Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder for å legge inn cellefrie proteinsyntesereaksjoner i makroskala hydrogeler

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi to protokoller for å legge inn cellefrie proteinsyntesereaksjoner i makroskala hydrogelmatriser uten behov for en ekstern væskefase.

Abstract

Syntetiske gennettverk gir en plattform for forskere og ingeniører til å designe og bygge nye systemer med funksjonalitet kodet på genetisk nivå. Mens det dominerende paradigmet for distribusjon av gennettverk er innenfor et cellulært chassis, kan syntetiske gennettverk også distribueres i cellefrie miljøer. Lovende anvendelser av cellefrie gennettverk inkluderer biosensorer, da disse enhetene har blitt demonstrert mot biotiske (Ebola, Zika og SARS-CoV-2-virus) og abiotiske (tungmetaller, sulfider, plantevernmidler og andre organiske forurensninger) mål. Cellefrie systemer er vanligvis distribuert i flytende form i et reaksjonsbeholder. Å kunne legge inn slike reaksjoner i en fysisk matrise kan imidlertid lette deres bredere anvendelse i et bredere sett av miljøer. For dette formål har metoder for å legge inn cellefrie proteinsyntesereaksjoner (CFPS) i en rekke hydrogelmatriser blitt utviklet. En av de viktigste egenskapene til hydrogeler som bidrar til dette arbeidet, er høyvannsrekonstitueringskapasiteten til hydrogelmaterialer. I tillegg har hydrogeler fysiske og kjemiske egenskaper som er funksjonelt fordelaktige. Hydrogeler kan frysetørkes for lagring og rehydreres for senere bruk. To trinnvise protokoller for inkludering og analyse av CFPS-reaksjoner i hydrogeler presenteres. For det første kan et CFPS-system inkorporeres i en hydrogel via rehydrering med et cellelysat. Systemet i hydrogelen kan deretter induseres eller uttrykkes konstitutivt for fullstendig proteinekspresjon gjennom hydrogelen. For det andre kan cellelysat innføres til en hydrogel ved polymerisasjonspunktet, og hele systemet kan frysetørkes og rehydreres på et senere tidspunkt med en vandig oppløsning som inneholder induktoren for ekspresjonssystemet kodet i hydrogelen. Disse metodene har potensial til å tillate cellefrie gennettverk som gir sensoriske evner til hydrogelmaterialer, med potensial for distribusjon utenfor laboratoriet.

Introduction

Syntetisk biologi integrerer ulike ingeniørdisipliner for å designe og konstruere biologisk baserte deler, enheter og systemer som kan utføre funksjoner som ikke finnes i naturen. De fleste syntetiske biologiske tilnærminger er fortsatt bundet til levende celler. I motsetning til dette muliggjør cellefrie syntetiske biologiske systemer enestående nivåer av kontroll og frihet i design, noe som muliggjør økt fleksibilitet og forkortet tid for ingeniørbiologiske systemer, samtidig som mange av begrensningene i tradisjonelle cellebaserte genuttrykksmetoderelimineres 1,2,3. CFPS brukes i et økende antall applikasjoner på tvers av mange disipliner, inkludert konstruksjon av kunstige celler, prototyping av genetiske kretser, utvikling av biosensorer og produksjon av metabolitter 4,5,6. CFPS har også vært spesielt nyttig for å produsere rekombinante proteiner som ikke lett kan uttrykkes i levende celler, slik som aggregeringsutsatte proteiner, transmembranproteiner og giftige proteiner 6,7,8.

CFPS utføres vanligvis i væskereaksjoner. Dette kan imidlertid begrense distribusjonen i noen situasjoner, da enhver flytende cellefri enhet må være inneholdt i et reaksjonsbeholder. Begrunnelsen for utviklingen av metodene som ble presentert her var å gi robuste protokoller for å legge inn cellefrie syntetiske biologiske enheter i hydrogeler, ikke som en proteinproduksjonsplattform i seg selv, men i stedet for å tillate bruk av hydrogeler som et fysisk chassis for distribusjon av cellefrie enheter utenfor laboratoriet. Bruken av hydrogeler som CFPS-chassis har flere fordeler. Hydrogeler er polymere materialer som, til tross for et høyt vanninnhold (noen ganger over 98%), har faste egenskaper 9,10,11. De har bruksområder som pastaer, smøremidler og lim og er til stede i produkter så forskjellige som kontaktlinser, sårbandasjer, marine limbånd, jordforbedringsmidler og babybleier 9,11,12,13,14. Hydrogeler er også under aktiv etterforskning som legemiddelleveringsbiler 9,15,16,17. Hydrogeler kan også være biokompatible, biologisk nedbrytbare og ha noen stimuliresponser av seg selv 9,18,19,20. Derfor er målet her å skape en synergi mellom molekylærbiologisk avledet funksjonalitet og materialvitenskap. For dette formål har det blitt gjort anstrengelser for å integrere cellefri syntetisk biologi med en rekke materialer, inkludert kollagen, laponitt, polyakrylamid, fibrin, PEG-peptid og agarose 11,21,22, samt å belegge overflater av glass, papir og klut 11,23,24 med CFPS-enheter. Protokollene som presenteres her demonstrerer to metoder for å legge inn CFPS-reaksjoner i makroskala (dvs. >1 mm) hydrogelmatriser, ved bruk av agarose som eksemplarmateriale. Agarose ble valgt på grunn av sin høye vannabsorpsjonskapasitet, kontrollerte selvgelerende egenskaper og justerbare mekaniske egenskaper 11,24,25,26. Agarose støtter også funksjonell CFPS, er billigere enn mange andre hydrogelalternativer, og er biologisk nedbrytbar, noe som gjør det til et attraktivt valg som et eksperimentelt modellsystem. Disse metodene har imidlertid tidligere blitt vist som hensiktsmessige for å legge inn CFPS i en rekke alternative hydrogeler11. Med tanke på det brede spekteret av anvendelser av hydrogeler og funksjonaliteten til CFPS, kan metodene som er demonstrert her, gi grunnlag for at forskere kan utvikle biologisk forbedrede hydrogelmaterialer som passer til sine egne ender.

I tidligere studier har mikrogelsystemer med et størrelsesområde på 1 μm til 400 μm blitt brukt til å utføre CFPS i hydrogeler nedsenket i reaksjonsbuffer 23,27,28,29,30,31. Kravet om å senke hydrogeler i CFPS-reaksjonsbuffere begrenser imidlertid mulighetene for distribusjon som materialer i seg selv. Protokollene som presenteres her tillater CFPS-reaksjoner å forekomme i hydrogeler uten behov for å senke gelene i reaksjonsbuffere. For det andre tillater bruken av makroskala geler (mellom 2 mm og 10 mm i størrelse) studiet av den fysiske interaksjonen mellom hydrogeler og cellefritt genuttrykk. For eksempel, med denne teknikken, er det mulig å studere hvordan hydrogelmatrisen påvirker CFPS-reaksjoner11 og hvordan CFPS-reaksjoner kan påvirke hydrogelmatrisen31. Større størrelser hydrogeler tillater også utvikling av nye, bioprogrammerbare materialer32. Til slutt, ved å legge inn CFPS-reaksjoner i hydrogeler, er det også en potensiell reduksjon i kravet til plastreaksjonsbeholdere. For utplassering av cellefrie sensorer har dette klare fordeler i forhold til enheter som er avhengige av plastvarer. Samlet gir innebygging av CFPS-reaksjoner i hydrogeler flere fordeler for distribusjon av cellefrie enheter utenfor laboratoriet.

Det overordnede målet med metodene som presenteres her er å tillate drift av CFPS-reaksjoner i hydrogelmatriser. To forskjellige metoder er demonstrert for å legge inn cellefrie proteinproduksjonsreaksjoner i makroskala hydrogelmaterialer (figur 1). I metode A blir CFPS-komponenter introdusert til lyofiliserte agarosehydrogeler for å danne et aktivt system. I metode B blandes smeltet agarose med CFPS-reaksjonskomponenter for å danne et komplett CFPS-hydrogelsystem, som deretter frysetørkes og lagres til det trengs. Disse systemene kan rehydreres med et volum vann eller buffer og analyt for å starte reaksjonen.

Denne studien bruker Escherichia coli-cellelysatbaserte systemer. Dette er noen av de mest populære eksperimentelle CFPS-systemene, da E. coli-cellelysatpreparasjon er enkel, billig og oppnår høye proteinutbytter. Cellelysatet kompletteres med de makromolekylære komponentene som trengs for å utføre transkripsjon og oversettelse, inkludert ribosomer, tRNAer, aminoacyl-tRNA-syntetaser og initierings-, forlengelses- og termineringsfaktorer. Spesielt demonstrerer dette papiret produksjonen av eGFP og mCherry i agarosehydrogeler ved bruk av E. coli-cellelysater og overvåker utseendet av fluorescens ved hjelp av en plateleser og konfokalmikroskopi. Representative resultater for mikrotiterplateleseren kan ses i Whitfield et al.31, og de underliggende dataene er offentlig tilgjengelige 33. Videre bekreftes ekspresjonen av fluorescerende proteiner gjennom gelene ved bruk av konfokal mikroskopi. De to protokollene demonstrert i dette papiret tillater montering og lagring av CFPS-baserte genetiske enheter i materia med det endelige målet å skape et passende fysisk miljø for distribusjon av cellefrie genkretser på en måte som støtter feltdistribusjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellelysatbuffer og mediepreparasjon

  1. Fremstilling av 2x YT+P-agar og medium
    1. Forbered 2x YT+P-agar ved å måle ut 16 g/L trypton, 10 g/L gjærekstrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K2 HPO 4,22ml/L 1 MKH 2PO4 og 15 g/L agar. For 2x YT + P buljong, følg forrige sammensetning, men utelat agar.
    2. Steriliser ved å autoklavere 2x YT+P.
  2. Klargjøring av S30A-bufferen
    1. Forbered S30A-bufferen med 5,88 g / l Mg-glutamat, 12,195 g / L K-glutamat og 25 ml / L 2 M Tris, justert til pH 7,7 med eddiksyre.
    2. Oppbevar S30A-bufferen ved 4 °C i opptil 1 uke.
  3. Klargjøring av S30B-bufferen
    1. Klargjør S30B-bufferen med 5,88 g/l Mg-glutamat og 12,195 g/L K-glutamat, justert til pH 8,2 med 2 M Tris.
    2. Oppbevar S30B-bufferen ved 4 °C i opptil 1 uke.

2. Cellelysatpreparering (4 dagers protokoll)

  1. Dag 1
    1. Hell 2x YT+P i agarplater supplert med 100 μg/ml ampicillin.
    2. Strek E. coli fra −80 °C glyserollager, og rug over natten ved 37 °C.
  2. Dag 2
    1. Inokuler en enkelt koloni fra 2x YT + P-platen til 400 ml 2x YT + P-buljong (supplert med ampicillin) i en 1 L forvirret kolbe.
    2. Inkuber i 24 timer ved 37 °C med risting ved 220 o/min.
  3. Dag 3
    1. Mål og registrer OD600 av de 24 h-kulturene; veksten er tilstrekkelig ved en OD600 på 3-4.
      MERK: Ta en 1 ml alikot bakteriekultur, og utfør en seriell fortynning med medium (2x YT+P-buljong) før du måler OD600 nm. Ta høyde for fortynningseffekten ved beregning av OD600.
    2. Overfør kulturen jevnt mellom ferdigkjølte 500 ml sentrifugeflasker.
    3. Sentrifuge ved 4 500 x g i 15 minutter ved 4 °C, og kast deretter supernatanten.
    4. Mens du sentrifugerer, fullfør S30A-bufferklargjøringen ved å tilsette 2 ml/l 1 M DTT til den tidligere preparerte S30A-bufferen, blande og opprettholde bufferen på is.
    5. Resuspender cellepelletsene i 200 ml S30A-buffer.
    6. Virv flaskene kraftig til hele pelleten er fullstendig solubilisert, og hold cellene på is så mye som mulig.
    7. Sentrifuge ved 4 500 x g i 15 minutter ved 4 °C, og kast deretter supernatanten.
    8. Gjenta trinn 2.3.5-2.3.7 (inkludert).
    9. Tilsett 40 ml S30A-buffer til hver sentrifugeflaske, resuspender pelletsene og overfør til forhåndsveide 50 ml sentrifugerør.
    10. Sentrifuge ved 4000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten ved å dekantere, og fjern den gjenværende supernatanten med pipette, og hold den på is så mye som mulig.
    11. Vei sentrifugerørene på nytt, registrer den nye massen og beregn massen av pellets.
    12. Flashfrys pellets i flytende nitrogen, og oppbevar dem ved -80 °C.
  4. Dag 4
    1. Tine pellets på is.
    2. Per 1 g pellet, tilsett følgende: 1,2 ml S30A-buffer (DTT tilsatt før bruk), 275 μL proteasehemmer (8 mM stamløsning) og 25 μL lysozym (10 mg/ml stam).
    3. Virvel kraftig til pellets er fullstendig oppløselig uten gjenværende klumper, og hold dem på is så mye som mulig.
    4. I 50 ml sentrifugerør, sonikere cellesuspensjonene ved 120 W, 20 kHz, 30% amplitude og 20 s / 40 s på / av pulser i 5 min av sonikering.
    5. Sentrifuge ved 4000 x g i 1 time ved 4 °C for å pelletere celleavfallet.
    6. Overfør supernatanten til friske 50 ml sentrifugerør.
    7. Inkuber rør ved 37 °C ved 220 o / min i 80 minutter.
    8. Forbered dialysematerialer ved å tilsette 1 ml/l 1 M DTT til S30B-buffer. Bland og tilsett 900 ml til et 1 l sterilt beger. Tilsett en magnetomrører, og hold den ved 4 °C.
    9. Etter avrenningsreaksjonen overføres celleekstraktet fra trinn 2.4.7 til 2 ml mikrosentrifugerør og sentrifuge ved 20 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    10. Konsolider den pelletsfrie supernatanten på is i et 50 ml sentrifugerør.
    11. Bestem det totale volumet av produsert celleekstrakt, og hydratiser det nødvendige antallet 10K MWCO dialysekassetter ved å senke dem i S30B i 2 minutter.
    12. Legg kassettene via en sprøyte med opptil 3 ml ekstrakt. Dialyser opptil tre kassetter per 1 l beger, rør ved 4 °C i 3 timer.
    13. Etter at dialysen er fullført, noe som klargjør ekstraktet, overfør ekstraktet til 2 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 20 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    14. Konsolider det klargjorte ekstraktet i et friskt sentrifugerør på is, og virvel kort for å blande.
    15. Bestem proteinkonsentrasjonen av ekstraktet ved hjelp av et fluorometer.
    16. Fortynn ekstrakten til en konsentrasjon på 44,5 mg/ml med forkjølt ddH2O.
    17. Aliquot i 200 μL alikoter, flash-fryse i flytende nitrogen, og lagre ved -80 ° C.

3. Fremstilling av lyofiliserte hydrogeler (metode A)

  1. Vei 0,75 g agarose, tilsett ddH2O til et volum på 100 ml, og mikrobølgeovn i 30 s sprekker ved høye temperaturer for å skape smeltet agaroselager.
  2. Bruk en pipette til å overføre 50 μL smeltet agarose til et 1,5 ml mikrosentrifugerør, og la gelen polymerisere i 20-30 minutter (polymerisering skjer raskere hvis gelene overføres til kjøleskap).
  3. Flash-fryse mikrosentrifugerørene, som inneholder polymeriserte geler, i flytende nitrogen.
  4. Fjern lokket på sentrifugerørene, dekk sentrifugerøråpningene med voksfilm og stikk hull i filmen flere ganger med en nål- eller pipettespiss.
  5. Overfør mikrosentrifugerørene som inneholder polymeriserte geler til -80 ° C lagring i 1-2 timer.
  6. Gjenvinn sentrifugerørene fra -80 ° C lagring, og sett i en frysetørker, slik at rørene er helt tørre.
  7. Koble til frysetørkeren med følgende innstillinger: temperatur: -20 °C, trykk: 0,1 mbar.
  8. La gelen frysetørke over natten.
  9. Gjenvinn geleene fra frysetørkeren, og legg dem i -80 °C oppbevaring til det er nødvendig.
    MERK: Geler kan oppbevares frysetørket i opptil 1 år.

4. Klargjøring av 14x lageret av energiløsninger

  1. Kombiner alle reaksjonskomponentene (tabell 1) i et 15 ml sentrifugerør på is for å produsere en 14x energiløsning.
  2. Aliquot 14x energioppløsningen i 1,5 ml mikrosentrifugerør, og oppbevar ved -80 °C (mindre volum alikoter kan brukes).
    MERK: 14x energioppløsningen kan lagres i flere måneder ved -80 °C hvis gjentatt frysetining av rørene unngås.

5. Fremstilling av 4x aminosyrestammen

  1. Tin, på is, alle 20 aminosyrekomponenter i et RTS Amino Acid Sampler kit. Vortex aminosyrene for å sikre at de er helt oppløst.
  2. I et 50 ml sentrifugerør, kombiner alle 20 aminosyrene, og tilsett 12 ml steril ddH2O. Vortex til løsningen blir klar, med bare en liten tåke av hvit farge.
  3. Aliquot de 4x aminosyrene i 1,5 ml mikrosentrifugerør (500 μL alikoter).
  4. Flashfrys 4x aminosyreoppløsningsalikotene i flytende nitrogen, og flytt alikotene til -80 °C lagring.

6. Kalibrering av cellefri buffer

MERK: CFPS-bufferen som ble brukt til hydrogelreaksjonene ble kalibrert for optimale DTT-, Mg-glutamat- og K-glutamatkonsentrasjoner etter protokollen i Banks et al.34 modifisert fra Sun et al.35. Kalibreringsreaksjonssammensetningene ble valgt ved hjelp av eksperimentmetoden (DOE), med syv faktornivåer valgt for K-glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1,000 mM, 1,200 mM, 1,400 mM), Mg-glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) og DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) aksjer. JMP Pro 15 ble brukt til å generere et tilpasset DOE-design (tabell 2) og gjennomføre analysen for å bestemme de optimale faktorkonsentrasjonene.

  1. Gjenvinn det cellefrie ekstraktet fra -80 °C lagring, og tine på is.
  2. Tine 4x aminosyrer, 14x energiløsning, 40% PEG-8000, plasmid DNA, 3 M K-glutamat, 100 mM Mg-glutamat og 100 mM DTT aksjer på is.
  3. Lag en kalibreringsmasterblanding ved å kombinere 12,5 μL av 4x aminosyrene, 3,57 μL av 14x energiløsningen, 2,5 μL 40% PEG-8000, 3 μg plasmid-DNA og 10 μL cellefritt ekstrakt (44,5 mg / ml), og bland opptil 35 μL per reaksjon med ddH2O.
  4. Fordel 35 μL masterblanding i brønnene på en svart 384-brønns mikrotiterplate.
  5. Etter DOE-designet, tilsett riktig volum Mg-glutamat, K-glutamat og DTT til hver reaksjon, sammen med ddH2O for å gjøre hver reaksjon opp til 50 μL.
  6. Overfør mikrotiterplaten til en plateleser for fluorescensdeteksjon og analyse ved hjelp av plateleserinnstillingene beskrevet (for mCherry): eksitasjon: 587 nm, utslipp: 610 nm, bølgelengdebåndbredde: 12 nm, optikk: topp, temperatur: 37 ° C, med fluorescensavlesninger som samles hvert 5. minutt i 4 timer av total lesetid. Inkuber platene med risting på en pulserende innstilling ved 60 o / min.
  7. Last opp resultatene til JMP DOE-designet, og generer en prediksjonsprofil for å bestemme de optimale konsentrasjonsnivåene for K-glutamat, Mg-glutamat og DTT basert på ønskede responsvariabler; I dette tilfellet var maksimal fluorescens og reaksjonshastighet responsvariablene.
  8. Kombiner reagensene som vist i tabell 3 for å opprette 2X CFPS-bufferen
  9. Aliquot og oppbevares ved -80 °C

7. CFPS i rehydrerte lyofiliserte hydrogeler (metode A)

MERK: Plasmidene som ble brukt i CFPS-reaksjonene ble opprettet ved hjelp av komponenter fra EcoFlex modulære verktøysett for E. coli36 og beskrevet i Whitfield et al.11 mCherry og eGFP var under kontroll av den konstitutive JM23100 promotoren. Disse komponentene er tilgjengelige fra Addgene.

  1. Gjenvinn det cellefrie ekstraktet fra -80 °C lagring, og tine på is i ca. 20 minutter.
  2. Samle 2x CFPS-bufferen og plasmid-DNA, og tine på is.
  3. Samle de frysetørkede hydrogelene, og la dem nå romtemperatur i 15 minutter ved å la gelene stå på benken.
  4. Overfør gelene til 1,5 ml mikrosentrifugerør, trim gelene med en skalpell om nødvendig for å få dem til å passe i brønnene.
  5. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør kombinerer du 10 μL cellefritt ekstrakt med 25 μL 2x CFPS-buffer og 4 μg plasmid-DNA; utgjør et totalt volum på 50 μL med ddH2O for å lage CFPS-løsningen.
  6. Pipetter CFPS-oppløsningen på frysetørkede hydrogeler.
  7. La gelene trekke i CFPS-systemet i 5-10 min ved romtemperatur.
  8. Overfør gelene til en svart 384-brønns mikrotiterplate ved hjelp av en slikkepott.
  9. Overfør mikrotiterplaten til en plateleser for fluorescensdeteksjon og analyse ved hjelp av plateleserinnstillingene beskrevet i trinn 6.6. Representative resultater foreligger i tidligere studier31,33.

8. Cellefri proteinsyntese i deployerbare hydrogeler (metode B)

  1. Gjenvinn cellefritt ekstrakt fra -80 °C lagring, og tine på is i ca. 20 minutter.
  2. Samle plasmid-DNA, og tine på is.
  3. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør på is, kombiner 10 μL cellefritt ekstrakt med 3 μg plasmid-DNA og 25 μL 2x CFPS-buffer, noe som utgjør et totalt volum på 37,5 μL.
  4. Mål 3 g agarose, og tilsett til 100 ml ddH2O buffer for å lage 3% agarose.
  5. Mikrobølgeovn 3% agarose i 30 s brister med høy effekt.
  6. Pipette 12,5 μl smeltet agarose i 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende CFPS-blanding til et totalt volum på 50 μL.
  7. La den smeltede agarose avkjøles, men ikke polymeriseres, og la agarose ligge i en varmeblokk satt til 50 °C.
  8. Kombiner den smeltede agarose med CFPS-løsningen; Bland via pipettering og omrøring med spissen, og sørg for å bevege deg raskt for å unngå gelpolymerisering før CFPS-løsningen kan blandes inn.
  9. La gelene avkjøles ved romtemperatur og polymeriser i ca. 2 minutter.
  10. Overfør den polymeriserte agarose til 1,5 ml mikrosentrifugerør med en slikkepott, og flash-fryse i flytende nitrogen.
  11. Sett de flashfrosne hydrogelene i -80 ° C lagring i 1 time.
  12. Gjenopprett gelene fra lagring; Fjern mikrosentrifugerørlokkene, dekk rørene med voksfilm og stikk hull i filmen slik at fuktigheten tørkes av.
  13. Koble til frysetørkeren med følgende innstillinger: temperatur: -20 °C, trykk: 0,1 mbar, frysetørking i 18 timer (over natten).
  14. Oppbevar frysetørkede CFPS-enheter i -80 °C oppbevaring til bruk.
  15. De frysetørkede CFPS-enhetene, med et omtrentlig våtvolum på 50 μL, kan rehydreres med 50 μL ddH2O uten overflødig væske. Rehydrering tar ca 30 min.
  16. Overfør gelene til en svart 384-brønns mikrotiterplate ved hjelp av en slikkepott.
  17. Overfør mikrotiterplaten til en plateleser for fluorescensdeteksjon og analyse ved hjelp av plateleserinnstillingene beskrevet i trinn 6.6. Representative resultater foreligger i tidligere publikasjoner31,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver to metoder for å legge inn CFPS-reaksjoner i hydrogelmatriser, med figur 1 som presenterer en skjematisk oversikt over de to tilnærmingene. Begge metodene er egnet til frysetørking og langtidslagring. Metode A er den mest brukte metodikken av to grunner. For det første har det vist seg å være den mest anvendelige metoden for arbeid med en rekke hydrogelmaterialer11. For det andre tillater metode A parallell testing av genetiske konstruksjoner. Metode B er mer hensiktsmessig for fabrikasjon av et optimalisert system- og feltdistribusjon. Begge protokollene tillater at mange prøver utarbeides på en gang for å hjelpe til med eksperimentell reproduserbarhet. Denne funksjonen er også nyttig for den langsiktige utviklingen av teknologien, da frysetørkede enheter kan sendes i tørr tilstand og rekonstitueres på stedet ved behov.

Tilnærmingen som er skissert i protokollen og figur 1 kan brukes til ekspresjon av enkeltgenkonstruksjoner eller for samekspresjon av flere gener. Dataene presentert i figur 2 viser uttrykket av både eGFP og mCherry i en 0,75% agarosegel. Konfokalmikroskopi ble brukt til å bekrefte at proteinekspresjonen var homogen gjennom hydrogelen, inkludert i de indre planene. Spesielt var proteinsyntese ikke begrenset til hydrogelens ytre kanter, og intern fluorescens var ikke et resultat av proteindiffusjon. For å bekrefte dette, ved å plassere en eGFP-uttrykkende hydrogel i fysisk kontakt med en mCherry-uttrykkende hydrogel, var det mulig å se proteindiffusjon fra en hydrogel til en annen. Diffusjonshastigheten mellom de to var utilstrekkelig til å forklare den omfattende lokaliseringen av enten rød eller grønn fluorescens inne i materialet. Dette eksperimentet illustrerer også en viktig fordel ved å distribuere cellefrie enheter i hydrogeler - enhetens funksjonalitet kan organiseres romlig på en måte som ikke er mulig i flytende cellefrie reaksjoner. I tillegg, for å skape gennettverk, er samtidig syntese av mer enn et enkelt genprodukt nødvendig. Resultatene vist i figur 2 (nederste rad) bekreftet samtidig uttrykk av både mCherry og eGFP i agarose. I dette arbeidet ble begge proteinene uttrykt, og det var ingen romlig konkurranse mellom proteinene. Igjen demonstrerer et overlegg av det røde og grønne bølgelengdeområdet den jevne romlige fordelingen av begge proteinene i hydrogelen.

Tabell 1: Aksjene i 14x energiløsninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Design av et eksperimentelt array for optimalisering av DTT, Mg-glutamat og K-glutamat i de cellefrie proteinsyntesereaksjonene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: 2x CFPS-bufferkomponenter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av de to protokollene. I den første metoden (metode A, demonstrert i dette papiret) fremstilles hydrogelmaterialer først og frysetørkes deretter (trinn 1) uten cellefrie komponenter. Disse tørkede hydrogelene kan lagres og rekonstitueres ved behov (trinn 2) med riktig volum av cellefri reaksjon før inkubasjon for proteinproduksjon (trinn 3) Variantmetoden, metode B, inkorporerer alle eller noen av de cellefrie reaksjonskomponentene i den første hydrogelfabrikasjonen. Etter frysetørking (trinn 1) kan hydrogelene rekonstitueres i vann alene eller i buffer som inneholder en analytt av interesse (trinn 2). Proteinproduksjonen (trinn 3) fortsetter som før. En tredje metode, der frysetørkede cellefrie komponenter rekonstitueres med hydrogelpolymerer, er beskrevet i Whitfield et al.11 , men har funnet bruk med bare et begrenset antall hydrogeler til dags dato. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Cellefri proteinsyntese av eGFP og mCherry i en hydrogel ved bruk av E. coli-cellelysater. Agarosegeler (0,75 %) ble fremstilt uten DNA-mal (øverst) med 4 μg av verken eGFP eller mCherry-mal (midten) eller med 4 μg av både eGFP og mCherry-mal (nederst). Hydrogelene ble inkubert i 4 timer før konfokalmikroskopi i de røde og grønne kanalene. Et overlegg av de to kanalene vises også, og overlegget inkluderer DIC-bildet (differensiell interferenskontrast). Hydrogeler inneholdende enten eGFP eller mCherry mal ble fremstilt separat, men inkubert i fysisk kontakt med hverandre. Geldiameteren er 6 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Skissert her er to protokoller for inkorporering av E. coli-cellelysatbaserte CFPS-reaksjoner i agarosehydrogeler . Disse metodene tillater samtidig genuttrykk gjennom hele materialet. Protokollen kan tilpasses for andre CFPS-systemer og har blitt utført med kommersielt tilgjengelige CFPS-sett i tillegg til de laboratoriepreparerte cellelysatene som er beskrevet her. Det er viktig at protokollen tillater genuttrykk i fravær av en ekstern væskefase. Dette betyr at systemet er selvstendig og ikke krever et cellefritt reaksjonsbad. Til forskjell fra tidligere metoder der CFPS-reaksjoner forekom i hydrogeler, fjernes kravet til eksterne buffere og reaksjonsbeholdere med denne metoden. Det forventes at disse metodene vil tillate forskere å utforske bruken av hydrogelmaterialer som chassis for cellefrie syntetiske biologiske enheter, og til slutt gi en rute for å flytte slike enheter ut av laboratoriet.

Kritisk for suksessen til begge tilnærmingene er bruken av høykvalitets cellelysater. Et cellelysat av høy kvalitet bør ha en høy proteinkonsentrasjon (>40 mg/ml), bør holdes kaldt så lenge preparatet varer, og bør ikke ha gjennomgått gjentatte fryse-tine-sykluser. I tillegg er det kritisk at DNA-malene har høy renhet. For å oppnå dette, bør plasmider ekstraheres fra celler ved hjelp av et plasmidpreparatsett med høy renhet med høy renhet for transkripsjonsreaksjoner for å fortsette i CFPS-miljøet. Disse kritiske stadiene er felles for alle CFPS-applikasjoner og er ikke unike for denne metoden. Ikke desto mindre er det utarbeidelsen av CFPS-komponenter som har størst innvirkning på effektiviteten til protokollene. Når det gjelder materialene, må effektiv, rask frysetørking av hydrogelene oppnås. Hvis frysetørkeren ikke når en tilstrekkelig kald temperatur (under -45 °C), vil gelen bli tørket i stedet for frysetørket, noe som kan kompromittere den indre strukturen til hydrogelmatrisen og kan forårsake nedbrytning av de innebygde CFPS-systemene. Metode B har også en unik bekymring; Spesielt når man tilsetter CFPS-blandingen til den smeltede agarose for å danne gelen, må den smeltede agarosen avkjøles tilstrekkelig før CFPS-blandingen tilsettes for å forhindre termisk nedbrytning til CFPS-reaksjonene. Å la agarose avkjøles for mye vil imidlertid resultere i polymerisering av gelen og forhindre tilsetning av CFPS-systemet. Endelig har hydrogeler en grad av autofluorescens, noe som kan komme i konflikt med fluorescenssignalene som genereres under CFPS-reaksjonene. Det er derfor viktig å inkludere passende negative kontroller og genetiske rapporterere som ikke har de samme fluorescensegenskapene som materialet.

Protokollene som er demonstrert her sentrerer seg om bruken av agarose som en modellhydrogel. Agarose er et utmerket modellsystem for dette arbeidet, da det er allment tilgjengelig, billig og demonstrerer gode proteinproduksjonsevner. Tidligere undersøkelser har også vist at agarose kan være en erstatning for trengningsmiddelet PEG i CFPS-reaksjoner, noe som indikerer at interaksjonene mellom polymerchassiset og CFPS-reaksjonene kan øke proteinproduksjonen11. Disse metodene er imidlertid også egnet til modifikasjoner ved hjelp av et bredt spekter av alternative hydrogelmatriser med varierende fysiske og kjemiske egenskaper. Metoden har blitt brukt på xantangummi, alginat, acylgellangummi, polyakrylamid, hyaluronsyrehydrogeler og poloksamergelene F-108 og F-1279. I noen scenarier observeres redusert proteinproduksjon sammenlignet med væskekontroller eller andre hydrogeler. Likevel, i disse scenariene, kan en avveining oppfylles, der funksjonaliteten til selve materialet (f.eks. dets klebende egenskaper eller biokompatibilitet) er av betydelig fordel, slik at en reduksjon i proteinproduksjonen kan aksepteres. Modifikasjoner av konsentrasjonene av hydrogelene kan også gjøres. For agarose er metodene egnet til polymerkonsentrasjoner i området 0, 5% -1, 5% w / v, for eksempel. En høyere gelkonsentrasjon resulterer vanligvis, i materiell forstand, i en mer robust enhet som er mer motstandsdyktig mot håndtering og bedre bevarer CFPS-reaksjonen innenfor. Avveiningen med økt gelkonsentrasjon er imidlertid at reaksjonen kan ha redusert produksjonshastighet eller proteinutbytte11,37. Forholdet mellom polymerkonsentrasjonen og proteinproduksjonen er imidlertid ikke lineært og varierer avhengig av hydrogelen som brukes11. Som sådan, for enhver ny hydrogelpolymer, er det nødvendig med en viss eksperimentering for å balansere materialfunksjonalitet mot cellefri funksjonalitet.

Innebygging av CFPS-reaksjoner i hydrogelmaterialer uten behov for eksterne buffere representerer en interessant rute for distribusjon av cellefrie enheter. Cellefrie enheter har fordelen av å fjerne behovet for utslipp av genetisk konstruerte organismer utenfor et kontrollert laboratoriemiljø. I tillegg fjerner innebygging av reaksjoner i hydrogeler behovet for reaksjonsbeholdere (typisk plastikk) etter rekonstituering. Gitt at mange hydrogeler er biologisk nedbrytbare, gir dette en potensiell rute for å redusere plastavfall. På samme måte viser protokollen som er beskrevet her, også at både hydrogel og CFPS er egnet til frysetørking. Mens gjentatte sykluser av lyofilisering ikke anbefales, og vil trolig skade CFPS og hydrogel funksjon, for engangsbruk enheter. Muligheten til å frysetørke og rekonstituere komponentene reduserer enhetens vekt og fjerner behovet for kjølekjede under transport. Disse egenskapene forenkler til slutt logistikken og reduserer transportkostnadene for enhetene. Videre har hydrogeler mange nyttige funksjonelle egenskaper av seg selv; For eksempel kan de fungere som pastaer, smøremidler og lim. Hydrogeler kan også være biokompatible, biologisk nedbrytbare og ha stimuli-responser i seg selv. Til sammen kan en synergi oppnås mellom biologisk funksjonalitet og materialvitenskap for å skape en ny klasse bioprogrammerbare materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner i stor grad støtten fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council awards BB / V017551 / 1 (S.K., T.P.H.) og BB / W01095X / 1 (AL, TPH), og Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories award EP / N026683 / 1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Data som støtter denne publikasjonen er åpent tilgjengelig på: 10.25405/data.ncl.22232452. For åpen tilgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY)-lisens på enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

Tags

Biologi utgave 196 Cellefri proteinsyntese CFPS syntetisk biologi syntetiske gennettverk hydrogeler biosensorer genuttrykk proteinuttrykk
Metoder for å legge inn cellefrie proteinsyntesereaksjoner i makroskala hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kavil, S., Laverick, A., Whitfield,… More

Kavil, S., Laverick, A., Whitfield, C. J., Banks, A. M., Howard, T. P. Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels. J. Vis. Exp. (196), e65500, doi:10.3791/65500 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter