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Biology

मैक्रो-स्केल हाइड्रोगेल में सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के तरीके

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम बाहरी तरल चरण की आवश्यकता के बिना मैक्रो-स्केल हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के लिए दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

सिंथेटिक जीन नेटवर्क वैज्ञानिकों और इंजीनियरों को आनुवंशिक स्तर पर एन्कोड की गई कार्यक्षमता के साथ नई प्रणालियों को डिजाइन और निर्माण करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। जबकि जीन नेटवर्क की तैनाती के लिए प्रमुख प्रतिमान एक सेलुलर चेसिस के भीतर है, सिंथेटिक जीन नेटवर्क को सेल-मुक्त वातावरण में भी तैनात किया जा सकता है। सेल-मुक्त जीन नेटवर्क के आशाजनक अनुप्रयोगों में बायोसेंसर शामिल हैं, क्योंकि इन उपकरणों को जैविक (इबोला, जीका और सार्स-सीओवी-2 वायरस) और अजैविक (भारी धातु, सल्फाइड, कीटनाशक, और अन्य कार्बनिक संदूषक) लक्ष्यों के खिलाफ प्रदर्शित किया गया है। सेल-फ्री सिस्टम आमतौर पर एक प्रतिक्रिया पोत के भीतर तरल रूप में तैनात होते हैं। एक भौतिक मैट्रिक्स में ऐसी प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने में सक्षम होने के नाते, हालांकि, वातावरण के व्यापक सेट में उनके व्यापक अनुप्रयोग की सुविधा हो सकती है। इसके लिए, विभिन्न प्रकार के हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के तरीके विकसित किए गए हैं। इस काम के लिए अनुकूल हाइड्रोगेल के प्रमुख गुणों में से एक हाइड्रोगेल सामग्री की उच्च-जल पुनर्गठन क्षमता है। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोगेल में भौतिक और रासायनिक विशेषताएं होती हैं जो कार्यात्मक रूप से फायदेमंद होती हैं। हाइड्रोगेल को भंडारण के लिए फ्रीज-सुखाया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए पुनर्जलीकृत किया जा सकता है। हाइड्रोगेल में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के समावेश और परख के लिए दो चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। सबसे पहले, एक सीएफपीएस प्रणाली को सेल लाइसेट के साथ पुनर्जलीकरण के माध्यम से हाइड्रोगेल में शामिल किया जा सकता है। हाइड्रोगेल के भीतर की प्रणाली को हाइड्रोगेल के माध्यम से पूर्ण प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित या संवैधानिक रूप से व्यक्त किया जा सकता है। दूसरा, सेल लाइसेट को पोलीमराइजेशन के बिंदु पर एक हाइड्रोगेल में पेश किया जा सकता है, और पूरे सिस्टम को बाद में हाइड्रोगेल के भीतर एन्कोड किए गए अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए इंड्यूसर युक्त जलीय घोल के साथ फ्रीज-सुखाया और पुनर्जलीकृत किया जा सकता है। इन विधियों में सेल-मुक्त जीन नेटवर्क की अनुमति देने की क्षमता है जो प्रयोगशाला से परे तैनाती की क्षमता के साथ हाइड्रोगेल सामग्री को संवेदी क्षमताएं प्रदान करते हैं।

Introduction

सिंथेटिक जीव विज्ञान जैविक रूप से आधारित भागों, उपकरणों और प्रणालियों को डिजाइन और इंजीनियर करने के लिए विविध इंजीनियरिंग विषयों को एकीकृत करता है जो उन कार्यों को कर सकते हैं जो प्रकृति में नहीं पाए जाते हैं। अधिकांश सिंथेटिक जीव विज्ञान दृष्टिकोण अभी भी जीवित कोशिकाओं से बंधे हैं। इसके विपरीत, सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रणाली डिजाइन में नियंत्रण और स्वतंत्रता के अभूतपूर्व स्तर की सुविधा प्रदान करती है, जिससे पारंपरिक सेल-आधारित जीनअभिव्यक्ति विधियों 1,2,3 की कई बाधाओं को समाप्त करते हुए इंजीनियरिंग जैविक प्रणालियों के लिए लचीलापन और कम समय में वृद्धि होती है। सीएफपीएस का उपयोग कृत्रिम कोशिकाओं के निर्माण, प्रोटोटाइप आनुवंशिक सर्किट, बायोसेंसर विकसित करने और मेटाबोलाइट्स 4,5,6 का उत्पादन करने सहित कई विषयों में अनुप्रयोगों की बढ़ती संख्या में किया जा रहा है। सीएफपीएस पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए भी विशेष रूप से उपयोगी रहा है जिसे जीवित कोशिकाओं में आसानी से व्यक्त नहीं किया जा सकता है, जैसे एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन, ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन और विषाक्त प्रोटीन 6,7,8।

सीएफपीएस आमतौर पर तरल प्रतिक्रियाओं में किया जाता है। यह, हालांकि, कुछ स्थितियों में उनकी तैनाती को प्रतिबंधित कर सकता है, क्योंकि किसी भी तरल सेल-मुक्त उपकरण को प्रतिक्रिया पोत के भीतर निहित किया जाना चाहिए। यहां प्रस्तुत विधियों के विकास के लिए तर्क हाइड्रोगेल में सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान उपकरणों को एम्बेड करने के लिए मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करना था, न कि प्रोटीन उत्पादन मंच के रूप में, बल्कि इसके बजाय, प्रयोगशाला से परे सेल-मुक्त उपकरणों की तैनाती के लिए भौतिक चेसिस के रूप में हाइड्रोगेल के उपयोग की अनुमति देना। सीएफपीएस चेसिस के रूप में हाइड्रोगेल के उपयोग के कई फायदे हैं। हाइड्रोगेल बहुलक सामग्री हैं, जो उच्च पानी की मात्रा (कभी-कभी 98% से अधिक) के बावजूद, ठोस गुण 9,10,11 होते हैं। उनके पास पेस्ट, स्नेहक और चिपकने वाले के रूप में उपयोग किया जाता है और संपर्क लेंस, घाव ड्रेसिंग, समुद्री चिपकने वाला टेप, मिट्टी में सुधार करने वाले और बेबी डायपर 9,11,12,13,14 जैसे विविध उत्पादों में मौजूद होते हैं। हाइड्रोजेल भी सक्रिय जांच के अधीन हैं क्योंकि दवा वितरण वाहन 9,15,16,17 हैं। हाइड्रोगेल जैव-संगत, बायोडिग्रेडेबल भी हो सकते हैं, और उनके पास अपने स्वयं के 9,18,19,20 की कुछ उत्तेजना प्रतिक्रियाएं होती हैं। इसलिए, यहां लक्ष्य आणविक जीव विज्ञान-व्युत्पन्न कार्यक्षमता और सामग्री विज्ञान के बीच तालमेल बनाना है। इसके लिए, कोलेजन, लैपोनाइट, पॉलीक्रिलामाइड, फाइब्रिन, पीईजी-पेप्टाइड और एगारोस 11,21,22 सहित कई सामग्रियों के साथ सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान को एकीकृत करने के प्रयास किए गए हैं, साथ ही साथ कांच, कागज और कपड़े 11,23,24 की सतहों को कोट करने के लिए भी। सीएफपीएस उपकरणों के साथ। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मैक्रो-स्केल (यानी, >1 मिमी) हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के लिए दो तरीकों का प्रदर्शन करते हैं, उदाहरण सामग्री के रूप में अगारोस का उपयोग करते हैं। Agarose को इसकी उच्च जल अवशोषण क्षमता, नियंत्रित स्व-गेलिंग गुणों और ट्यूनेबल यांत्रिक गुणों 11,24,25,26 के कारण चुना गया था। Agarose कार्यात्मक CFPS का भी समर्थन करता है, कई अन्य हाइड्रोगेल विकल्पों की तुलना में सस्ता है, और बायोडिग्रेडेबल है, जिससे यह एक प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली के रूप में एक आकर्षक विकल्प बन जाता है। हालांकि, इन विधियों को पहले वैकल्पिक हाइड्रोगेल11 की एक श्रृंखला में सीएफपीएस एम्बेड करने के लिए उपयुक्त के रूप में प्रदर्शित किया गया है। हाइड्रोगेल के अनुप्रयोगों की विस्तृत श्रृंखला और सीएफपीएस की कार्यक्षमता को ध्यान में रखते हुए, यहां प्रदर्शित विधियां एक आधार प्रदान कर सकती हैं जिससे शोधकर्ता अपने स्वयं के सिरों के अनुकूल जैविक रूप से बढ़ी हुई हाइड्रोगेल सामग्री विकसित करने में सक्षम हैं।

पिछले अध्ययनों में, प्रतिक्रिया बफर 23,27,28,29,30,31 में डूबे हाइड्रोगेल में सीएफपीएस करने के लिए 1 μm से 400 μm की आकार सीमा वाले माइक्रोगेल सिस्टम का उपयोग किया गया है। सीएफपीएस प्रतिक्रिया बफर के भीतर हाइड्रोगेल को जलमग्न करने की आवश्यकता, हालांकि, अपने आप में सामग्री के रूप में उनकी तैनाती के अवसरों को सीमित करती है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को प्रतिक्रिया बफर में जैल को डुबोने की आवश्यकता के बिना हाइड्रोगेल के भीतर होने की अनुमति देते हैं। दूसरा, मैक्रोस्केल जैल (आकार में 2 मिमी और 10 मिमी के बीच) का उपयोग हाइड्रोगेल और सेल-मुक्त जीन अभिव्यक्ति के बीच भौतिक बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक के साथ, यह अध्ययन करना संभव है कि हाइड्रोगेल मैट्रिक्स सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को कैसे प्रभावित करता है11 और सीएफपीएस प्रतिक्रियाएं हाइड्रोगेल मैट्रिक्स31 को कैसे प्रभावित कर सकती हैं। हाइड्रोगेल के बड़े आकार भी नवीन, जैव-प्रोग्रामयोग्य सामग्री के विकास की अनुमति देते हैं। अंत में, हाइड्रोगेल में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करके, प्लास्टिक प्रतिक्रिया वाहिकाओं की आवश्यकता में भी संभावित कमी है। सेल-मुक्त सेंसर की तैनाती के लिए, प्लास्टिक वेयर पर निर्भर उपकरणों पर इसके स्पष्ट फायदे हैं। एक साथ लिया गया, हाइड्रोगेल में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करना प्रयोगशाला से परे सेल-मुक्त उपकरणों की तैनाती के लिए कई फायदे प्रदान करता है।

यहां प्रस्तुत विधियों का समग्र लक्ष्य हाइड्रोगेल मैट्रिसेस के भीतर सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के संचालन की अनुमति देना है। मैक्रो-स्केल हाइड्रोगेल सामग्री (चित्रा 1) में सेल-मुक्त प्रोटीन उत्पादन प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है। विधि ए में, सीएफपीएस घटकों को एक सक्रिय प्रणाली बनाने के लिए लियोफिलाइज्ड एगारोस हाइड्रोगेल में पेश किया जाता है। विधि बी में, पिघले हुए अगारोस को सीएफपीएस प्रतिक्रिया घटकों के साथ मिलाकर एक पूर्ण सीएफपीएस हाइड्रोगेल सिस्टम बनाया जाता है, जिसे तब लियोफिलाइज किया जाता है और आवश्यकता होने तक संग्रहीत किया जाता है। प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए इन प्रणालियों को पानी या बफर और विश्लेषण की मात्रा के साथ पुनर्जलीकृत किया जा सकता है।

यह अध्ययन एस्चेरिचिया कोलाई सेल लाइसेट-आधारित प्रणालियों का उपयोग करता है। ये सबसे लोकप्रिय प्रयोगात्मक सीएफपीएस प्रणालियों में से कुछ हैं, क्योंकि ई कोलाई सेल लाइसेट तैयारी सरल, सस्ती है, और उच्च प्रोटीन पैदावार प्राप्त करती है। सेल लाइसेट को प्रतिलेखन और अनुवाद करने के लिए आवश्यक मैक्रोमोलेक्यूलर घटकों के साथ पूरक किया जाता है, जिसमें राइबोसोम, टीआरएनए, एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस और दीक्षा, बढ़ाव और समाप्ति कारक शामिल हैं। विशेष रूप से, यह पेपर ई कोलाई सेल लाइसेट का उपयोग करके एगारोस हाइड्रोगेल में ईजीएफपी और एमचेरी के उत्पादन को प्रदर्शित करता है और प्लेट रीडर और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रतिदीप्ति की उपस्थिति की निगरानी करता है। माइक्रोटिटर प्लेट रीडर के प्रतिनिधि परिणाम व्हिटफील्ड एट अल .31 में देखे जा सकते हैं, और अंतर्निहित डेटा सार्वजनिक रूपसे उपलब्ध हैं। इसके अलावा, पूरे जैल में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके की जाती है। इस पेपर में प्रदर्शित दो प्रोटोकॉल क्षेत्र तैनाती के सहायक तरीके से सेल-मुक्त जीन सर्किटरी के वितरण के लिए एक उपयुक्त भौतिक वातावरण बनाने के अंतिम लक्ष्य के साथ मटेरिया में सीएफपीएस-आधारित आनुवंशिक उपकरणों के संयोजन और भंडारण की अनुमति देते हैं।

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Protocol

1. सेल लाइसेट बफर और मीडिया तैयारी

  1. 2x YT + P एगर और मध्यम की तैयारी
    1. 16 ग्राम/लीटर ट्रिप्टोन, 10 ग्राम/लीटर यीस्ट एक्सट्रैक्ट, 5 ग्राम/एल एनएसीएल, 40 एमएल/एल 1 एमके2एचपीओ4, 22 एमएल/एल 1 एमकेएच2पीओ4, और 15 ग्राम/लीटर एगर मापकर 2x वाईटी+पी एगर तैयार करें। 2x YT + P शोरबा के लिए, पिछली रचना का पालन करें लेकिन अगर को छोड़ दें।
    2. 2x YT + P को ऑटोक्लेव करके निष्फल करें।
  2. S30A बफर की तैयारी
    1. एस 30 ए बफर को 5.88 ग्राम / एल एमजी-ग्लूटामेट, 12.195 ग्राम / एल के-ग्लूटामेट, और 25 एमएल / एल 2 एम ट्रिस के साथ तैयार करें, जिसे एसिटिक एसिड के साथ पीएच 7.7 में समायोजित किया जाए।
    2. S30A बफर को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. S30B बफर की तैयारी
    1. 5.88 ग्राम /एल एमजी-ग्लूटामेट और 12.195 ग्राम /एल के-ग्लूटामेट के साथ एस 30 बी बफर तैयार करें, जिसे 2 एम ट्रिस के साथ पीएच 8.2 में समायोजित किया जाए।
    2. S30B बफर को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. सेल लाइसेट तैयारी (4 दिन प्रोटोकॉल)

  1. दिन 1
    1. 2x YT + P को 100 μg / mL एम्पीसिलिन के साथ पूरक आगर प्लेटों में डालें।
    2. -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से स्ट्रीक ई कोलाई , और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. दिन 2
    1. 2x YT + P प्लेट से एक कॉलोनी को 1 L चकरा फ्लास्क में 2x YT + P शोरबा (एम्पीसिलिन के साथ पूरक) के 400 मिलीलीटर में टीका लगाएं।
    2. 220 आरपीएम झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. दिन 3
    1. 24 घंटे की संस्कृतियों के ओडी600 को मापें और रिकॉर्ड करें; 3-4 के OD600 पर वृद्धि पर्याप्त है।
      नोट: बैक्टीरियल कल्चर का 1 एमएल एलिकोट लें, और ओडी600 एनएम को मापने से पहले मध्यम (2x YT + P शोरबा) के साथ एक सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। ओडी600 की गणना करते समय कमजोर पड़ने वाले प्रभाव की अनुमति दें।
    2. प्री-चिल्ड 500 एमएल सेंट्रीफ्यूज बोतलों के बीच समान रूप से कल्चर को स्थानांतरित करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    4. सेंट्रीफ्यूजिंग करते समय, पहले से तैयार एस 30 ए बफर में 1 एम डीटीटी के 2 एमएल / एल को जोड़कर, मिश्रण करके और बर्फ पर बफर को बनाए रखकर एस 30 ए बफर तैयारी को पूरा करें।
    5. एस 30 ए बफर के 200 एमएल में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
    6. बोतलों को जोर से भंवर करें जब तक कि पूरी गोली पूरी तरह से घुलनशील न हो जाए, कोशिकाओं को यथासंभव बर्फ पर रखें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    8. चरण 2.3.5-2.3.7 (समावेशी) दोहराएँ।
    9. प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज बोतल में 40 एमएल एस 30 ए बफर जोड़ें, छर्रों को फिर से निलंबित करें, और पूर्व-वजन वाले 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाले को डिकेन्टिंग द्वारा फेंक दें, और पिपेट द्वारा अवशिष्ट सुपरनैटेंट को हटा दें, इसे जितना संभव हो सके बर्फ पर रखें।
    11. सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को फिर से तौलें, नए द्रव्यमान को रिकॉर्ड करें, और छर्रों के द्रव्यमान की गणना करें।
    12. तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज छर्रों को रखें, और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. दिन 4
    1. छर्रों को बर्फ पर पिघलाएं।
    2. प्रति 1 ग्राम गोली में, निम्नलिखित जोड़ें: 1.2 एमएल एस 30 ए बफर (उपयोग से पहले डीटीटी जोड़ा गया), 275 μL प्रोटीज अवरोधक (8 एमएम स्टॉक), और 25 μL लाइसोजाइम (10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक)।
    3. भंवर तब तक सख्ती से जब तक कि छर्रों को पूरी तरह से घुलनशील नहीं किया जाता है, जिसमें कोई शेष झुरमुट नहीं होता है, उन्हें जितना संभव हो सके बर्फ पर रखा जाता है।
    4. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में, 120 डब्ल्यू, 20 किलोहर्ट्ज, 30% आयाम और 20 एस / 40 एस ऑन/ऑफ दालों पर 5 मिनट के सोनिकेशन के लिए सेल सस्पेंशन को सोनिक करें।
    5. सेल मलबे को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 4,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज।
    6. सतह पर तैरनेवाला को ताजा 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    7. 80 मिनट के लिए 220 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ट्यूब।
    8. एस 30 बी बफर में 1 एमएल डीटीटी के 1 एमएल / एल को जोड़कर डायलिसिस सामग्री तैयार करें। मिलाएं और 1 एल बाँझ बीकर में 900 एमएल जोड़ें। एक चुंबकीय हलचल जोड़ें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    9. अपवाह प्रतिक्रिया के बाद, सेल अर्क को चरण 2.4.7 से 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    10. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बर्फ पर पेलेट-मुक्त सुपरनैटेंट को समेकित करें।
    11. उत्पादित सेल निकालने की कुल मात्रा निर्धारित करें, और 10K MWCO डायलिसिस कैसेट्स की आवश्यक संख्या को 2 मिनट के लिए S30B में डुबोकर हाइड्रेट करें।
    12. 3 एमएल अर्क के साथ एक सिरिंज के माध्यम से कैसेट लोड करें। 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हिलाते हुए, प्रति 1 लीटर बीकर में तीन कैसेट तक डायलेज़ करें।
    13. डायलिसिस पूरा होने के बाद, जो अर्क को स्पष्ट करता है, अर्क को 2 एमएल माइक्रो-सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    14. स्पष्ट अर्क को बर्फ पर एक ताजा सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में समेकित करें, और मिश्रण करने के लिए संक्षेप में भंवर।
    15. फ्लोरोमीटर का उपयोग करके अर्क की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
    16. प्री-चिल्ड डीडीएच2ओ का उपयोग करके अर्क को 44.5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।
    17. 200 μL एलिकोट में एलिकोट, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. लियोफिलाइज्ड हाइड्रोगेल की तैयारी (विधि ए)

  1. 0.75 ग्राम एगारोस का वजन करें, 100 एमएल की मात्रा में डीडीएच2ओ जोड़ें, और पिघला हुआ अगारोस स्टॉक बनाने के लिए उच्च तापमान पर 30 सेकंड में माइक्रोवेव करें।
  2. एक पिपेट का उपयोग करके, पिघले हुए अगारोस के 50 μL को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और जेल को 20-30 मिनट के लिए पॉलीमराइजेशन करने की अनुमति दें (जैल को फ्रिज में स्थानांतरित करने पर पोलीमराइजेशन तेजी से होता है)।
  3. तरल नाइट्रोजन में पॉलीमराइज्ड जैल युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को फ्लैश-फ्रीज करें।
  4. सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के ढक्कन को हटा दें, मोम फिल्म के साथ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के उद्घाटन को कवर करें, और सुई या पिपेट टिप के साथ फिल्म को कई बार छेदें।
  5. पॉलीमराइज्ड जैल युक्त माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को 1-2 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण में स्थानांतरित करें।
  6. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को पुनर्प्राप्त करें, और फ्रीज-ड्रायर में रखें, यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब पूरी तरह से सूख गए हैं।
  7. फ्रीज-ड्रायर को निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ संलग्न करें: तापमान: -20 डिग्री सेल्सियस, दबाव: 0.1 मिलीबार।
  8. जेल को रात भर फ्रीज-सूखने के लिए छोड़ दें।
  9. फ्रीज-ड्रायर से जैल को पुनर्प्राप्त करें, और उन्हें आवश्यक होने तक -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण में रखें।
    नोट: जैल को 1 वर्ष तक फ्रीज-सूखे संग्रहीत किया जा सकता है।

4. 14x ऊर्जा समाधान स्टॉक की तैयारी

  1. 14x ऊर्जा समाधान का उत्पादन करने के लिए बर्फ पर 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सभी प्रतिक्रिया घटकों (तालिका 1) को मिलाएं।
  2. 14x ऊर्जा समाधान को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (छोटे वॉल्यूम एलिकोट का उपयोग किया जा सकता है)।
    नोट: 14x ऊर्जा समाधान को -80 डिग्री सेल्सियस पर कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है यदि ट्यूबों के बार-बार फ्रीज-पिघलने से बचा जाता है।

5. 4x अमीनो एसिड स्टॉक की तैयारी

  1. बर्फ पर, आरटीएस एमिनो एसिड सैंपलर किट के सभी 20 अमीनो एसिड घटकों को पिघलाएं। अमीनो एसिड को भंवर में यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे पूरी तरह से भंग हो गए हैं।
  2. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, सभी 20 अमीनो एसिड को मिलाएं, और 12 एमएल बाँझ डीडीएच2ओ भंवर जोड़ें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो जाए, केवल सफेद रंग की थोड़ी धुंध के साथ।
  3. 4x अमीनो एसिड को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (500 μL एलिकोट) में विभाजित करें।
  4. तरल नाइट्रोजन में 4x अमीनो एसिड समाधान एलिकोट को फ्लैश-फ्रीज करें, और एलिकोट को -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण में ले जाएं।

6. सेल-मुक्त बफर अंशांकन

नोट: हाइड्रोगेल प्रतिक्रियाओं के लिए उपयोग किए जाने वाले सीएफपीएस बफर को सन एट अल.35 से संशोधित बैंक एट अल.34 में प्रोटोकॉल का पालन करते हुए इष्टतम डीटीटी, एमजी-ग्लूटामेट और के-ग्लूटामेट सांद्रता के लिए कैलिब्रेट किया गया था। अंशांकन प्रतिक्रिया रचनाओं को प्रयोगों के डिजाइन (डीओई) विधि का उपयोग करके चुना गया था, जिसमें के-ग्लूटामेट (200 एमएम, 400 एमएम, 600 एमएम, 1,000 एमएम, 1,200 एमएम, 1,400 एमएम), एमजी-ग्लूटामेट (0 एमएम, 10 एमएम, 20 एमएम, 30 एमएम, 40 एमएम, 50 एमएम, 60 एमएम) के लिए सात कारक स्तरों का चयन किया गया था। 20 mM, 25 mM, 30 mM) स्टॉक. जेएमपी प्रो 15 का उपयोग कस्टम डीओई डिजाइन (तालिका 2) उत्पन्न करने और इष्टतम कारक सांद्रता निर्धारित करने के लिए विश्लेषण करने के लिए किया गया था।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेल-मुक्त अर्क को पुनर्प्राप्त करें, और बर्फ पर पिघलें।
  2. बर्फ पर 4x अमीनो एसिड, 14x ऊर्जा समाधान, 40% PEG-8000, प्लास्मिड डीएनए, 3 M K-ग्लूटामेट, 100 mM Mg-ग्लूटामेट और 100 mM DTT स्टॉक को पिघलाएं।
  3. 4x अमीनो एसिड के 12.5 μL, 14x ऊर्जा समाधान के 3.57 μL, 40% PEG-8000 के 2.5 μL, प्लास्मिड डीएनए के 3 μg, और सेल-मुक्त अर्क (44.5 मिलीग्राम / mL) के 10 μL के संयोजन से एक अंशांकन मास्टर मिश्रण बनाएं, और ddH2O के साथ प्रति प्रतिक्रिया 35 μL तक बनाएं।
  4. 35 μL मास्टर मिश्रण को एक काले 384-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं में वितरित करें।
  5. डीओई डिजाइन के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया में एमजी-ग्लूटामेट, के-ग्लूटामेट और डीटीटी की उचित मात्रा जोड़ें, साथ ही प्रत्येक प्रतिक्रिया को 50 μL तक बनाने के लिए डीडीएच2ओ के साथ।
  6. वर्णित प्लेट रीडर सेटिंग्स का उपयोग करके प्रतिदीप्ति का पता लगाने और विश्लेषण के लिए माइक्रोटिटर प्लेट को प्लेट रीडर में स्थानांतरित करें (एमचेरी के लिए): उत्तेजना: 587 एनएम, उत्सर्जन: 610 एनएम, तरंग दैर्ध्य बैंडविड्थ: 12 एनएम, प्रकाशिकी: शीर्ष, तापमान: 37 डिग्री सेल्सियस, कुल पढ़ने के समय के 4 घंटे के लिए हर 5 मिनट में प्रतिदीप्ति रीडिंग एकत्र की जाती है। 60 आरपीएम पर स्पंदित सेटिंग पर हिलाने के साथ प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  7. परिणामों को जेएमपी डीओई डिजाइन में अपलोड करें, और वांछित प्रतिक्रिया चर के आधार पर के-ग्लूटामेट, एमजी-ग्लूटामेट और डीटीटी के लिए इष्टतम एकाग्रता स्तर निर्धारित करने के लिए एक पूर्वानुमान प्रोफ़ाइल उत्पन्न करें; इस मामले में, अधिकतम प्रतिदीप्ति और प्रतिक्रिया दर प्रतिक्रिया चर थे।
  8. 2X CFPS बफर बनाने के लिए तालिका 3 में दिखाए गए अनुसार अभिकर्मकों को संयोजित करें।
  9. -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट और स्टोर करें।

7. रिहाइड्रेटेड लियोफिलाइज्ड हाइड्रोगेल में सीएफपीएस (विधि ए)

नोट: सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं में उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड ई कोलाई36 के लिए इकोफ्लेक्स मॉड्यूलर टूलकिट के घटकों का उपयोग करके बनाए गए थे और व्हिटफील्ड एट अल 11 में वर्णित JM23100 थे। ये घटक Addgene से उपलब्ध हैं।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेल-मुक्त अर्क को पुनर्प्राप्त करें, और लगभग 20 मिनट के लिए बर्फ पर पिघलें।
  2. 2x CFPS बफर और प्लास्मिड डीएनए एकत्र करें, और बर्फ पर पिघलें।
  3. फ्रीज-सूखे हाइड्रोगेल इकट्ठा करें, और उन्हें बेंच पर खड़े होने के लिए जैल छोड़कर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें।
  4. जैल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, यदि आवश्यक हो तो जैल को स्केलपेल के साथ ट्रिम करें ताकि उन्हें कुओं में फिट किया जा सके।
  5. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 2x CFPS बफर के 25 μL और प्लास्मिड डीएनए के 4 μg के साथ 10 μL सेल-मुक्त अर्क को मिलाएं; सीएफपीएस समाधान बनाने के लिए डीडीएच2ओ के साथ 50 μL की कुल मात्रा बनाएं।
  6. फ्रीज-सूखे हाइड्रोगेल पर सीएफपीएस समाधान को पिपेट करें।
  7. जैल को कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए सीएफपीएस सिस्टम में भिगोने दें।
  8. स्पैटुला का उपयोग करके जैल को काले 384-वेल माइक्रोटिटर प्लेट में स्थानांतरित करें।
  9. चरण 6.6 में वर्णित प्लेट रीडर सेटिंग्स का उपयोग करके प्रतिदीप्ति का पता लगाने और विश्लेषण के लिए माइक्रोटिटर प्लेट को प्लेट रीडर में स्थानांतरित करें। प्रतिनिधि परिणाम पिछले अध्ययनों31,33 में उपलब्ध हैं।

8. तैनाती योग्य हाइड्रोगेल में सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (विधि बी)

  1. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से सेल-मुक्त अर्क पुनर्प्राप्त करें, और लगभग 20 मिनट के लिए बर्फ पर पिघलें।
  2. प्लास्मिड डीएनए इकट्ठा करें, और बर्फ पर पिघलें।
  3. बर्फ पर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 10 μL सेल-फ्री एक्सट्रैक्ट को 3 μg प्लास्मिड डीएनए और 25 μL 2x CFPS बफर के साथ मिलाएं, जिससे कुल मात्रा 37.5 μL हो जाती है।
  4. 3 ग्राम एगारोस को मापें, और 3% एग्रोस बनाने के लिए डीडीएच2ओ बफर के 100 एमएल में जोड़ें।
  5. माइक्रोवेव 30 सेकंड में 3% एगारोज़ उच्च शक्ति पर फट जाता है।
  6. पिपेट 12.5 μL पिघला हुआ अगाग्रोस 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बदल जाता है जिसमें सीएफपीएस मिश्रण 50 μL की कुल मात्रा होती है।
  7. पिघले हुए अगारोस को ठंडा होने दें, लेकिन पॉलीमराइज न करें, जिससे अगारोस को 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीट ब्लॉक में छोड़ दिया जाए।
  8. पिघले हुए अगारोस को सीएफपीएस समाधान के साथ मिलाएं; टिप के साथ पाइपिंग और सरगर्मी के माध्यम से मिलाएं, और सीएफपीएस समाधान को मिश्रित करने से पहले जेल पोलीमराइजेशन से बचने के लिए जल्दी से आगे बढ़ना सुनिश्चित करें।
  9. जैल को कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें और लगभग 2 मिनट के लिए पॉलीमराइज्ड करें।
  10. पॉलीमराइज्ड अगारोस को स्पैटुला के साथ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज करें।
  11. फ्लैश-जमे हुए हाइड्रोगेल को 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण में रखें।
  12. भंडारण से जैल पुनर्प्राप्त करें; माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के ढक्कन को हटा दें, ट्यूबों को मोम फिल्म के साथ कवर करें, और नमी को सूखने की अनुमति देने के लिए फिल्म को छेदें।
  13. फ्रीज-ड्रायर को निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ संलग्न करें: तापमान: -20 डिग्री सेल्सियस, दबाव: 0.1 मिलीबार, 18 घंटे (रात भर) के लिए फ्रीज सुखाने।
  14. फ्रीज-सूखे सीएफपीएस उपकरणों को उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण में स्टोर करें।
  15. फ्रीज-सूखे सीएफपीएस डिवाइस, 50 μL की अनुमानित गीली मात्रा के साथ, अतिरिक्त तरल के बिना डीडीएच2ओ के 50 μL के साथ पुनर्जलीकृत किया जा सकता है। पुनर्जलीकरण में लगभग 30 मिनट लगते हैं।
  16. स्पैटुला का उपयोग करके जैल को काले 384-वेल माइक्रोटिटर प्लेट में स्थानांतरित करें।
  17. चरण 6.6 में वर्णित प्लेट रीडर सेटिंग्स का उपयोग करके प्रतिदीप्ति का पता लगाने और विश्लेषण के लिए माइक्रोटिटर प्लेट को प्लेट रीडर में स्थानांतरित करें। प्रतिनिधि परिणाम पिछले प्रकाशनों31,33 में उपलब्ध हैं।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के लिए दो तरीकों का विवरण देता है, जिसमें चित्रा 1 दो दृष्टिकोणों का योजनाबद्ध अवलोकन प्रस्तुत करता है। दोनों विधियां फ्रीज-सुखाने और दीर्घकालिक भंडारण के लिए उत्तरदायी हैं। विधि ए दो कारणों से सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली पद्धति है। सबसे पहले, इसे हाइड्रोगेल सामग्री11 की एक श्रृंखला के साथ काम करने के लिए सबसे लागू विधि दिखाया गया है। दूसरा, विधि ए आनुवंशिक संरचनाओं के समानांतर परीक्षण की अनुमति देता है। विधि बी एक अनुकूलित प्रणाली और क्षेत्र परिनियोजन के निर्माण के लिए अधिक उपयुक्त है। दोनों प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता में सहायता के लिए कई नमूनों को एक बार में तैयार करने की अनुमति देते हैं। यह सुविधा प्रौद्योगिकी के दीर्घकालिक विकास के लिए भी उपयोगी है, क्योंकि फ्रीज-सूखे उपकरणों को शुष्क अवस्था में भेज दिया जा सकता है और आवश्यकता पड़ने पर साइट पर पुनर्गठित किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल और चित्रा 1 में उल्लिखित दृष्टिकोण का उपयोग एकल जीन संरचनाओं की अभिव्यक्ति या कई जीनों की सह-अभिव्यक्ति के लिए किया जा सकता है। चित्रा 2 में प्रस्तुत डेटा 0.75% एगारोस जेल में ईजीएफपी और एमचेरी दोनों की अभिव्यक्ति दिखाता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया गया था कि प्रोटीन अभिव्यक्ति पूरे हाइड्रोगेल में समरूप थी, जिसमें आंतरिक विमान भी शामिल थे। विशेष रूप से, प्रोटीन संश्लेषण हाइड्रोगेल के बाहरी किनारों तक ही सीमित नहीं था, और आंतरिक प्रतिदीप्ति प्रोटीन प्रसार का परिणाम नहीं था। इसकी पुष्टि करने के लिए, एक ईजीएफपी-व्यक्त हाइड्रोगेल को एमचेरी-व्यक्त हाइड्रोगेल के साथ शारीरिक संपर्क में रखकर, एक हाइड्रोगेल से दूसरे में प्रोटीन प्रसार देखना संभव था। दोनों के बीच प्रसार की दर सामग्री के अंदर लाल या हरे रंग की प्रतिदीप्ति के व्यापक स्थानीयकरण की व्याख्या करने के लिए अपर्याप्त थी। यह प्रयोग हाइड्रोगेल में सेल-मुक्त उपकरणों को तैनात करने के एक महत्वपूर्ण लाभ को भी दर्शाता है- डिवाइस की कार्यक्षमता को स्थानिक रूप से इस तरह से व्यवस्थित किया जा सकता है जो तरल सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं में संभव नहीं है। इसके अलावा, जीन नेटवर्क के निर्माण के लिए, एक से अधिक जीन उत्पाद के एक साथ संश्लेषण की आवश्यकता होती है। चित्रा 2 (नीचे पंक्ति) में दिखाए गए परिणामों ने अगारोस में एमचेरी और ईजीएफपी दोनों की सह-अभिव्यक्ति की पुष्टि की। इस काम में, दोनों प्रोटीन व्यक्त किए गए थे, और प्रोटीन के बीच कोई स्थानिक प्रतिस्पर्धा नहीं थी। फिर, लाल और हरे रंग की तरंग दैर्ध्य सीमा का एक ओवरले हाइड्रोगेल के भीतर दोनों प्रोटीनों के स्थानिक वितरण को भी दर्शाता है।

तालिका 1: 14x ऊर्जा समाधान स्टॉक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं के भीतर डीटीटी, एमजी-ग्लूटामेट और के-ग्लूटामेट के अनुकूलन के लिए एक प्रयोगात्मक सरणी का डिजाइन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: 2x CFPS बफर घटक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 1
चित्रा 1: दो प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध। पहली विधि में (विधि ए, इस पेपर में प्रदर्शित) हाइड्रोगेल सामग्री पहले तैयार की जाती है और फिर सेल-मुक्त घटकों के बिना फ्रीज-सूखे (चरण 1) होती है। प्रोटीन उत्पादन के लिए इनक्यूबेशन से पहले सेल-मुक्त प्रतिक्रिया की सही मात्रा के साथ आवश्यकता होने पर इन सूखे हाइड्रोगेल को संग्रहीत और पुनर्गठित किया जा सकता है (चरण 3) संस्करण विधि, विधि बी, प्रारंभिक हाइड्रोगेल निर्माण में सेल-मुक्त प्रतिक्रिया घटकों के सभी, या कुछ को शामिल करती है। फ्रीज-सुखाने (चरण 1) के बाद, हाइड्रोगेल को अकेले पानी में या बफर में पुनर्गठित किया जा सकता है जिसमें रुचि का विश्लेषण होता है (चरण 2)। प्रोटीन उत्पादन (चरण 3) पहले की तरह जारी है। एक तीसरी विधि, जिसमें फ्रीज-सूखे सेल-मुक्त घटकों को हाइड्रोगेल पॉलिमर के साथ पुनर्गठित किया जाता है, व्हिटफील्ड एट अल .11 में वर्णित है, लेकिन आज तक केवल सीमित संख्या में हाइड्रोगेल के साथ उपयोग पाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ई कोलाई सेल लाइसेट का उपयोग करके हाइड्रोगेल में ईजीएफपी और एमचेरी का सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण। Agarose जैल (0.75%) को डीएनए टेम्पलेट (शीर्ष) के बिना या तो eGPP या mCherry टेम्पलेट (मध्य) के 4 μg के साथ या eGFP और mCherry टेम्पलेट (नीचे) दोनों के 4 μg के साथ तैयार किया गया था। हाइड्रोगेल को लाल और हरे चैनलों में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी से पहले 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। दो चैनलों का एक ओवरले भी दिखाया गया है, और ओवरले में अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) छवि शामिल है। ईजीएफपी या एमचेरी टेम्प्लेट युक्त हाइड्रोगेल को अलग से तैयार किया गया था, लेकिन एक दूसरे के साथ शारीरिक संपर्क में इनक्यूबेट किया गया था। जेल व्यास 6 मिमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कोलाई सेल लाइसेट-आधारित सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एगारोस हाइड्रोगेल में शामिल करने के लिए यहां दो प्रोटोकॉल दिए गए हैं। ये विधियां पूरे सामग्री में एक साथ जीन अभिव्यक्ति की अनुमति देती हैं। प्रोटोकॉल को अन्य सीएफपीएस प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और यहां विस्तृत प्रयोगशाला-तैयार सेल लाइसेट के अलावा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीएफपीएस किट के साथ सफलतापूर्वक आयोजित किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, प्रोटोकॉल बाहरी तरल चरण की अनुपस्थिति में जीन अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। इसका मतलब है कि सिस्टम आत्म-निहित है और सेल-मुक्त प्रतिक्रिया स्नान की आवश्यकता नहीं है। पिछले तरीकों से अलग जिसमें हाइड्रोगेल के भीतर सीएफपीएस प्रतिक्रियाएं हुईं, बाहरी बफर और प्रतिक्रिया वाहिकाओं की आवश्यकता इस विधि से हटा दी गई है। यह अनुमान लगाया गया है कि ये विधियां शोधकर्ताओं को सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान उपकरणों के लिए चेसिस के रूप में हाइड्रोगेल सामग्री के उपयोग का पता लगाने की अनुमति देंगी, अंततः ऐसे उपकरणों को प्रयोगशाला से बाहर ले जाने के लिए एक मार्ग प्रदान करेंगी।

दोनों दृष्टिकोणों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण उच्च गुणवत्ता वाले सेल लाइसेट का उपयोग है। एक उच्च गुणवत्ता वाले सेल लाइसेट में उच्च प्रोटीन एकाग्रता (> 40 मिलीग्राम / एमएल) होनी चाहिए, तैयारी की अवधि के लिए ठंडा रखा जाना चाहिए, और बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्र से नहीं गुजरना चाहिए। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि डीएनए टेम्प्लेट उच्च शुद्धता के हैं। इसे प्राप्त करने के लिए, सीएफपीएस वातावरण के भीतर आगे बढ़ने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं के लिए उच्च-शुद्धता, उच्च उपज प्लास्मिड तैयारी किट का उपयोग करके प्लास्मिड को कोशिकाओं से निकाला जाना चाहिए। ये महत्वपूर्ण चरण सभी सीएफपीएस अनुप्रयोगों के लिए आम हैं और इस पद्धति के लिए अद्वितीय नहीं हैं। बहरहाल, यह सीएफपीएस घटकों की तैयारी है जिसका प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता पर सबसे बड़ा प्रभाव पड़ता है। सामग्री के संदर्भ में, हाइड्रोगेल के प्रभावी, तेजी से फ्रीज-सुखाने को प्राप्त करने की आवश्यकता है। यदि फ्रीज-ड्रायर पर्याप्त रूप से ठंडे तापमान (-45 डिग्री सेल्सियस से नीचे) तक नहीं पहुंचता है, तो जेल को फ्रीज-सूखे के बजाय सुखाया जाएगा, जो हाइड्रोगेल मैट्रिक्स की आंतरिक संरचना से समझौता कर सकता है और एम्बेडेड सीएफपीएस सिस्टम के क्षरण का कारण बन सकता है। विधि बी में एक अनूठी चिंता भी है; विशेष रूप से, जेल बनाने के लिए पिघले हुए अगारोस में सीएफपीएस मिश्रण जोड़ते समय, सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं में थर्मल गिरावट को रोकने के लिए सीएफपीएस मिश्रण को जोड़ने से पहले पिघले हुए अगारोस को पर्याप्त रूप से ठंडा करने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए। हालांकि, अगारोस को बहुत अधिक ठंडा करने की अनुमति देने से जेल का पोलीमराइजेशन होगा और सीएफपीएस प्रणाली को जोड़ने से रोका जा सकेगा। अंत में, हाइड्रोगेल में ऑटोफ्लोरेसेंस की एक डिग्री होती है, जो सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के दौरान उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ संघर्ष कर सकती है। इसलिए, उचित नकारात्मक नियंत्रण और आनुवंशिक संवाददाताओं को शामिल करना महत्वपूर्ण है जिनके पास सामग्री के समान प्रतिदीप्ति विशेषताएं नहीं हैं।

यहां प्रदर्शित प्रोटोकॉल एक मॉडल हाइड्रोगेल के रूप में अगारोस के उपयोग पर केंद्रित हैं। Agarose इस काम के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है क्योंकि यह व्यापक रूप से उपलब्ध, सस्ती है, और उत्कृष्ट प्रोटीन उत्पादन क्षमताओं को प्रदर्शित करता है। पिछली जांच ों से यह भी पता चला है कि सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं में भीड़ एजेंट पीईजी के लिए एगारोस एक विकल्प हो सकता है, यह दर्शाता है कि बहुलक चेसिस और सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के बीच बातचीतप्रोटीन उत्पादन को बढ़ा सकती है। हालांकि, ये विधियां अलग-अलग भौतिक और रासायनिक गुणों के साथ वैकल्पिक हाइड्रोगेल मैट्रिसेस की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करके संशोधनों के लिए भी उत्तरदायी हैं। इस विधि को ज़ैंथन गम, एल्गिनेट, एसाइल गेलन गम, पॉलीक्रिलामाइड, हाइलूरोनिक एसिड हाइड्रोगेल और पोलोक्सेमर जैल एफ -108 और एफ -1279 पर लागू किया गया है। कुछ परिदृश्यों में, तरल नियंत्रण या अन्य हाइड्रोगेल की तुलना में कम प्रोटीन उत्पादन देखा जाता है। बहरहाल, इन परिदृश्यों में, एक व्यापार-बंद पूरा हो सकता है, जहां सामग्री की कार्यक्षमता (जैसे, इसके चिपकने वाले गुण या जैव-रासायनिकता) महत्वपूर्ण लाभ के हैं जैसे कि प्रोटीन उत्पादन में कमी को स्वीकार किया जा सकता है। हाइड्रोगेल की सांद्रता में संशोधन भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Agarose के लिए, विधियां 0.5% -1.5% w / v की सीमा में बहुलक सांद्रता के लिए उत्तरदायी हैं। एक उच्च जेल एकाग्रता आमतौर पर, एक भौतिक अर्थ में, एक अधिक मजबूत उपकरण में परिणाम देती है जो हैंडलिंग के लिए अधिक लचीला होता है और सीएफपीएस प्रतिक्रिया को बेहतर ढंग से संरक्षित करता है। हालांकि, बढ़ी हुई जेल एकाग्रता के साथ व्यापार-बंद यह है कि प्रतिक्रिया में कम उत्पादन दर या प्रोटीन उपज11,37 हो सकती है। बहुलक एकाग्रता और प्रोटीन उत्पादन के बीच संबंध, हालांकि, रैखिक नहीं है और उपयोग किए गए हाइड्रोगेलके आधार पर भिन्न होता है। जैसे, किसी भी नए हाइड्रोगेल बहुलक के लिए, सेल-मुक्त कार्यक्षमता के खिलाफ सामग्री कार्यक्षमता को संतुलित करने के लिए प्रयोग की एक डिग्री की आवश्यकता होती है।

बाहरी बफर की आवश्यकता के बिना हाइड्रोगेल सामग्री में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करना सेल-मुक्त उपकरणों की तैनाती के लिए एक दिलचस्प मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है। सेल-मुक्त उपकरण एक नियंत्रित प्रयोगशाला वातावरण के बाहर आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जीवों की रिहाई की आवश्यकता को दूर करने का लाभ उठाते हैं। इसके अलावा, हाइड्रोगेल में प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने से पुनर्गठन के बाद प्रतिक्रिया वाहिकाओं (आमतौर पर प्लास्टिक के बर्तन) की आवश्यकता दूर हो जाती है। यह देखते हुए कि कई हाइड्रोगेल बायोडिग्रेडेबल हैं, यह प्लास्टिक कचरे को कम करने के लिए एक संभावित मार्ग प्रदान करता है। इसी तरह, यहां विस्तृत प्रोटोकॉल यह भी दर्शाता है कि हाइड्रोगेल और सीएफपीएस दोनों फ्रीज-सुखाने के लिए उत्तरदायी हैं। जबकि लियोफिलाइजेशन के बार-बार चक्र ों की सिफारिश नहीं की जाती है और एकल-उपयोग वाले उपकरणों के लिए सीएफपीएस और हाइड्रोगेल फ़ंक्शन को नुकसान पहुंचाएगा। घटकों को फ्रीज-ड्राई और पुनर्गठित करने की क्षमता डिवाइस के वजन को कम करती है और परिवहन के दौरान कोल्ड चेन की आवश्यकता को हटा देती है। ये गुण अंततः रसद को सरल बनाते हैं और उपकरणों के लिए परिवहन लागत को कम करते हैं। इसके अलावा, हाइड्रोगेल के अपने स्वयं के कई उपयोगी कार्यात्मक गुण हैं; उदाहरण के लिए, वे पेस्ट, स्नेहक और चिपकने वाले के रूप में कार्य कर सकते हैं। हाइड्रोगेल भी बायोकम्पैटिबल, बायोडिग्रेडेबल हो सकते हैं, और अपने आप में उत्तेजना-प्रतिक्रियाएं रखते हैं। एक साथ लिया गया, बायोप्रोग्रामेबल सामग्रियों का एक नया वर्ग बनाने के लिए जैविक कार्यक्षमता और सामग्री विज्ञान के बीच एक तालमेल हासिल किया जा सकता है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

लेखक जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद पुरस्कार बीबी/V017551/1 (एस.के., टी.पी.एच.) और बीबी/W01095X/1 (ए.एल., टी.पी.एच.) और इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद - रक्षा विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रयोगशालाएं पुरस्कार ईपी/N026683/1 (सी.जे.डब्ल्यू., ए.एम.बी., टी.पी.एच.) के समर्थन को स्वीकार करते हैं। इस प्रकाशन का समर्थन करने वाले डेटा खुले तौर पर उपलब्ध हैं: 10.25405/ data.ncl.22232452. खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी बीवाई) लाइसेंस लागू किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

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Kavil, S., Laverick, A., Whitfield, C. J., Banks, A. M., Howard, T. P. Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels. J. Vis. Exp. (196), e65500, doi:10.3791/65500 (2023).

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