懸濁液の濃度とインキュベーション時間は、高品質のギャップモードSERS基質を製造する上で重要な役割を果たします。プロトコルで推奨されている濃度よりも高い濃度のNB溶液の使用、またはより長いインキュベーション時間の使用は、高いバックグラウンドシグナルにつながる可能性があり、したがって、個々のAgナノ粒子の位置を特定する上で課題をもたらす可能性があります。一方、NB溶液濃度が低く、インキュベーション時間が短いと、Ag薄膜上のNB分子の被覆率が低くなり、単一のAgナノ粒子の同定に時間がかかります。同様に、プロトコルで推奨されているよりも高い濃度のAgナノ粒子懸濁液の使用、またはより長いインキュベーション時間の使用は、Ag薄膜上のAgナノ粒子の凝集につながります。したがって、この凝集は、高い割合の固体発光パターンを生成するSERS基質と、単一のナノ粒子として識別できる基質部位の数の減少につながります。対照的に、低濃度のAgナノ粒子懸濁液またはより短いインキュベーション時間の使用は、Agナノ粒子の被覆率の低下につながる。この場合、SERSの発光パターンの大部分は単一のAgナノ粒子に由来するが、実験のスループットは低下する。

この論文で説明した単一ナノ粒子電気化学SERSイメージングおよび分光法技術の実装を成功させるには、分光電気化学実験のセットアップに特別な注意を払う必要があります。第一に、ドーナツ型の発光パターンを用いたギャップモードSERS基板上の単一のAgナノ粒子の同定は、記載された方法の使用を成功させるための中心である。ドーナツ型の発光パターンを観察するには、通常、光学画像の倍率が100倍を超え、開口数が高い顕微鏡対物レンズ(1.45など)が必要です。高い開口数は、高角度の放射を収集するために特に重要です。第二に、SERSスペクトルの収集を電気化学プログラムと同期させることが重要です。このプロトコルでは、トランジスタ-トランジスタ論理パルスが分光器検出器からポテンショスタットに送信され、SERSスペクトルと電気化学データの同時収集がトリガーされます。さらに、検出器の読み出し時間は、印加電位をボルタンメトリーにおけるSERSスペクトルと正確に相関させるために考慮する必要があります。

振動モードの解釈は、SERS分光法の重要な要素です。Agは酸化物を形成する傾向があり、これは研究中の電気化学的プロセスに影響を与える可能性があります56。このプロトコルではSERSによって酸化物層は検出されませんでしたが、長時間の空気曝露または酸化電位により、Agミラーおよび/またはナノ粒子上に酸化物が形成されます。酸化物層は、酸化還元活性分子の吸着を変化させ、振動モードの変化を誘発する可能性があります。現在のプロトコルでは、Siに吸着したNB分子、Ag膜、またはAgナノ粒子間の振動モードの変化は観察されませんでした。また、ギャップモード基板のようなプラズモン共鳴の励起は、酸化還元反応に関与することができる非平衡ホット電子とホットホールの生成をもたらすことにも注目しています57,58,59,60。光誘起の高温電荷キャリアからの干渉を最小限に抑えるために、低光フルエンスが推奨されます。

ここで説明する技術は、衝突ベースの電気化学61、62、63、走査型電気化学顕微鏡64、65、66、および走査型電気化学細胞顕微鏡67、68、69などの他の単一ナノ粒子技術の限界に対処することができる.これらの電気化学的手法を使用して、単一ナノ粒子の電気化学的応答を測定することが可能です。しかしながら、反応物、中間体、および生成物の同一性および構造情報を直接得ることはできない。このプロトコルに記載されている技術は、単一のナノ粒子上の電気化学反応を追跡し、振動分光法を通じて化学情報を得ることを可能にする。ただし、このギャップモードSERS電気化学的方法は、可視光励起下で最もSERS活性な金属であるAgおよびAuを使用してSERS基板を調製した場合に最良の結果が得られます。これにより、技術に採用できる金属の選択が制限される可能性があります。さらに、ギャップモードSERSは、単一のナノ粒子上で発生する電気化学プロセスに関する化学情報を提供しますが、電流応答が基板全体で測定されるため、アンサンブル平均化された電気化学情報のみが得られます。それにもかかわらず、この論文で示された技術は、エネルギー貯蔵70,71、化学原料合成72,73、およびセンサー74,75にとって重要な電気触媒反応の分野を含む、電気化学のさまざまな分野で基本的な機構知識を得るために使用できる強力なツールです。

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Disclosures

著者は、競合する経済的利益がないことを宣言しています。

Acknowledgments

この作業は、ルイビル大学からのスタートアップ資金と、ラルフE.パウジュニアファカルティエンハンスメントアワードを通じたオークリッジ関連大学からの資金提供によってサポートされました。著者らは、 図1の画像を作成したチョ・キヒョン博士に感謝する。金属蒸着とSEMは、ルイビル大学のマイクロ/ナノテクノロジーセンターで実施されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone, microelectronic grade J. T. Baker 9005-05
Adjustable pipette, Eppendorf Reference 2 5000 mL Eppendorf 4924000100
Analytical Balance, AB54-S/FACT Metter Toledo N.A.
Atomic Force Microscope, Easy scan 2 Nanosurf N.A.
AXXIS Electron Beam Thin Film Deposition System Kurt J. Lesker N.A.
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer Agilent N.A.
Conductive epoxy, two part Electron Microscopy Sciences 12642-14
Copper pellets, 99.99% pure Kurt J. Lesker EVMCU40EXE
Copper wire, bare, 18 AWG VWR 66248-040
Crucible, Graphite E-Beam Kurt J. Lesker EVCEB-23
Diamond Scriber Ted Pella 54484
EMCCD Camera, ProEM HS: 1024BX3 Teledyne Princeton Instruments N.A.
Epoxy, Clear Gorilla Glue N.A.
Glass Tube Cutter Wheeler-Rex 69012
Glass Tube, Borossilicate (OD 0.75", ID 0.62", L 12") McMaster-Carr 8729K45
Immersion oil, Type-F Olympus IMMOIL-F30CC
Inverted Microscope, IX73 Olympus N.A.
Laser, Excelsior One 642 nm Free space Spectra-Physics N.A.
LightField Teledyne Princeton Instruments N.A.
MATLAB 2022b MathWorks N.A.
Micro cover glass (coverslips), 24×60 mm No. 1 VWR 48404-455
Microscope Smartphone Camera Adapter qhma QHMC017A-S01
Nile Blue A, pure Acros Organics 415690100
Nitrogen, Ultra Pure, Compressed Specialty Gases N.A.
Objective, UPLanXApo 100× Oil Immersion Olympus 14-910
Polyimide Film, Kapton 3M 16089-4
Potassium Phosphate Monobasic VWR P285
Potentiostat, 660E  CH Instruments N.A.
Pt wire Alfa Aesar 10956-BS
Scanning Electron Microscope, Apreo C SEM Thermo Fischer Scientific N.A.
Si wafer Ted Pella 16006
Silver nanoparticles (nanospheres), NanoXact 0.02 mg/mL in 2 mM citrate nanoComposix AGCN60
Silver pellets, 99.99% pure Kurt J. Lesker EVMAG40EXE-A
Slide Rack, Wash-N-Dry Diversified Biotech WSDR-2000
Smartphone, iPhone 13 mini Apple N.A.
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate VWR 0348
Spectrometer, IsoPlane SCT320 Teledyne Princeton Instruments N.A.
Tissue Wipers, Light-duty  VWR 82003-820
Tweezers, KS-04 Kaisi Hardware N.A.
Utrasonic Generator, sweepSONIK Blackstone-NEY Ultrasonics 809379
Water Ultrapurifier, Sartorius Arium mini Sartorius N.A.

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化学、第195号、
表面増強ラマン散乱分光法および顕微鏡法による単一ナノ粒子の電気化学の追跡
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Hemmer, J. V., Joshi, P. B., Wilson, … More

Hemmer, J. V., Joshi, P. B., Wilson, A. J. Tracking Electrochemistry on Single Nanoparticles with Surface-Enhanced Raman Scattering Spectroscopy and Microscopy. J. Vis. Exp. (195), e65486, doi:10.3791/65486 (2023).

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