Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Методы встраивания реакций синтеза внеклеточных белков в гидрогели макромасштаба

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

В данной работе мы представляем два протокола для встраивания внеклеточных реакций синтеза белка в макромасштабные гидрогелевые матрицы без необходимости использования внешней жидкой фазы.

Abstract

Синтетические генные сети предоставляют ученым и инженерам платформу для проектирования и создания новых систем с функциональностью, закодированной на генетическом уровне. В то время как доминирующей парадигмой развертывания генных сетей является клеточное шасси, синтетические генные сети также могут быть развернуты в бесклеточной среде. Многообещающие области применения внеклеточных генных сетей включают биосенсоры, поскольку эти устройства были продемонстрированы против биотических (вирусы Эбола, Зика и SARS-CoV-2) и абиотических (тяжелые металлы, сульфиды, пестициды и другие органические загрязнители) мишеней. Бесклеточные системы, как правило, развертываются в жидкой форме в реакционном сосуде. Однако возможность встраивания таких реакций в физическую матрицу может способствовать их более широкому применению в более широком наборе сред. С этой целью разработаны методы встраивания реакций бесклеточного синтеза белка (CFPS) в различные гидрогелевые матрицы. Одним из ключевых свойств гидрогелей, способствующих этой работе, является высокая водовосстанавливающая способность гидрогелевых материалов. Кроме того, гидрогели обладают физическими и химическими характеристиками, которые являются функционально полезными. Гидрогели можно сублимировать для хранения и регидратировать для последующего использования. Представлены два пошаговых протокола включения и анализа реакций CFPS в гидрогелях. Во-первых, система CFPS может быть включена в гидрогель путем регидратации клеточным лизатом. Затем система внутри гидрогеля может быть индуцирована или экспрессирована конститутивно для полной экспрессии белка через гидрогель. Во-вторых, клеточный лизат может быть введен в гидрогель в точке полимеризации, а вся система может быть сублимирована и регидратирована в более поздней точке с помощью водного раствора, содержащего индуктор для системы экспрессии, закодированной в гидрогеле. Эти методы потенциально позволяют создавать бесклеточные генные сети, которые наделяют гидрогелевые материалы сенсорными способностями, с потенциалом использования за пределами лаборатории.

Introduction

Синтетическая биология объединяет различные инженерные дисциплины для проектирования и конструирования биологически обоснованных деталей, устройств и систем, которые могут выполнять функции, не встречающиеся в природе. Большинство подходов синтетической биологии по-прежнему привязаны к живым клеткам. В отличие от них, бесклеточные системы синтетической биологии обеспечивают беспрецедентный уровень контроля и свободы в проектировании, обеспечивая большую гибкость и сокращение времени для разработки биологических систем, устраняя при этом многие ограничения, присущие традиционным методам клеточной экспрессии генов 1,2,3. CFPS используется во все большем количестве приложений во многих дисциплинах, включая создание искусственных клеток, прототипирование генетических схем, разработку биосенсоров и производство метаболитов 4,5,6. CFPS также был особенно полезен для получения рекомбинантных белков, которые не могут быть легко экспрессированы в живых клетках, таких как белки, склонные к агрегации, трансмембранные белки и токсичные белки 6,7,8.

CFPS обычно выполняется в жидких реакциях. Это, однако, может ограничить их использование в некоторых ситуациях, поскольку любое жидкое бесклеточное устройство должно содержаться в реакционном сосуде. Обоснование разработки методов, представленных здесь, заключалось в том, чтобы обеспечить надежные протоколы для встраивания бесклеточных синтетических биологических устройств в гидрогели, не в качестве платформы для производства белка как таковой, а вместо этого позволить использовать гидрогели в качестве физического шасси для развертывания бесклеточных устройств за пределами лаборатории. Использование гидрогелей в качестве шасси CFPS имеет ряд преимуществ. Гидрогели – это полимерные материалы, которые, несмотря на высокое содержание воды (иногда превышающее 98%), обладают твердыми свойствами 9,10,11. Они используются в качестве паст, смазочных материалов и клеев и присутствуют в таких разнообразных продуктах, как контактные линзы, повязки для ран, морские клейкие ленты, улучшители почвы и детские подгузники 9,11,12,13,14. Гидрогели также активно исследуются в качестве средств доставки лекарств 9,15,16,17. Гидрогели также могут быть биосовместимыми, биоразлагаемыми и обладать некоторыми собственными реакциями на стимулы 9,18,19,20. Таким образом, цель состоит в том, чтобы создать синергию между функциональностью, основанной на молекулярной биологии, и материаловедением. С этой целью были предприняты усилия по интеграции бесклеточной синтетической биологии с целым рядом материалов, включая коллаген, лапонит, полиакриламид, фибрин, ПЭГ-пептид и агарозу 11,21,22, а также для покрытия поверхностей из стекла, бумаги и ткани 11,23,24 с устройствами CFPS. Представленные здесь протоколы демонстрируют два метода встраивания реакций CFPS в макромасштабные (т.е. >1 мм) гидрогелевые матрицы с использованием агарозы в качестве образцового материала. Агароза была выбрана из-за ее высокой водопоглощающей способности, контролируемых самогелеобразующих свойств и настраиваемых механических свойств 11,24,25,26. Агароза также поддерживает функциональный CFPS, дешевле, чем многие другие альтернативы гидрогелю, и является биоразлагаемой, что делает ее привлекательным выбором в качестве экспериментальной модельной системы. Однако ранее было продемонстрировано, что эти методы подходят для встраивания CFPS в ряд альтернативных гидрогелей11. Учитывая широкий спектр применения гидрогелей и функциональность CFPS, демонстрируемые здесь методы могут обеспечить основу, на основе которой исследователи смогут разрабатывать биологически улучшенные гидрогелевые материалы, подходящие для их собственных целей.

В предыдущих исследованиях микрогелевые системы с диапазоном размеров от 1 мкм до 400 мкм использовались для выполнения CFPS в гидрогелях, погруженных в реакционный буфер 23,27,28,29,30,31. Однако необходимость погружения гидрогелей в реакционные буферы CFPS ограничивает возможности их использования в качестве самостоятельных материалов. Протоколы, представленные здесь, позволяют проводить реакции CFPS в гидрогелях без необходимости погружения гелей в реакционные буферы. Во-вторых, использование макромасштабных гелей (размером от 2 мм до 10 мм) позволяет изучать физическое взаимодействие между гидрогелями и бесклеточной экспрессией генов. Например, с помощью этого метода можно изучить, как гидрогелевая матрица влияет на реакцииCFPS 11 и как реакции CFPS могут влиять на гидрогелевую матрицу31. Большие размеры гидрогелей также позволяют разрабатывать новые биопрограммируемые материалы32. Наконец, встраивание реакций CFPS в гидрогели также потенциально снижает потребность в пластических реакционных сосудах. Что касается бесклеточных датчиков, это имеет явные преимущества по сравнению с устройствами, зависящими от пластиковой посуды. В совокупности встраивание реакций CFPS в гидрогели дает несколько преимуществ для развертывания бесклеточных устройств за пределами лаборатории.

Общая цель представленных здесь методов состоит в том, чтобы обеспечить протекание реакций CFPS в гидрогелевых матрицах. Продемонстрированы два различных метода встраивания внеклеточных реакций производства белка в гидрогелевые материалы макромасштаба (рис. 1). В методе А компоненты CFPS вводят в лиофилизированные агарозные гидрогели с образованием активной системы. В методе B расплавленная агароза смешивается с компонентами реакции CFPS с образованием полной гидрогелевой системы CFPS, которая затем лиофилизируется и хранится до тех пор, пока не понадобится. Эти системы могут быть регидратированы объемом воды или буфера и аналита, чтобы начать реакцию.

В этом исследовании используются системы на основе лизата клеток Escherichia coli. Это одни из самых популярных экспериментальных систем CFPS, так как приготовление лизата клеток E. coli простое, недорогое и обеспечивает высокий выход белка. Клеточный лизат дополняют макромолекулярными компонентами, необходимыми для выполнения транскрипции и трансляции, включая рибосомы, тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы, а также факторы инициации, элонгации и терминации. В частности, в данной работе демонстрируется продукция eGFP и mCherry в агарозных гидрогелях с использованием лизатов клеток E. coli и отслеживается появление флуоресценции с помощью планшетного ридера и конфокальной микроскопии. Репрезентативные результаты для микротитрового планшета можно увидеть в работе Whitfield et al.31, а исходные данные находятся в открытом доступе 33. Кроме того, экспрессия флуоресцентных белков во всех гелях подтверждается с помощью конфокальной микроскопии. Два протокола, продемонстрированные в этой статье, позволяют собирать и хранить генетические устройства на основе CFPS в материи с конечной целью создания подходящей физической среды для распределения бесклеточных генных схем способом, поддерживающим развертывание в полевых условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клеточный лизатный буфер и подготовка среды

  1. Приготовление 2х YT+P агара и среды
    1. Приготовьте 2x YT+P агар, отмерив 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 40 мл/л 1 М К 2 HPO 4, 22 мл/л 1 М KH2PO4 и 15 г/л агара. Для бульона 2x YT+P следуйте предыдущему составу, но опустите агар.
    2. Стерилизуйте в автоклаве 2x YT+P.
  2. Подготовка буфера S30A
    1. Приготовьте буфер S30A с 5,88 г/л маг-глутамата, 12,195 г/л K-глутамата и 25 мл/л 2 М триса, доведенного до pH 7,7 уксусной кислотой.
    2. Храните буфер S30A при температуре 4 °C до 1 недели.
  3. Подготовка буфера S30B
    1. Приготовьте буфер S30B с 5,88 г/л мг-глутамата и 12,195 г/л K-глутамата, доведенного до pH 8,2 с 2 M Tris.
    2. Храните буфер S30B при температуре 4 °C до 1 недели.

2. Подготовка клеточного лизата (протокол 4 дня)

  1. День 1
    1. Влейте 2x YT+P в агаровые пластины с добавлением 100 мкг/мл ампициллина.
    2. E. coli отделить от глицеринового запаса при −80 °C и инкубировать в течение ночи при 37 °C.
  2. День 2
    1. Инокулируют одну колонию из 2x YT+P планшета в 400 мл 2x YT+P бульона (с добавлением ампициллина) в 1-литровую колбу с перегородкой.
    2. Выдерживать 24 ч при 37 °C при 220 об/мин встряхивание.
  3. День 3
    1. Измерение и регистрация наружного диаметра600 культур за 24 часа; рост достаточен при OD600 3-4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите 1 мл аликвоты бактериальной культуры и выполните серийное разбавление средой (2x бульон YT+P) перед измерением наружного диаметра600 нм. Учитывайте эффект разбавления при расчете наружного диаметра600.
    2. Равномерно перемещайте культуру между предварительно охлажденными центрифужными бутылками объемом 500 мл.
    3. Центрифугу при 4 500 x g в течение 15 мин при 4 °C, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Во время центрифугирования завершите приготовление буфера S30A, добавив 2 мл/л 1 М DTT в ранее приготовленный буфер S30A, перемешивая и выдерживая буфер на льду.
    5. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 200 мл буфера S30A.
    6. Энергично взбалтывайте бутылки до тех пор, пока вся гранула полностью не растворится, максимально удерживая клетки на льду.
    7. Центрифугу при 4 500 x g в течение 15 мин при 4 °C, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
    8. Повторите шаги 2.3.5-2.3.7 (включительно).
    9. Добавьте 40 мл буфера S30A в каждую бутылку центрифуги, повторно суспендируйте гранулы и перелейте в предварительно взвешенные центрифужные пробирки объемом 50 мл.
    10. Центрифуга при 4 000 x g в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, сцедив ее, и удалите остатки надосадочной жидкости пипеткой, держа ее на льду как можно дольше.
    11. Повторно взвесьте центрифужные пробирки, запишите новую массу и рассчитайте массу гранул.
    12. Мгновенную заморозку гранул в жидком азоте и хранение при температуре −80 °C.
  4. День 4
    1. Разморозьте гранулы на льду.
    2. На 1 г гранулы добавляют: 1,2 мл буфера S30A (DTT добавляют перед использованием), 275 мкл ингибитора протеазы (8 мМ стока) и 25 мкл лизоцима (10 мг/мл бульона).
    3. Энергично взбивайте до тех пор, пока гранулы полностью не растворятся без оставшихся комков, держа их на льду как можно дольше.
    4. В центрифужных пробирках объемом 50 мл суспензии клеток с мощностью 120 Вт, 20 кГц, амплитудой 30% и импульсами включения/выключения 20 с/40 с в течение 5 минут ультразвуковой обработки.
    5. Центрифуга при 4 000 x g в течение 1 ч при 4 °C, чтобы гранулировать клеточный мусор.
    6. Перелейте надосадочную жидкость в свежие центрифужные пробирки объемом 50 мл.
    7. Инкубируют пробирки при 37 °C при 220 об/мин в течение 80 мин.
    8. Подготовьте материалы для диализа, добавив 1 мл/л 1 М DTT в буфер S30B. Перемешайте и добавьте 900 мл в стерильный стакан объемом 1 л. Добавьте магнитную мешалку и держите ее при температуре 4 °C.
    9. После реакции стока переносят клеточный экстракт со стадии 2.4.7 в пробирки микроцентрифуги объемом 2 мл и центрифугируют при 20 000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
    10. Закрепите негранулированную надосадочную жидкость на льду в центрифужной пробирке объемом 50 мл.
    11. Определите общий объем произведенного клеточного экстракта и гидратируйте необходимое количество диализных кассет 10K MWCO, погрузив их в S30B на 2 мин.
    12. Загрузите в кассеты через шприц до 3 мл экстракта. Диализируйте до трех кассет на стакан объемом 1 л, перемешивая при 4 °C в течение 3 часов.
    13. После завершения диализа, осветляющего экстракт, переложите экстракт в микроцентрифужные пробирки по 2 мл. Центрифуга при 20 000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
    14. Консолидируйте осветленный экстракт в свежей центрифужной пробирке на льду и кратковременно перемешайте.
    15. Определите концентрацию белка экстракта с помощью флуориметра.
    16. Разбавьте экстракт до концентрации 44,5 мг/мл, используя предварительно охлажденный ddH2O.
    17. Аликвоту на аликвоты по 200 мкл, мгновенную заморозку в жидком азоте и хранение при температуре −80 °C.

3. Приготовление лиофилизированных гидрогелей (Метод А)

  1. Взвесьте 0,75 г агарозы, добавьте ddH2O до объема 100 мл и разогрейте в микроволновой печи в течение 30 с порциями при высоких температурах до образования расплавленной агарозной массы.
  2. С помощью пипетки перелейте 50 мкл расплавленной агарозы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и дайте гелю полимеризоваться в течение 20-30 мин (полимеризация происходит быстрее, если гели перенести в холодильник).
  3. Мгновенную заморозку пробирок микроцентрифуг, содержащих полимеризованные гели, в жидком азоте.
  4. Снимите крышку центрифужных пробирок, закройте отверстия центрифужных пробирок восковой пленкой и несколько раз проткните пленку иглой или наконечником пипетки.
  5. Микроцентрифужные пробирки, содержащие полимеризованные гели, переместить на хранение при температуре −80 °C на 1-2 ч.
  6. Извлеките центрифужные пробирки из хранилища при температуре −80 °C и поместите в сублимационную сушилку, убедившись, что пробирки полностью высохли.
  7. Включите сублимационную сушилку со следующими настройками: температура: −20 °C, давление: 0,1 мбар.
  8. Оставьте гель высыхать на ночь.
  9. Извлеките гели из сублимационной сушилки и поместите их в хранилище при температуре −80 °C до тех пор, пока они не потребуются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гели можно хранить в сублимированном виде до 1 года.

4. Подготовка запаса 14-кратного энергетического раствора

  1. Смешайте все компоненты реакции (таблица 1) в центрифужной пробирке объемом 15 мл на льду, чтобы получить 14-кратный энергетический раствор.
  2. Распределите 14-кратный энергетический раствор в пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл и храните при температуре −80 °C (можно использовать аликвоты меньшего объема).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Энергетический раствор 14x может храниться в течение нескольких месяцев при температуре −80 °C, если избежать повторного замораживания и размораживания труб.

5. Приготовление 4-кратного аминокислотного запаса

  1. Разморозьте на льду все 20 аминокислотных компонентов набора RTS Amino Acid Sampler. Перемешайте аминокислоты, чтобы убедиться, что они полностью растворены.
  2. В центрифужной пробирке объемом 50 мл смешайте все 20 аминокислот и добавьте 12 мл стерильного ddH2O. Vortex до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, с легкой дымкой белого цвета.
  3. Аликвотируют 4 аминокислоты в пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл (аликвоты по 500 мкл).
  4. Мгновенно заморозьте 4 аликвоты раствора аминокислот в жидком азоте и переместите аликвоты в хранилище при температуре −80 °C.

6. Калибровка безячеечного буфера

ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер CFPS, используемый для реакций гидрогеля, был откалиброван для оптимальных концентраций DTT, Mg-глутамата и K-глутамата в соответствии с протоколом Banks et al.34, модифицированным Sun et al.35. Составы калибровочных реакций были выбраны с использованием метода планирования экспериментов (DOE), при этом были выбраны семь факторных уровней для K-глутамата (200 мМ, 400 мМ, 600 мМ, 1000 мМ, 1 200 мМ, 1 400 мМ), Mg-глутамата (0 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ, 50 мМ, 60 мМ) и DTT (0 мМ, 5, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ) запасов. JMP Pro 15 был использован для создания пользовательского проекта DOE (табл. 2) и проведения анализа для определения оптимальных концентраций факторов.

  1. Извлеките бесклеточный экстракт из хранилища при температуре −80 °C и разморозьте на льду.
  2. Разморозьте 4 аминокислоты, 14 калорийный раствор, 40% PEG-8000, плазмидную ДНК, 3 М K-глутамат, 100 мМ Mg-глутамат и 100 мМ DTT запасы на льду.
  3. Создайте калибровочную мастер-смесь, смешав 12,5 мкл 4x аминокислот, 3,57 мкл 14x энергетического раствора, 2,5 мкл 40% PEG-8000, 3 мкг плазмидной ДНК и 10 мкл бесклеточного экстракта (44,5 мг/мл), и получите до 35 мкл на реакцию с ddH2O.
  4. Распределите 35 мкл маточной смеси по лункам черной 384-луночной микротитровой пластины.
  5. В соответствии с дизайном DOE добавьте соответствующий объем Mg-глутамата, K-глутамата и DTT в каждую реакцию вместе с ddH2O, чтобы каждая реакция составила до 50 мкл.
  6. Перенесите планшет с микротитром на планшет для обнаружения и анализа флуоресценции, используя описанные настройки планшета (для mCherry): возбуждение: 587 нм, излучение: 610 нм, полоса пропускания длин волн: 12 нм, оптика: верхняя, температура: 37 °C, при этом показания флуоресценции собираются каждые 5 минут в течение 4 ч общего времени считывания. Инкубируют планшеты при встряхивании на импульсной настройке при 60 об/мин.
  7. Загрузите результаты в проект JMP DOE и создайте профиль прогнозирования для определения оптимальных уровней концентрации K-глутамата, Mg-глутамата и DTT на основе желаемых переменных отклика; В данном случае переменными отклика были максимальная флуоресценция и скорость реакции.
  8. Объедините реагенты, как показано в таблице 3 , чтобы создать буфер 2X CFPS
  9. Аликвотировать и хранить при −80 °C

7. CFPS в регидратированных лиофилизированных гидрогелях (метод А)

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмиды, используемые в реакциях CFPS, были созданы с использованием компонентов из модульного инструментария EcoFlex для E. coli36 и описаны в Whitfield et al.11 mCherry и eGFP находились под контролем конститутивного JM23100 промотора. Эти компоненты доступны в Addgene.

  1. Извлеките бесклеточный экстракт из хранилища при температуре −80 °C и разморозьте на льду в течение примерно 20 минут.
  2. Соберите 2 буфера CFPS и плазмидную ДНК и разморозьте на льду.
  3. Соберите сублимированные гидрогели и дайте им нагреться до комнатной температуры в течение 15 минут, оставив гели стоять на столе.
  4. Переложите гели в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл, при необходимости обрезая гели скальпелем, чтобы они поместились в лунки.
  5. В пробирке для микроцентрифуги объемом 1,5 мл смешайте 10 мкл внеклеточного экстракта с 25 мкл 2-кратного буфера CFPS и 4 мкг плазмидной ДНК; составляют до общего объема 50 мкл с ddH2O для создания раствора CFPS.
  6. Пипеткой нанесите раствор CFPS на сублимированные гидрогели.
  7. Дайте гелям впитаться в систему CFPS в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
  8. Перенесите гели на черную 384-луночную микротитровую пластину с помощью шпателя.
  9. Перенесите планшет с микротитрами в планшет для обнаружения и анализа флуоресценции с помощью настроек планшета, описанных в шаге 6.6. Репрезентативные результаты получены в предыдущих исследованиях31,33.

8. Синтез бесклеточного белка в развертываемых гидрогелях (метод Б)

  1. Извлеките бесклеточный экстракт из хранения при температуре −80 °C и разморозьте на льду в течение примерно 20 минут.
  2. Соберите плазмидную ДНК и разморозьте на льду.
  3. В пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 мл на льду смешайте 10 мкл внеклеточного экстракта с 3 мкг плазмидной ДНК и 25 мкл 2-кратного буфера CFPS, получив общий объем 37,5 мкл.
  4. Отмерьте 3 г агарозы и добавьте к 100 мл буфера ddH2Oдля создания 3% агарозы.
  5. Микроволновая печь 3% агарозы в 30 с порциями на высокой мощности.
  6. Пипетку 12,5 мкл расплавленной агарозы в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие смесь CFPS общим объемом 50 мкл.
  7. Дайте расплавленной агарозе остыть, но не полимеризуйтесь, оставив агарозу в термоблоке, установленном на 50 °C.
  8. Соединить расплавленную агарозу с раствором CFPS; Перемешайте с помощью пипетирования и перемешивания наконечником и убедитесь, что вы двигаетесь быстро, чтобы избежать полимеризации геля до того, как раствор CFPS можно будет смешать.
  9. Дайте гелям остыть при комнатной температуре и полимеризуйтесь примерно 2 минуты.
  10. Полимеризованную агарозу переложить в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с помощью шпателя и мгновенно заморозить в жидком азоте.
  11. Поместите гидрогели мгновенной заморозки в хранилище при температуре −80 °C на 1 ч.
  12. Извлечение гелей из хранилища; Снимите крышки пробирок микроцентрифуги, накройте пробирки восковой пленкой и проткните пленку, чтобы влага высохла.
  13. Включите сублимационную сушилку со следующими настройками: температура: −20 °C, давление: 0,1 мбар, сублимационная сушка в течение 18 часов (в течение ночи).
  14. Храните лиофилизированные устройства CFPS при температуре −80 °C до использования.
  15. Устройства с лиофилизированной сушкой CFPS с приблизительным влажным объемом 50 мкл могут быть регидратированы 50 мкл ddH2O без избытка жидкости. Регидратация занимает около 30 минут.
  16. Перенесите гели на черную 384-луночную микротитровую пластину с помощью шпателя.
  17. Перенесите планшет с микротитрами в планшет для обнаружения и анализа флуоресценции с помощью настроек планшета, описанных в шаге 6.6. Репрезентативные результаты имеются в предыдущих публикациях31,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе подробно описаны два метода встраивания реакций CFPS в гидрогелевые матрицы, а на рисунке 1 представлен схематический обзор этих двух подходов. Оба способа поддаются сублимационной сушке и длительному хранению. Метод А является наиболее используемой методологией по двум причинам. Во-первых, было показано, что это наиболее применимый метод для работы с целым рядом гидрогелевых материалов11. Во-вторых, метод А позволяет проводить параллельное тестирование генетических конструкций. Метод Б больше подходит для изготовления оптимизированной системы и развертывания в полевых условиях. Оба протокола позволяют подготовить несколько образцов за один раз, что способствует экспериментальной воспроизводимости. Эта функция также полезна для долгосрочного развития технологии, поскольку сублимированные устройства могут поставляться в сухом состоянии и восстанавливаться на месте при необходимости.

Подход, описанный в протоколе и на рисунке 1 , может быть использован для экспрессии отдельных генных конструкций или для совместной экспрессии нескольких генов. Данные, представленные на рисунке 2 , показывают экспрессию как eGFP, так и mCherry в 0,75% агарозном геле. С помощью конфокальной микроскопии было подтверждено, что экспрессия белка была однородной по всему гидрогелю, в том числе во внутренних плоскостях. В частности, синтез белка не ограничивался внешними краями гидрогеля, а внутренняя флуоресценция не была результатом диффузии белка. Чтобы подтвердить это, поместив гидрогель, экспрессирующий eGFP, в физический контакт с гидрогелем, экспрессирующим mCherry, можно было увидеть диффузию белка от одного гидрогеля к другому. Скорость диффузии между ними была недостаточной, чтобы объяснить обширную локализацию красной или зеленой флуоресценции внутри материала. Этот эксперимент также иллюстрирует ключевое преимущество использования бесклеточных устройств в гидрогелях — функциональность устройства может быть пространственно организована таким образом, который невозможен в жидких бесклеточных реакциях. Кроме того, для создания генных сетей необходим одновременный синтез более чем одного генного продукта. Результаты, показанные на рисунке 2 (нижняя строка), подтвердили коэкспрессию как mCherry, так и eGFP в агарозе. В этой работе экспрессировались оба белка, и пространственной конкуренции между белками не было. Опять же, наложение красного и зеленого диапазонов длин волн демонстрирует равномерное пространственное распределение обоих белков в гидрогеле.

Таблица 1: Запасы 14-кратных энергетических решений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Разработка экспериментального массива для оптимизации DTT, Mg-глутамата и К-глутамата в реакциях синтеза внеклеточного белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Буферные компоненты 2x CFPS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Figure 1
Рисунок 1: Схема двух протоколов. В первом методе (метод А, продемонстрированный в этой статье) гидрогелевые материалы сначала готовятся, а затем лиофилизируются (шаг 1) без бесклеточных компонентов. Эти высушенные гидрогели могут храниться и восстанавливаться при необходимости (этап 2) с правильным объемом бесклеточной реакции перед инкубацией для производства белка (шаг 3) Вариантный метод, метод B, включает все или некоторые бесклеточные компоненты реакции в первоначальном производстве гидрогеля. После сублимационной сушки (этап 1) гидрогели могут быть восстановлены только в воде или в буфере, содержащем интересующий аналит (этап 2). Выработка белка (шаг 3) продолжается в прежнем режиме. Третий метод, при котором лиофилизированные бесклеточные компоненты восстанавливаются с помощью гидрогелевых полимеров, описан в работе Whitfield et al.11 , но на сегодняшний день нашел применение только с ограниченным числом гидрогелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Синтез бесклеточного белка eGFP и mCherry в гидрогеле с использованием лизатов клеток E. coli. Агарозные гели (0,75%) получали без матрицы ДНК (вверху) с 4 мкг матрицы eGFP или mCherry (посередине) или с 4 мкг матриц eGFP и mCherry (внизу). Гидрогели инкубировали в течение 4 ч перед конфокальной микроскопией в красном и зеленом каналах. Также отображается наложение двух каналов, которое включает в себя изображение дифференциального интерференционного контраста (DIC). Гидрогели, содержащие матрицу eGFP или mCherry, готовили отдельно, но инкубировали в физическом контакте друг с другом. Диаметр геля составляет 6 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь описаны два протокола для включения реакций CFPS на основе лизата клеток E. coli в агарозные гидрогели. Эти методы позволяют обеспечить одновременную экспрессию генов по всему материалу. Протокол может быть адаптирован для других систем CFPS и был успешно проведен с коммерчески доступными наборами CFPS в дополнение к лабораторно подготовленным клеточным лизатам, подробно описанным здесь. Важно отметить, что протокол допускает экспрессию генов при отсутствии внешней жидкой фазы. Это означает, что система является автономной и не требует бесклеточной реакционной ванны. В отличие от предыдущих методов, в которых реакции CFPS протекали внутри гидрогелей, этот метод устраняет необходимость во внешних буферах и реакционных сосудах. Ожидается, что эти методы позволят исследователям изучить использование гидрогелевых материалов в качестве шасси для бесклеточных устройств синтетической биологии, что в конечном итоге обеспечит путь для перемещения таких устройств за пределы лаборатории.

Решающее значение для успеха обоих подходов имеет использование высококачественных клеточных лизатов. Высококачественный клеточный лизат должен иметь высокую концентрацию белка (>40 мг/мл), должен храниться в холоде в течение всего периода приготовления и не должен подвергаться повторным циклам замораживания-оттаивания. Кроме того, очень важно, чтобы матрицы ДНК были высокой чистоты. Для достижения этой цели плазмиды должны быть извлечены из клеток с помощью набора для подготовки плазмид высокой чистоты и высокой производительности для транскрипционных реакций, протекающих в среде CFPS. Эти критические этапы являются общими для всех приложений CFPS и не являются уникальными для этого метода. Тем не менее, именно подготовка компонентов CFPS оказывает наибольшее влияние на эффективность протоколов. Что касается материалов, необходимо обеспечить эффективную и быструю сублимационную сушку гидрогелей. Если сублимационная сушилка не достигает достаточно низкой температуры (ниже −45 °C), гель будет высушен, а не сублимирован, что может нарушить внутреннюю структуру гидрогелевой матрицы и привести к деградации встроенных систем CFPS. Метод Б также имеет уникальную проблему; В частности, при добавлении смеси CFPS к расплавленной агарозе для формирования геля расплавленную агарозу необходимо оставить достаточно остыть перед добавлением смеси CFPS, чтобы предотвратить термическое разложение реакций CFPS. Однако, если дать агарозе слишком сильно остыть, это приведет к полимеризации геля и предотвратит добавление системы CFPS. Наконец, гидрогели обладают определенной степенью автофлуоресценции, которая может конфликтовать с флуоресцентными сигналами, генерируемыми во время реакций CFPS. Поэтому важно включить соответствующие негативные контрольные и генетические репортеры, которые не обладают теми же характеристиками флуоресценции, что и материал.

Протоколы, продемонстрированные здесь, сосредоточены на использовании агарозы в качестве модельного гидрогеля. Агароза является отличной модельной системой для этой работы, поскольку она широко доступна, недорога и демонстрирует отличные возможности производства белка. Предыдущие исследования также продемонстрировали, что агароза может быть заменителем агента вытеснения ПЭГ в реакциях CFPS, что указывает на то, что взаимодействие между полимерным шасси и реакциями CFPS может усиливать продукцию белка11. Эти методы, однако, также поддаются модификации с использованием широкого спектра альтернативных гидрогелевых матриц с различными физико-химическими свойствами. Метод применялся к ксантановой камеди, альгинату, ацилгеллановой камеди, полиакриламиду, гидрогелям гиалуроновой кислоты, а также к полоксамерным гелям F-108 и F-1279. В некоторых сценариях наблюдается снижение выработки белка по сравнению с жидкими контрольными препаратами или другими гидрогелями. Тем не менее, в этих сценариях может быть достигнут компромисс, когда функциональность самого материала (например, его адгезионные свойства или биосовместимость) имеет существенное преимущество, так что снижение выработки белка может быть приемлемым. Также могут быть внесены изменения в концентрацию гидрогелей. Для агарозы методы поддаются, например, концентрациям полимеров в диапазоне 0,5%-1,5% по массе. Более высокая концентрация геля, как правило, приводит к созданию более прочного устройства, которое более устойчиво к обращению и лучше сохраняет реакцию CFPS внутри. Компромисс с повышенной концентрацией геля, однако, заключается в том, что реакция может иметь сниженную скорость производства или выход белка11,37. Однако зависимость между концентрацией полимера и образованием белка не является линейной и варьируется в зависимости от используемого гидрогеля11. Таким образом, для любого нового гидрогелевого полимера требуется определенная степень экспериментов, чтобы сбалансировать функциональность материала с бесклеточной функциональностью.

Встраивание реакций CFPS в гидрогелевые материалы без необходимости использования внешних буферов представляет собой интересный путь для развертывания бесклеточных устройств. Преимущество бесклеточных устройств заключается в том, что они устраняют необходимость в выпуске генетически модифицированных организмов за пределы контролируемой лабораторной среды. Кроме того, встраивание реакций в гидрогели устраняет необходимость в реакционных сосудах (как правило, пластиковой посуде) после восстановления. Учитывая, что многие гидрогели являются биоразлагаемыми, это предлагает потенциальный путь к сокращению пластиковых отходов. Кроме того, протокол, подробно описанный здесь, также демонстрирует, что и гидрогель, и CFPS поддаются сублимационной сушке. В то время как повторные циклы лиофилизации не рекомендуются и, скорее всего, повредят функцию CFPS и гидрогеля, для одноразовых устройств. Возможность сублимационной сушки и восстановления компонентов снижает вес устройства и устраняет необходимость в холодовой цепи во время транспортировки. Эти свойства в конечном итоге упрощают логистику и снижают транспортные расходы на устройства. Кроме того, гидрогели обладают многими полезными функциональными свойствами сами по себе; Например, они могут выступать в качестве паст, смазочных материалов, клеев. Гидрогели также могут быть биосовместимыми, биоразлагаемыми и обладать собственными стимул-реакциями. В совокупности может быть достигнута синергия между биологической функциональностью и материаловедением для создания нового класса биопрограммируемых материалов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой.

Acknowledgments

Авторы выражают глубокую признательность Научно-исследовательскому совету по биотехнологии и биологическим наукам за поддержку наград BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) и BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), а также Исследовательского совета по инженерным и физическим наукам - Оборонные научно-технические лаборатории EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Данные, подтверждающие данную публикацию, находятся в открытом доступе по адресу: 10.25405/data.ncl.22232452. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , Newcastle University. UK. (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

Tags

Биология выпуск 196 Бесклеточный синтез белка CFPS синтетическая биология синтетические генные сети гидрогели биосенсоры экспрессия генов экспрессия белков
Методы встраивания реакций синтеза внеклеточных белков в гидрогели макромасштаба
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kavil, S., Laverick, A., Whitfield,… More

Kavil, S., Laverick, A., Whitfield, C. J., Banks, A. M., Howard, T. P. Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels. J. Vis. Exp. (196), e65500, doi:10.3791/65500 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter