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Biology

Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos dos protocolos para incrustar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en matrices de hidrogel a macroescala sin la necesidad de una fase líquida externa.

Abstract

Las redes de genes sintéticos proporcionan una plataforma para que los científicos e ingenieros diseñen y construyan sistemas novedosos con funcionalidad codificada a nivel genético. Si bien el paradigma dominante para el despliegue de redes de genes se encuentra dentro de un chasis celular, las redes de genes sintéticos también pueden desplegarse en entornos libres de células. Entre las aplicaciones prometedoras de las redes de genes libres de células se encuentran los biosensores, ya que se ha demostrado que estos dispositivos se encuentran contra objetivos bióticos (virus del Ébola, Zika y SARS-CoV-2) y abióticos (metales pesados, sulfuros, pesticidas y otros contaminantes orgánicos). Los sistemas libres de células generalmente se implementan en forma líquida dentro de un recipiente de reacción. Sin embargo, ser capaz de incrustar tales reacciones en una matriz física puede facilitar su aplicación más amplia en un conjunto más amplio de entornos. Con este fin, se han desarrollado métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en una variedad de matrices de hidrogel. Una de las propiedades clave de los hidrogeles que conducen a este trabajo es la alta capacidad de reconstitución en agua de los materiales de hidrogel. Además, los hidrogeles poseen características físicas y químicas que son funcionalmente beneficiosas. Los hidrogeles se pueden liofilizar para su almacenamiento y rehidratarse para su uso posterior. Se presentan dos protocolos paso a paso para la inclusión y el ensayo de reacciones de CFPS en hidrogeles. En primer lugar, se puede incorporar un sistema CFPS a un hidrogel mediante rehidratación con un lisado celular. El sistema dentro del hidrogel puede ser inducido o expresado constitutivamente para una expresión completa de proteínas a través del hidrogel. En segundo lugar, el lisado celular se puede introducir en un hidrogel en el punto de polimerización, y todo el sistema se puede liofilizar y rehidratar en un punto posterior con una solución acuosa que contiene el inductor del sistema de expresión codificado dentro del hidrogel. Estos métodos tienen el potencial de permitir redes de genes libres de células que confieren capacidades sensoriales a los materiales de hidrogel, con el potencial de ser desplegados más allá del laboratorio.

Introduction

La biología sintética integra diversas disciplinas de ingeniería para diseñar y diseñar piezas, dispositivos y sistemas de base biológica que puedan realizar funciones que no se encuentran en la naturaleza. La mayoría de los enfoques de biología sintética todavía están ligados a células vivas. Por el contrario, los sistemas de biología sintética libres de células facilitan niveles sin precedentes de control y libertad en el diseño, lo que permite una mayor flexibilidad y un tiempo más corto para la ingeniería de sistemas biológicos, al tiempo que elimina muchas de las limitaciones de los métodos tradicionales de expresión génica basados en células 1,2,3. El CFPS se utiliza en un número cada vez mayor de aplicaciones en numerosas disciplinas, incluida la construcción de células artificiales, la creación de prototipos de circuitos genéticos, el desarrollo de biosensores y la producción de metabolitos 4,5,6. El CFPS también ha sido particularmente útil para producir proteínas recombinantes que no pueden expresarse fácilmente en células vivas, como las proteínas propensas a la agregación, las proteínas transmembrana y las proteínas tóxicas 6,7,8.

El CFPS se realiza normalmente en reacciones líquidas. Esto, sin embargo, puede restringir su despliegue en algunas situaciones, ya que cualquier dispositivo líquido libre de células debe estar contenido dentro de un recipiente de reacción. La justificación para el desarrollo de los métodos presentados aquí fue proporcionar protocolos sólidos para incrustar dispositivos de biología sintética libres de células en hidrogeles, no como una plataforma de producción de proteínas per se, sino para permitir el uso de hidrogeles como un chasis físico para el despliegue de dispositivos libres de células más allá del laboratorio. El uso de hidrogeles como chasis de CFPS tiene varias ventajas. Los hidrogeles son materiales poliméricos que, a pesar de un alto contenido de agua (a veces superior al 98%), poseen propiedades sólidas 9,10,11. Tienen usos como pastas, lubricantes y adhesivos y están presentes en productos tan diversos como lentes de contacto, apósitos para heridas, cintas adhesivas marinas, enmiendas de suelo y pañales para bebés 9,11,12,13,14. Los hidrogeles también están siendo investigados activamente como vehículos de administración de fármacos 9,15,16,17. Los hidrogeles también pueden ser biocompatibles, biodegradables y poseer algunas respuestas a estímulos propios 9,18,19,20. Por lo tanto, el objetivo aquí es crear una sinergia entre la funcionalidad derivada de la biología molecular y la ciencia de los materiales. Con este fin, se han realizado esfuerzos para integrar la biología sintética libre de células con una variedad de materiales, incluidos el colágeno, la laponita, la poliacrilamida, la fibrina, el péptido PEG y la agarosa 11,21,22, así como para recubrir superficies de vidrio, papel y tela 11,23,24 con dispositivos CFPS. Los protocolos presentados aquí demuestran dos métodos para incrustar reacciones de CFPS en matrices de hidrogel a macroescala (es decir, >1 mm), utilizando agarosa como material de ejemplo. La agarosa fue elegida debido a su alta capacidad de absorción de agua, propiedades autogelificantes controladas y propiedades mecánicas sintonizables 11,24,25,26. La agarosa también es compatible con CFPS funcionales, es más barata que muchas otras alternativas de hidrogel y es biodegradable, lo que la convierte en una opción atractiva como sistema modelo experimental. Sin embargo, se ha demostrado previamente que estos métodos son apropiados para incorporar CFPS en una gama de hidrogeles alternativos11. Teniendo en cuenta la amplia gama de aplicaciones de los hidrogeles y la funcionalidad de los CFPS, los métodos aquí demostrados pueden proporcionar una base a partir de la cual los investigadores puedan desarrollar materiales de hidrogel biológicamente mejorados adecuados para sus propios fines.

En estudios previos, se han utilizado sistemas de microgel con un rango de tamaño de 1 μm a 400 μm para realizar CFPS en hidrogeles sumergidos en tampón de reacción 23,27,28,29,30,31. Sin embargo, el requisito de sumergir los hidrogeles dentro de tampones de reacción de CFPS limita las oportunidades para su uso como materiales por derecho propio. Los protocolos presentados aquí permiten que las reacciones de CFPS ocurran dentro de los hidrogeles sin la necesidad de sumergir los geles en tampones de reacción. En segundo lugar, el uso de geles a macroescala (entre 2 mm y 10 mm de tamaño) permite el estudio de la interacción física entre los hidrogeles y la expresión génica libre de células. Por ejemplo, con esta técnica, es posible estudiar cómo la matriz de hidrogel afecta a las reacciones de CFPS11 y cómo las reacciones de CFPS pueden afectar a la matriz de hidrogel31. Los tamaños más grandes de los hidrogeles también permiten el desarrollo de nuevos materiales bioprogramables32. Por último, al incorporar las reacciones de CFPS en los hidrogeles, también se reduce potencialmente la necesidad de recipientes de reacción de plástico. Para el despliegue de sensores sin células, esto tiene claras ventajas sobre los dispositivos que dependen de los artículos de plástico. En conjunto, la incorporación de reacciones de CFPS en hidrogeles proporciona varias ventajas para el despliegue de dispositivos libres de células más allá del laboratorio.

El objetivo general de los métodos presentados aquí es permitir el funcionamiento de las reacciones de CFPS dentro de matrices de hidrogel. Se muestran dos métodos diferentes para incluir reacciones de producción de proteínas libres de células en materiales de hidrogel a macroescala (Figura 1). En el Método A, los componentes de CFPS se introducen en hidrogeles de agarosa liofilizados para formar un sistema activo. En el Método B, la agarosa fundida se mezcla con los componentes de la reacción CFPS para formar un sistema completo de hidrogel CFPS, que luego se liofiliza y se almacena hasta que se necesita. Estos sistemas se pueden rehidratar con un volumen de agua o tampón y analito para comenzar la reacción.

Este estudio utiliza sistemas basados en lisado de células de Escherichia coli. Estos son algunos de los sistemas experimentales de CFPS más populares, ya que la preparación del lisado de células de E. coli es simple, económica y logra altos rendimientos proteicos. El lisado celular se complementa con los componentes macromoleculares necesarios para realizar la transcripción y la traducción, incluidos los ribosomas, los ARNt, las aminoacil-ARNt sintetasas y los factores de iniciación, elongación y terminación. En concreto, en este trabajo se demuestra la producción de eGFP y mCherry en hidrogeles de agarosa utilizando lisados de células de E. coli y se monitoriza la aparición de fluorescencia mediante un lector de placas y microscopía confocal. Los resultados representativos para el lector de placas de microtitulación se pueden ver en Whitfield et al.31, y los datos subyacentes están disponibles públicamente 33. Además, la expresión de proteínas fluorescentes a través de los geles se confirma mediante microscopía confocal. Los dos protocolos demostrados en este artículo permiten el ensamblaje y almacenamiento de dispositivos genéticos basados en CFPS en materia con el objetivo final de crear un entorno físico adecuado para la distribución de circuitos de genes libres de células de una manera que apoye el despliegue en el campo.

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Protocol

1. Tampón de lisado celular y preparación de medios

  1. Preparación de 2x agar YT+P y medio
    1. Prepare 2 agar YT+P midiendo 16 g/L de triptona, 10 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1M KH2PO4 y 15 g/L de agar. Para el caldo 2x YT+P, siga la composición anterior pero omita el agar.
    2. Esterilice esterilizando en autoclave el 2x YT+P.
  2. Preparación del tampón S30A
    1. Preparar el tampón S30A con 5,88 g/L de Mg-glutamato, 12,195 g/L de K-glutamato y 25 mL/L de 2 M de Tris, ajustado a pH 7,7 con ácido acético.
    2. Guarde el tampón S30A a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
  3. Preparación del tampón S30B
    1. Preparar el tampón S30B con 5,88 g/L de Mg-glutamato y 12,195 g/L de K-glutamato, ajustado a pH 8,2 con 2 M Tris.
    2. Guarde el tampón S30B a 4 °C durante un máximo de 1 semana.

2. Preparación del lisado celular (protocolo de 4 días)

  1. Día 1
    1. Vierta el 2x YT+P en placas de agar suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina.
    2. Eliminar E. coli a partir de una cepa de glicerol de -80 °C e incubar durante la noche a 37 °C.
  2. Día 2
    1. Inocular una sola colonia de la placa 2x YT+P en 400 mL de caldo 2x YT+P (suplementado con ampicilina) en un matraz deflector de 1 L.
    2. Incubar durante 24 h a 37 °C con agitación a 220 rpm.
  3. Día 3
    1. Medir y registrar la DO600 de los cultivos de 24 h; crecimiento es suficiente a un DE600 de 3-4.
      NOTA: Tome una alícuota de 1 ml de cultivo bacteriano y realice una dilución seriada con medio (2x caldo YT+P) antes de medir el OD600 nm. Tenga en cuenta el efecto de dilución al calcular el OD600.
    2. Transfiera el cultivo uniformemente entre botellas de centrífuga preenfriadas de 500 ml.
    3. Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C y luego desechar el sobrenadante.
    4. Durante la centrifugación, complete la preparación del tampón S30A agregando 2 mL/L de DTT de 1 M al tampón S30A previamente preparado, mezclando y manteniendo el tampón en hielo.
    5. Vuelva a suspender los gránulos celulares en 200 ml de tampón S30A.
    6. Agite las botellas vigorosamente hasta que todo el gránulo esté completamente solubilizado, manteniendo las células en hielo tanto como sea posible.
    7. Centrifugar a 4.500 x g durante 15 min a 4 °C y luego desechar el sobrenadante.
    8. Repita los pasos 2.3.5 a 2.3.7 (ambos inclusive).
    9. Agregue 40 ml de tampón S30A a cada botella de centrífuga, vuelva a suspender los gránulos y transfiéralos a tubos de centrífuga de 50 ml prepesados.
    10. Centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y elimine el sobrenadante residual con una pipeta, manteniéndolo en hielo tanto como sea posible.
    11. Vuelva a pesar los tubos de centrífuga, registre la nueva masa y calcule la masa de los gránulos.
    12. Congele rápidamente los gránulos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C.
  4. Día 4
    1. Descongele los gránulos en hielo.
    2. Por 1 g de gránulo, añadir lo siguiente: 1,2 ml de tampón S30A (TDT añadido antes de su uso), 275 μl de inhibidor de la proteasa (8 mM de stock) y 25 μl de lisozima (10 mg/ml de stock).
    3. Agite vigorosamente hasta que los gránulos estén completamente solubilizados sin grumos restantes, manteniéndolos en hielo tanto como sea posible.
    4. En tubos de centrífuga de 50 ml, sonicar las suspensiones celulares a 120 W, 20 kHz, 30% de amplitud y 20 s/40 s de pulsos de encendido/apagado durante 5 minutos de sonicación.
    5. Centrifugar a 4.000 x g durante 1 h a 4 °C para granular los restos de la célula.
    6. Transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga nuevos de 50 ml.
    7. Incubar los tubos a 37 °C a 220 rpm durante 80 min.
    8. Prepare los materiales de diálisis añadiendo 1 mL/L de DTT 1 M al tampón S30B. Mezcle y agregue 900 ml a un vaso de precipitados estéril de 1 l. Agregue un agitador magnético y manténgalo a 4 ° C.
    9. Después de la reacción de escorrentía, transfiera el extracto celular del paso 2.4.7 a tubos de microcentrífuga de 2 ml y centrifugue a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    10. Consolide el sobrenadante sin gránulos en hielo en un tubo de centrífuga de 50 ml.
    11. Determine el volumen total de extracto celular producido e hidrate el número necesario de casetes de diálisis MWCO de 10K sumergiéndolos en S30B durante 2 min.
    12. Cargue los casetes a través de una jeringa con hasta 3 ml de extracto. Diálisar hasta tres casetes por vaso de precipitados de 1 L, agitando a 4 °C durante 3 h.
    13. Una vez completada la diálisis, que clarifica el extracto, transfiera el extracto a tubos de microcentrífuga de 2 ml. Centrifugar a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    14. Consolide el extracto clarificado en un tubo de centrífuga nuevo sobre hielo y haga un vórtice brevemente para mezclar.
    15. Determine la concentración de proteínas del extracto con un fluorómetro.
    16. Diluir el extracto a una concentración de 44,5 mg/mL utilizando ddH2O preenfriado.
    17. Alícuota en alícuotas de 200 μL, congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C.

3. Preparación de hidrogeles liofilizados (Método A)

  1. Pesar 0,75 g de agarosa, añadir ddH2O a un volumen de 100 ml y calentar en el microondas en ráfagas de 30 s a altas temperaturas para crear un caldo de agarosa fundido.
  2. Con una pipeta, transfiera 50 μL de agarosa fundida a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y deje que el gel polimerice durante 20-30 min (la polimerización se produce más rápido si los geles se transfieren a un refrigerador).
  3. Congele rápidamente los tubos de microcentrífuga, que contienen los geles polimerizados, en nitrógeno líquido.
  4. Retire la tapa de los tubos de la centrífuga, cubra las aberturas de los tubos de la centrífuga con una película de cera y perfore la película varias veces con una aguja o punta de pipeta.
  5. Transfiera los tubos de microcentrífuga que contienen los geles polimerizados a un almacenamiento de -80 °C durante 1-2 h.
  6. Recupere los tubos de centrífuga del almacenamiento a -80 °C y colóquelos en un liofilizador, asegurándose de que los tubos estén completamente secos.
  7. Acople el liofilizador con los siguientes ajustes: temperatura: -20 °C, presión: 0,1 mbar.
  8. Deja que el gel se liofilice durante la noche.
  9. Recupere los geles del liofilizador y colóquelos en almacenamiento a -80 °C hasta que sea necesario.
    NOTA: Los geles se pueden almacenar liofilizados hasta por 1 año.

4. Preparación del stock de solución energética 14x

  1. Combine todos los componentes de la reacción (Tabla 1) en un tubo de centrífuga de 15 ml sobre hielo para producir una solución energética 14x.
  2. Aliquotar la solución de energía 14x en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y almacenar a -80 °C (se pueden utilizar alícuotas de menor volumen).
    NOTA: La solución energética 14x puede almacenarse durante varios meses a -80 °C si se evita la congelación y descongelación repetida de los tubos.

5. Preparación del caldo de aminoácidos 4x

  1. Descongele, con hielo, los 20 componentes de aminoácidos de un kit RTS Amino Acid Sampler. Agita los aminoácidos para asegurarte de que se disuelvan por completo.
  2. En un tubo de centrífuga de 50 ml, combine los 20 aminoácidos y agregue 12 ml de ddH2O. Vortex estéril hasta que la solución se vuelva clara, con solo una ligera neblina de coloración blanca.
  3. Alícuota los 4x aminoácidos en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (alícuotas de 500 μL).
  4. Congele rápidamente las alícuotas de la solución de aminoácidos 4x en nitrógeno líquido y mueva las alícuotas al almacenamiento de -80 °C.

6. Calibración de tampón libre de células

NOTA: El tampón CFPS utilizado para las reacciones de hidrogel se calibró para concentraciones óptimas de DTT, Mg-glutamato y K-glutamato siguiendo el protocolo de Banks et al.34 modificado de Sun et al.35. Las composiciones de las reacciones de calibración se seleccionaron utilizando el método de diseño de experimentos (DOE), seleccionándose siete niveles de factor para K-glutamato (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamato (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) y TDT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM). Se utilizó JMP Pro 15 para generar un diseño DOE personalizado (Tabla 2) y realizar el análisis para determinar las concentraciones óptimas de los factores.

  1. Recuperar el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongelar en hielo.
  2. Descongele las existencias de 4 aminoácidos, 14 soluciones energéticas, 40 % de PEG-8000, ADN plasmídico, 3 M de K-glutamato, 100 mM de Mg-glutamato y 100 mM de DTT en hielo.
  3. Cree una mezcla maestra de calibración combinando 12,5 μL de los 4 aminoácidos, 3,57 μL de la solución energética 14x, 2,5 μL de PEG-8000 al 40 %, 3 μg de ADN plasmídico y 10 μL de extracto libre de células (44,5 mg/ml), y haga hasta 35 μL por reacción con ddH2O.
  4. Distribuya los 35 μL de mezcla maestra en los pocillos de una placa de microtitulación negra de 384 pocillos.
  5. Siguiendo el diseño del DOE, agregue el volumen apropiado de Mg-glutamato, K-glutamato y DTT a cada reacción, junto con ddH2O para hacer que cada reacción sea de hasta 50 μL.
  6. Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita (para mCherry): excitación: 587 nm, emisión: 610 nm, ancho de banda de longitud de onda: 12 nm, óptica: superior, temperatura: 37 °C, con lecturas de fluorescencia recogidas cada 5 minutos durante 4 h de tiempo total de lectura. Incubar las placas agitándolas en un ajuste pulsado a 60 rpm.
  7. Cargue los resultados en el diseño JMP DOE y genere un perfil de predicción para determinar los niveles óptimos de concentración para K-glutamato, Mg-glutamato y DTT en función de las variables de respuesta deseadas; En este caso, la fluorescencia máxima y la velocidad de reacción fueron las variables de respuesta.
  8. Combine los reactivos como se muestra en la Tabla 3 para crear el tampón CFPS 2X
  9. Alícuota y almacenar a -80 °C

7. CFPS en hidrogeles liofilizados rehidratados (Método A)

NOTA: Los plásmidos utilizados en las reacciones de CFPS se crearon utilizando componentes del kit de herramientas modular EcoFlex para E. coli36 y descritos en Whitfield et al.11 El mCherry y el eGFP estaban bajo el control del promotor JM23100 constitutivo. Estos componentes están disponibles en Addgene.

  1. Recupere el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongele en hielo durante aproximadamente 20 minutos.
  2. Recoja el tampón CFPS 2x y el ADN plasmídico, y descongele en hielo.
  3. Recoja los hidrogeles liofilizados y déjelos alcanzar la temperatura ambiente durante 15 minutos dejando reposar los geles en el banco.
  4. Transfiera los geles a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, recortando los geles con un bisturí si es necesario para que quepan en los pocillos.
  5. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, combine 10 μl de extracto libre de células con 25 μl de tampón 2x CFPS y 4 μg de ADN plasmídico; hasta un volumen total de 50 μL con ddH2O para crear la solución de CFPS.
  6. Pipetear la solución de CFPS sobre los hidrogeles liofilizados.
  7. Deje que los geles se remojen en el sistema CFPS durante 5-10 minutos a temperatura ambiente.
  8. Transfiera los geles a una placa de microtitulación negra de 384 pocillos con una espátula.
  9. Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita en el paso 6.6. Se dispone de resultados representativos en estudios previos31,33.

8. Síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles desplegables (Método B)

  1. Recupere el extracto libre de células del almacenamiento a -80 °C y descongele en hielo durante aproximadamente 20 minutos.
  2. Recoja el ADN del plásmido y descongele en hielo.
  3. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo, combine 10 μl de extracto libre de células con 3 μg de ADN plasmídico y 25 μl de tampón 2x CFPS, lo que hace un volumen total de 37,5 μl.
  4. Mida 3 g de agarosa y agréguelo a 100 ml de tampón ddH2O para crear un 3% de agarosa.
  5. Calienta en el microondas la agarosa al 3% en ráfagas de 30 s a alta potencia.
  6. Pipetear 12,5 μL de agarosa fundida en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que contengan una mezcla de CFPS hasta un volumen total de 50 μL.
  7. Deje que la agarosa fundida se enfríe, pero no se polimerice, dejando la agarosa en un bloque térmico ajustado a 50 °C.
  8. Combine la agarosa fundida con la solución de CFPS; mezcle mediante pipeteo y agitación con la punta, y asegúrese de moverse rápidamente para evitar la polimerización en gel antes de que se pueda mezclar la solución de CFPS.
  9. Deje que los geles se enfríen a temperatura ambiente y polimericen durante aproximadamente 2 minutos.
  10. Transfiera la agarosa polimerizada a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con una espátula y congele rápidamente en nitrógeno líquido.
  11. Coloque los hidrogeles ultracongelados en un almacenamiento de -80 °C durante 1 h.
  12. Recuperar los geles del almacenamiento; Retire las tapas de los tubos de microcentrífuga, cubra los tubos con una película de cera y perfore la película para permitir que se seque la humedad.
  13. Conecte el liofilizador con los siguientes ajustes: temperatura: -20 °C, presión: 0,1 mbar, liofilización durante 18 h (durante la noche).
  14. Guarde los dispositivos CFPS liofilizados en un almacenamiento de -80 °C hasta su uso.
  15. Los dispositivos CFPS liofilizados, con un volumen húmedo aproximado de 50 μL, se pueden rehidratar con 50 μL de ddH2O sin exceso de líquido. La rehidratación dura aproximadamente 30 min.
  16. Transfiera los geles a una placa de microtitulación negra de 384 pocillos con una espátula.
  17. Transfiera la placa de microtitulación a un lector de placas para la detección y el análisis de fluorescencia utilizando la configuración del lector de placas descrita en el paso 6.6. Los resultados representativos están disponibles en publicaciones anteriores31,33.

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Representative Results

Este protocolo detalla dos métodos para incrustar reacciones de CFPS en matrices de hidrogel, con la Figura 1 presentando una descripción general esquemática de los dos enfoques. Ambos métodos son susceptibles de liofilización y almacenamiento a largo plazo. El método A es la metodología más utilizada por dos razones. En primer lugar, se ha demostrado que es el método más aplicable para trabajar con una variedad de materiales de hidrogel11. En segundo lugar, el Método A permite la prueba paralela de construcciones genéticas. El método B es más apropiado para la fabricación de un sistema optimizado y una implementación de campo. Ambos protocolos permiten preparar muchas muestras de una sola vez para ayudar a la reproducibilidad experimental. Esta característica también es útil para el desarrollo a largo plazo de la tecnología, ya que los dispositivos liofilizados pueden enviarse en estado seco y reconstituirse in situ cuando sea necesario.

El enfoque descrito en el protocolo y en la Figura 1 se puede utilizar para la expresión de construcciones de un solo gen o para la coexpresión de múltiples genes. Los datos presentados en la Figura 2 muestran la expresión tanto de eGFP como de mCherry en un gel de agarosa al 0,75%. Se utilizó microscopía confocal para confirmar que la expresión de proteínas era homogénea en todo el hidrogel, incluso dentro de los planos internos. Específicamente, la síntesis de proteínas no se limitó a los bordes exteriores del hidrogel, y la fluorescencia interna no fue el resultado de la difusión de proteínas. Para confirmar esto, al colocar un hidrogel que expresa eGFP en contacto físico con un hidrogel que expresa mCherry, fue posible ver la difusión de proteínas de un hidrogel a otro. La velocidad de difusión entre los dos fue insuficiente para explicar la extensa localización de la fluorescencia roja o verde dentro del material. Este experimento también ilustra una ventaja clave de la implementación de dispositivos libres de células en hidrogeles: la funcionalidad del dispositivo se puede organizar espacialmente de una manera que no es posible en reacciones líquidas libres de células. Además, para la creación de redes de genes, se necesita la síntesis simultánea de más de un producto génico. Los resultados que se muestran en la Figura 2 (fila inferior) confirmaron la coexpresión de mCherry y eGFP en agarosa. En este trabajo, ambas proteínas se expresaron y no hubo competencia espacial entre las proteínas. Una vez más, una superposición del rango de longitud de onda roja y verde demuestra la distribución espacial uniforme de ambas proteínas dentro del hidrogel.

Tabla 1: Las existencias de soluciones energéticas 14x. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Diseño de un array experimental para la optimización de DTT, Mg-glutamato y K-glutamato dentro de las reacciones de síntesis de proteínas libres de células. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Los 2 componentes del búfer CFPS. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figure 1
Figura 1: Esquema de los dos protocolos. En el primer método (Método A, demostrado en este artículo) los materiales de hidrogel se preparan primero y luego se liofilizan (paso 1) sin componentes libres de células. Estos hidrogeles secos pueden almacenarse y reconstituirse cuando sea necesario (paso 2) con el volumen correcto de reacción libre de células antes de la incubación para la producción de proteínas (paso 3) El método variante, el Método B, incorpora todos, o algunos, de los componentes de la reacción libre de células en la fabricación inicial de hidrogeles. Después de la liofilización (paso 1), los hidrogeles pueden reconstituirse en agua sola o en un tampón que contenga un analito de interés (paso 2). La producción de proteínas (paso 3) continúa como antes. Un tercer método, en el que los componentes liofilizados libres de células se reconstituyen con polímeros de hidrogel, se describe en Whitfield et al.11 , pero hasta la fecha sólo se ha utilizado con un número limitado de hidrogeles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Síntesis de proteínas libres de células de eGFP y mCherry en un hidrogel utilizando lisados de células de E. coli. Los geles de agarosa (0,75%) se prepararon sin plantilla de ADN (arriba) con 4 μg de eGFP o plantilla de mCherry (centro) o con 4 μg de eGFP y plantilla de mCherry (abajo). Los hidrogeles se incubaron durante 4 h antes de la microscopía confocal en los canales rojo y verde. También se muestra una superposición de los dos canales, y la superposición incluye la imagen de contraste de interferencia diferencial (DIC). Los hidrogeles que contenían eGFP o mCherry se prepararon por separado, pero se incubaron en contacto físico entre sí. El diámetro del gel es de 6 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

A continuación se describen dos protocolos para la incorporación de reacciones de CFPS basadas en lisado de células de E. coli en hidrogeles de agarosa. Estos métodos permiten la expresión génica simultánea en todo el material. El protocolo se puede adaptar a otros sistemas de CFPS y se ha llevado a cabo con éxito con kits de CFPS disponibles en el mercado, además de los lisados celulares preparados en laboratorio que se detallan aquí. Es importante destacar que el protocolo permite la expresión génica en ausencia de una fase líquida externa. Esto significa que el sistema es autónomo y no requiere un baño de reacción libre de células. A diferencia de los métodos anteriores en los que se producían reacciones de CFPS dentro de los hidrogeles, con este método se elimina el requisito de tampones externos y recipientes de reacción. Se prevé que estos métodos permitirán a los investigadores explorar el uso de materiales de hidrogel como chasis para dispositivos de biología sintética libres de células, lo que en última instancia proporcionará una ruta para sacar dichos dispositivos del laboratorio.

Para el éxito de ambos enfoques es fundamental el uso de lisados celulares de alta calidad. Un lisado celular de alta calidad debe tener una alta concentración de proteínas (>40 mg/ml), debe mantenerse frío durante la preparación y no debe haber sido sometido a ciclos repetidos de congelación y descongelación. Además, es fundamental que las plantillas de ADN sean de alta pureza. Para lograr esto, los plásmidos deben extraerse de las células utilizando un kit de preparación de plásmidos de alta pureza y alto rendimiento para que las reacciones transcripcionales se lleven a cabo dentro del entorno CFPS. Estas etapas críticas son comunes a todas las aplicaciones de CFPS y no son exclusivas de este método. No obstante, es la preparación de los componentes de la PPC lo que tiene el mayor impacto en la eficacia de los protocolos. En cuanto a los materiales, es necesario lograr una liofilización rápida y eficaz de los hidrogeles. Si el liofilizador no alcanza una temperatura suficientemente fría (por debajo de -45 °C), el gel se secará en lugar de liofilizarse, lo que puede comprometer la estructura interna de la matriz de hidrogel y puede causar la degradación de los sistemas CFPS integrados. El método B también tiene una preocupación única; específicamente, al agregar la mezcla de CFPS a la agarosa fundida para formar el gel, la agarosa fundida debe dejarse enfriar lo suficiente antes de agregar la mezcla de CFPS para evitar la degradación térmica de las reacciones de CFPS. Sin embargo, dejar que la agarosa se enfríe demasiado dará como resultado la polimerización del gel y evitará la adición del sistema CFPS. Finalmente, los hidrogeles poseen un grado de autofluorescencia, que puede entrar en conflicto con las señales de fluorescencia generadas durante las reacciones CFPS. Por lo tanto, es importante incluir controles negativos apropiados y reporteros genéticos que no tengan las mismas características de fluorescencia que el material.

Los protocolos que se muestran aquí se centran en el uso de agarosa como hidrogel modelo. La agarosa es un excelente sistema modelo para este trabajo, ya que está ampliamente disponible, es barato y demuestra excelentes capacidades de producción de proteínas. Investigaciones previas también han demostrado que la agarosa puede ser un sustituto del agente de aglomeración PEG en las reacciones de CFPS, lo que indica que las interacciones entre el chasis polimérico y las reacciones de CFPS pueden mejorar la producción de proteínas11. Estos métodos, sin embargo, también son susceptibles de modificaciones utilizando una amplia gama de matrices de hidrogel alternativas con diferentes propiedades físicas y químicas. El método se ha aplicado a la goma xantana, al alginato, a la goma acil gellan, a la poliacrilamida, a los hidrogeles de ácido hialurónico y a los geles de poloxámero F-108 y F-1279. En algunos escenarios, se observa una reducción de la producción de proteínas en comparación con los controles líquidos u otros hidrogeles. No obstante, en estos escenarios, se puede llegar a un acuerdo de compensación, en el que la funcionalidad del propio material (por ejemplo, sus propiedades adhesivas o su biocompatibilidad) es de gran beneficio, de modo que puede aceptarse una reducción de la producción de proteínas. También se pueden realizar modificaciones en las concentraciones de los hidrogeles. En el caso de la agarosa, los métodos son susceptibles a concentraciones de polímeros en el rango de 0,5%-1,5% p/v, por ejemplo. Una mayor concentración de gel suele dar lugar, en un sentido material, a un dispositivo más robusto que es más resistente a la manipulación y conserva mejor la reacción de CFPS en su interior. Sin embargo, la contrapartida con el aumento de la concentración de gel es que la reacción puede tener una tasa de producción o un rendimiento de proteína reducidos11,37. Sin embargo, la relación entre la concentración del polímero y la producción de proteínas no es lineal y varía según el hidrogel utilizado11. Como tal, para cualquier nuevo polímero de hidrogel, se requiere un grado de experimentación para equilibrar la funcionalidad del material con la funcionalidad libre de células.

La inclusión de reacciones de CFPS en materiales de hidrogel sin necesidad de tampones externos representa una ruta interesante para el despliegue de dispositivos libres de células. Los dispositivos libres de células tienen la ventaja de eliminar la necesidad de liberar organismos modificados genéticamente fuera de un entorno de laboratorio controlado. Además, la inclusión de reacciones en hidrogeles elimina la necesidad de recipientes de reacción (generalmente artículos de plástico) después de la reconstitución. Dado que muchos hidrogeles son biodegradables, esto ofrece una ruta potencial para reducir los desechos plásticos. Del mismo modo, el protocolo detallado aquí también demuestra que tanto el hidrogel como el CFPS son susceptibles de liofilización. Si bien no se recomiendan ciclos repetidos de liofilización y es probable que dañen el CFPS y la función del hidrogel, para dispositivos de un solo uso. La capacidad de liofilizar y reconstituir los componentes reduce el peso del dispositivo y elimina la necesidad de una cadena de frío durante el transporte. En última instancia, estas propiedades simplifican la logística y reducen los costos de transporte de los dispositivos. Además, los hidrogeles tienen muchas propiedades funcionales útiles por sí mismos; Por ejemplo, pueden actuar como pastas, lubricantes y adhesivos. Los hidrogeles también pueden ser biocompatibles, biodegradables y poseer estímulos-respuestas por derecho propio. En conjunto, se puede lograr una sinergia entre la funcionalidad biológica y la ciencia de los materiales para crear una nueva clase de materiales bioprogramables.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Los autores agradecen enormemente el apoyo de los premios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) y BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), y del Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas - Laboratorios de Ciencia y Tecnología de Defensa EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Los datos que respaldan esta publicación están disponibles en abierto en: 10.25405/data.ncl.22232452. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

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Biología Número 196 Síntesis de proteínas libres de células CFPS biología sintética redes de genes sintéticos hidrogeles biosensores expresión génica expresión de proteínas
Métodos para incorporar reacciones de síntesis de proteínas libres de células en hidrogeles a macroescala
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