Summary
여기에서 우리는 외부 액상 없이 매크로 스케일 하이드로겔 매트릭스에 cell-free 단백질 합성 반응을 포함하기 위한 두 가지 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
합성 유전자 네트워크는 과학자와 엔지니어가 유전자 수준에서 인코딩된 기능을 갖춘 새로운 시스템을 설계하고 구축할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 유전자 네트워크 배치에 대한 지배적인 패러다임은 세포 섀시 내에 있지만 합성 유전자 네트워크는 무세포 환경에도 배치될 수 있습니다. 무세포 유전자 네트워크의 유망한 응용 분야에는 바이오센서가 포함되며, 이러한 장치는 생물(에볼라, 지카 및 SARS-CoV-2 바이러스) 및 비생물적(중금속, 황화물, 살충제 및 기타 유기 오염 물질) 표적에 대해 입증되었습니다. Cell-free 시스템은 일반적으로 반응 용기 내에 액체 형태로 배치됩니다. 그러나 이러한 반응을 물리적 매트릭스에 포함시킬 수 있으면 더 넓은 환경에서 더 광범위한 적용을 용이하게 할 수 있습니다. 이를 위해, 다양한 하이드로겔 매트릭스에 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis, CFPS) 반응을 내장하는 방법들이 개발되었다. 이 작업에 도움이 되는 하이드로겔의 주요 특성 중 하나는 하이드로겔 재료의 고수위 재구성 능력입니다. 또한 하이드로겔은 기능적으로 유익한 물리적, 화학적 특성을 가지고 있습니다. 하이드로겔은 저장을 위해 동결 건조하고 나중에 사용하기 위해 재수화할 수 있습니다. 하이드로겔에 CFPS 반응을 포함시키고 분석하기 위한 두 가지 단계별 프로토콜이 제시됩니다. 첫째, CFPS 시스템은 세포 용해물로 재수화를 통해 하이드로겔에 통합될 수 있습니다. 이어서, 하이드로겔 내의 시스템은 하이드로겔을 통해 완전한 단백질 발현을 위해 구성적으로 유도 또는 발현될 수 있다. 둘째, 세포 용해물은 중합 시점에서 하이드로겔에 도입될 수 있고, 전체 시스템은 하이드로겔 내에서 코딩되는 발현 시스템을 위한 유도제를 함유하는 수용액으로 동결건조 및 추후 시점에서 재수화될 수 있다. 이러한 방법은 하이드로겔 물질에 감각 기능을 부여하는 무세포 유전자 네트워크를 허용할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 실험실 외부로 배포할 수 있습니다.
Introduction
합성 생물학은 다양한 공학 분야를 통합하여 자연에서 볼 수 없는 기능을 수행할 수 있는 생물학적 기반 부품, 장치 및 시스템을 설계하고 엔지니어링합니다. 대부분의 합성 생물학 접근법은 여전히 살아있는 세포에 묶여 있습니다. 대조적으로, cell-free 합성 생물학 시스템은 전례 없는 수준의 제어와 설계의 자유를 촉진하여 전통적인 세포 기반 유전자 발현 방법 1,2,3의 많은 제약을 제거하면서 생물학적 시스템 엔지니어링을 위한 유연성을 높이고 시간을 단축할 수 있습니다. CFPS는 인공 세포 구성, 유전 회로 프로토타이핑, 바이오센서 개발, 대사산물 생산 등 다양한 분야에서 점점 더 많은 응용 분야에서 사용되고 있습니다 4,5,6. CFPS는 또한 응집되기 쉬운 단백질, 막횡단 단백질 및 독성 단백질 6,7,8과 같이 살아있는 세포에서 쉽게 발현될 수 없는 재조합 단백질을 생산하는 데 특히 유용했습니다.
CFPS는 일반적으로 액체 반응에서 수행됩니다. 그러나 이것은 액체 무세포 장치가 반응 용기 내에 포함되어야 하기 때문에 일부 상황에서는 배치를 제한할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법 개발의 근거는 단백질 생산 플랫폼 자체가 아니라 하이드로겔을 물리적 섀시로 사용할 수 있도록 하기 위해 무세포 합성 생물학 장치를 하이드로겔에 내장하기 위한 강력한 프로토콜을 제공하는 것이었습니다. 하이드로겔을 CFPS 섀시로 사용하면 몇 가지 장점이 있습니다. 하이드로겔은 높은 수분 함량(때로는 98% 초과)에도 불구하고 고체 특성 9,10,11을 갖는 고분자 물질입니다. 그들은 페이스트, 윤활제 및 접착제로 사용되며 콘택트 렌즈, 상처 드레싱, 해양 접착 테이프, 토양 개량제 및 아기 기저귀와 같은 다양한 제품에 존재합니다 9,11,12,13,14. 하이드로겔은 또한 약물 전달 비히클로서 활발히 연구되고 있다 9,15,16,17. 하이드로겔은 또한 생체적합성, 생분해성일 수 있으며, 그들 자신의자극 반응을 가질 수 있다 9,18,19,20. 따라서 여기서 목표는 분자 생물학에서 파생된 기능성과 재료 과학 간의 시너지 효과를 창출하는 것입니다. 이를 위해 콜라겐, 라포나이트, 폴리아크릴아미드, 피브린, PEG-펩타이드 및 아가로스 11,21,22를 포함한 다양한 물질과 무세포 합성 생물학을 통합하고 유리, 종이 및 천 11,23,24의 표면을 코팅하기 위한 노력이 이루어졌습니다 CFPS 장치로. 여기에 제시된 프로토콜은 아가로스를 예시 물질로 사용하여 거시적 규모(즉, >1mm) 하이드로겔 매트릭스에 CFPS 반응을 매립하는 두 가지 방법을 보여줍니다. 아가로스는 그의 높은 수분 흡수 능력, 제어된 자가-겔화 특성, 및 조정 가능한 기계적 특성 11,24,25,26 때문에 선택되었다. Agarose는 또한 기능성 CFPS를 지원하고 다른 많은 하이드로겔 대안보다 저렴하며 생분해성이어서 실험 모델 시스템으로 매력적인 선택입니다. 그러나, 이들 방법들은 이전에 CFPS를 다양한 대안적 하이드로겔에 매립시키기에 적합한 것으로 입증되었다(11). 하이드로겔의 광범위한 응용과 CFPS의 기능을 고려할 때, 여기에서 입증된 방법은 연구자들이 자신의 목적에 적합한 생물학적으로 강화된 하이드로겔 재료를 개발할 수 있는 기반을 제공할 수 있습니다.
이전 연구에서, 1 μm 내지 400 μm의 크기 범위를 갖는 마이크로겔 시스템은 반응 완충액 23,27,28,29,30,31에 잠긴 하이드로겔에서 CFPS를 수행하기 위해 사용되었다. 그러나 CFPS 반응 완충액 내에 하이드로겔을 담그야 한다는 요구 사항은 그 자체로 물질로 배치할 수 있는 기회를 제한합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 반응 완충액에 겔을 담그지 않고도 하이드로겔 내에서 CFPS 반응이 일어날 수 있도록 합니다. 둘째, 거대 스케일 젤(2mm에서 10mm 사이)을 사용하면 하이드로겔과 무세포 유전자 발현 사이의 물리적 상호작용을 연구할 수 있습니다. 예를 들어, 이 기술을 이용하여, 하이드로겔 매트릭스가 CFPS 반응(11)에 어떻게 영향을 미치는지, 그리고 CFPS 반응이 하이드로겔 매트릭스(31)에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 연구할 수 있다. 더 큰 크기의 하이드로겔은 또한 신규한, 생체-프로그램가능한 물질의 개발을 가능하게 한다32. 마지막으로, CFPS 반응을 하이드로겔에 내장함으로써 플라스틱 반응 용기에 대한 요구 사항도 잠재적으로 감소할 수 있습니다. cell-free 센서의 배치를 위해, 이것은 플라스틱 제품에 의존하는 장치에 비해 분명한 이점이 있습니다. 종합하면, 하이드로겔에 CFPS 반응을 내장하면 실험실 이외의 무세포 장치를 배치할 때 몇 가지 이점이 있습니다.
여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 하이드로겔 매트릭스 내에서 CFPS 반응의 작동을 허용하는 것입니다. 거시적 규모의 하이드로겔 재료에 cell-free 단백질 생산 반응을 임베딩하기 위한 두 가지 방법이 시연됩니다(그림 1). 방법 A에서, CFPS 성분은 활성 시스템을 형성하기 위해 동결건조된 아가로스 히드로겔에 도입된다. 방법 B에서, 용융된 아가로스를 CFPS 반응 성분과 혼합하여 완전한 CFPS 하이드로겔 시스템을 형성한 다음, 동결건조하고 필요할 때까지 저장한다. 이러한 시스템은 대량의 물 또는 완충액으로 재수화되고 분석물이 반응을 시작할 수 있습니다.
이 연구는 대장균 세포 용해물 기반 시스템을 사용합니다. 이들은 대장균 세포 용해물 준비가 간단하고 저렴하며 높은 단백질 수율을 달성하기 때문에 가장 인기 있는 실험용 CFPS 시스템 중 일부입니다. 세포 용해물은 리보솜, tRNA, 아미노아실-tRNA 합성효소, 개시, 신장 및 종결 인자를 포함하여 전사 및 번역을 수행하는 데 필요한 거대분자 성분으로 보완됩니다. 특히, 이 논문은 대장균 세포 용해물을 사용하여 아가로스 하이드로겔에서 eGFP 및 mCherry의 생산을 보여주고 플레이트 리더 및 컨포칼 현미경을 사용하여 형광의 외관을 모니터링합니다. 마이크로타이터 플레이트 판독기에 대한 대표적인 결과는 Whitfield et al.31에서 볼 수 있으며, 기본 데이터는 공개적으로 이용 가능하다 33. 또한, 겔 전체에 걸친 형광 단백질의 발현은 공초점 현미경을 사용하여 확인된다. 이 논문에서 입증된 두 가지 프로토콜은 현장 배치를 지원하는 방식으로 cell-free 유전자 회로의 분포에 적합한 물리적 환경을 만드는 궁극적인 목표와 함께 재료에서 CFPS 기반 유전자 장치의 조립 및 저장을 허용합니다.
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Protocol
1. 세포 용해물 완충액 및 배지 준비
- 2x YT+P 한천 및 배지의 제조
- 16g/L 트립톤, 10g/L 효모 추출물, 5g/L NaCl, 40mL/L 1M K 2HPO 4, 22mL/L 1M KH 2PO4 및 15g/L 한천을 측정하여2xYT+P 한천을 준비합니다. 2x YT+P 국물의 경우 이전 구성을 따르되 한천은 생략합니다.
- 2x YT+P를 고압증기멸균하여 살균합니다.
- S30A 버퍼의 제조
- 아세트산으로 pH 30로 조정된 5.88g/L Mg-글루타메이트, 12.195g/L K-글루타메이트 및 25mL/L 2M Tris로 S2A 완충액을 준비합니다.
- S30A 버퍼를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
- S30B 완충액의 제조
- 30 g / L Mg- 글루타메이트 5.88 g / L 및 12.195 g / L K- 글루타메이트로 S8.2B 버퍼를 준비하고 2 M Tris로 pH 2로 조정합니다.
- S30B 버퍼를 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
2. 세포 용해물 준비(4일 프로토콜)
- 1일차
- 2x YT+P를 100μg/mL 암피실린이 보충된 한천 플레이트에 붓습니다.
- -80°C 글리세롤 스톡으로부터 대장균 을 줄무늬로 채취하고, 37°C에서 밤새 배양한다.
- 2일차
- 2x YT+P 플레이트의 단일 콜로니를 1L 당황한 플라스크에 400mL의 2x YT+P 브로스(암피실린 보충)에 접종합니다.
- 37°C에서 220rpm 진탕으로 24시간 동안 배양합니다.
- 3일차
- 24시간 배양의 OD600 을 측정하고 기록합니다. 성장은 3-4의OD600 에서 충분합니다.
참고: 박테리아 배양액 1mL 분취량을 취하고 OD600nm 를 측정하기 전에 배지(2x YT+P 브로스)로 연속 희석을 수행합니다. OD600을 계산할 때 희석 효과를 허용하십시오. - 미리 냉각된 500mL 원심분리기 병 사이에 배양물을 고르게 옮깁니다.
- 4°C에서 15분 동안 4,500 x g 로 원심분리한 다음, 상층액을 버린다.
- 원심분리하는 동안 이전에 준비한 S30A 버퍼에 2mL/L의 1M DTT를 추가하고 혼합한 다음 버퍼를 얼음 위에 유지하여 S30A 버퍼 준비를 완료합니다.
- 세포 펠릿을 200mL의 S30A 완충액에 재현탁합니다.
- 전체 펠릿이 완전히 용해될 때까지 병을 세게 소용돌이치며 세포를 가능한 한 얼음 위에 유지합니다.
- 4°C에서 15분 동안 4,500 x g 로 원심분리한 다음, 상층액을 버린다.
- 2.3.5-2.3.7단계(포함)를 반복합니다.
- 각 원심분리기 병에 S30A 버퍼 40mL를 추가하고, 펠릿을 재현탁하고, 미리 칭량된 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 4,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 디캔팅(decanting)하여 상등액을 버리고, 잔류 상등액을 피펫으로 제거하여 가능한 한 얼음 위에 보관합니다.
- 원심분리기 튜브의 무게를 다시 측정하고 새 질량을 기록하고 펠릿의 질량을 계산합니다.
- 펠릿을 액체 질소에서 급속 동결하고 -80 °C에서 보관합니다.
- 24시간 배양의 OD600 을 측정하고 기록합니다. 성장은 3-4의OD600 에서 충분합니다.
- 4일차
- 펠릿을 얼음에 해동하십시오.
- 펠렛 1g당 S30A 완충액 1.2mL(사용 전 DTT 추가), 프로테아제 억제제 275μL(8mM 스톡) 및 리소자임 25μL(10mg/mL 스톡)를 추가합니다.
- 펠릿이 덩어리가 남지 않고 완전히 용해될 때까지 격렬하게 소용돌이치며 가능한 한 얼음 위에 유지합니다.
- 50mL 원심분리기 튜브에서 5분 동안 120W, 20kHz, 30% 진폭 및 20초/40초 온/오프 펄스에서 세포 현탁액을 초음파 처리합니다.
- 4°C에서 1시간 동안 4,000 x g 에서 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.
- 상층액을 신선한 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 튜브를 37°C에서 220rpm으로 80분 동안 배양합니다.
- S30B 완충액에 1M DTT 1mL/L를 추가하여 투석 물질을 준비합니다. 900mL를 혼합하여 1L 멸균 비커에 추가합니다. 마그네틱 교반기를 추가하고 4°C로 유지합니다.
- 유출 반응에 이어 단계 2.4.7의 세포 추출물을 2mL 미세원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 20,000 x g 에서 원심분리합니다.
- 50mL 원심분리기 튜브의 얼음에 펠렛이 없는 상층액을 통합합니다.
- 생성된 세포 추출물의 총 부피를 결정하고 필요한 수의 10K MWCO 투석 카세트를 S30B에 2분 동안 담가 수화합니다.
- 최대 3mL의 추출물이 담긴 주사기를 통해 카세트를 로드합니다. 1L 비커당 최대 3개의 카세트를 투석하고 4°C에서 3시간 동안 교반합니다.
- 추출물을 정화하는 투석이 완료된 후 추출물을 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 10분 동안 20,000 x g 로 원심분리합니다.
- 정제된 추출물을 얼음 위의 신선한 원심분리기 튜브에 넣고 간단히 소용돌이쳐 혼합합니다.
- 형광측정기를 사용하여 추출물의 단백질 농도를 측정합니다.
- 미리 냉각된 ddH2O를 사용하여 추출물을 44.5mg/mL의 농도로 희석합니다.
- 200 μL 분취량으로 분취하고, 액체 질소에서 급속 동결하고, -80 °C에서 보관한다.
3. 동결건조된 하이드로겔의 제조(방법 A)
- 0.75 g의 아가로스를 칭량하고,ddH2O를 100 mL의 부피에 첨가하고, 고온에서 30초 동안 마이크로파로 가하여 용융된 아가로스 스톡을 생성한다.
- 피펫을 사용하여 용융된 아가로오스 50μL를 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고 겔이 20-30분 동안 중합되도록 합니다(겔을 냉장고로 옮기면 중합이 더 빨라짐).
- 중합된 겔이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브를 액체 질소에서 급속 동결합니다.
- 원심분리기 튜브의 뚜껑을 제거하고 원심분리기 튜브 구멍을 왁스 필름으로 덮은 다음 바늘이나 피펫 팁으로 필름을 여러 번 뚫습니다.
- 중합된 겔이 들어 있는 미세원심분리기 튜브를 -80°C 보관으로 1-2시간 동안 옮깁니다.
- -80°C 보관에서 원심분리기 튜브를 회수하고 동결 건조기에 넣어 튜브가 완전히 건조되었는지 확인합니다.
- 다음 설정으로 동결 건조기를 작동시키십시오: 온도: -20 °C, 압력: 0.1 mbar.
- 젤을 밤새 동결 건조시킵니다.
- 동결 건조기에서 겔을 회수하고 필요할 때까지 -80°C 보관에 넣습니다.
참고: 젤은 최대 1년 동안 동결 건조하여 보관할 수 있습니다.
4. 14x 에너지 용액 스톡의 제조
- 얼음 위의 15mL 원심분리기 튜브에 모든 반응 성분(표 1)을 결합하여 14x 에너지 용액을 생성합니다.
- 14x 에너지 용액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분취하고 -80°C에서 보관합니다(더 작은 부피의 분취량 사용 가능).
알림: 14x 에너지 용액은 튜브의 반복적인 동결-해동을 피하는 경우 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
5. 4x 아미노산 스톡의 제조
- RTS 아미노산 샘플러 키트의 20가지 아미노산 성분을 모두 얼음 위에서 해동합니다. 아미노산이 완전히 용해되도록 소용돌이칩니다.
- 50mL 원심분리기 튜브에서 20개의 아미노산을 모두 결합하고 용액이 투명해질 때까지 멸균 ddH2O. Vortex 12mL를 넣고 약간의 흰색 안개만 남깁니다.
- 4x 아미노산을 1.5mL 미세원심분리기 튜브(500μL 분취량)에 분취합니다.
- 액체 질소에서 4x 아미노산 용액 분취액을 급속 동결하고 분취량을 -80°C 보관으로 이동합니다.
6. Cell-free 버퍼 교정
참고: 하이드로겔 반응에 사용된 CFPS 버퍼는 Sun et al.35에서 수정된 Banks et al.34의 프로토콜에 따라 최적의 DTT, Mg-글루타메이트 및 K-글루타메이트 농도에 대해 보정되었습니다. 보정 반응 조성은 실험 설계(DOE) 방법을 사용하여 선택되었으며, K-글루타메이트(200mM, 400mM, 600mM, 1,000mM, 1,200mM, 1,400mM), Mg-글루타메이트(0mM, 10mM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM) 및 DTT(0mM, 5, 10mM, 15mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) 주식. JMP Pro 15를 사용하여 맞춤형 실험계획법 설계(표 2)를 생성하고 분석을 수행하여 최적의 요인 농도를 결정했습니다.
- 무세포 추출물을 -80°C 저장고에서 회수하고, 얼음 상에서 해동한다.
- 4x 아미노산, 14x 에너지 용액, 40% PEG-8000, 플라스미드 DNA, 3M K-글루타메이트, 100mM Mg-글루타메이트 및 100mM DTT 스톡을 얼음에서 해동합니다.
- 4x 아미노산 12.5μL, 14x 에너지 용액 3.57μL, 40% PEG-8000 2.5μL, 플라스미드 DNA 3μg, cell-free 추출물 10μL(44.5mg/mL)를 결합하여 보정 마스터 믹스를 만들고 ddH2O와 반응할 때마다 최대 35μL를 구성합니다.
- 35 μL의 마스터 믹스를 검은색 384웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 분배합니다.
- DOE 설계에 따라 ddH2O와 함께 적절한 부피의 Mg-글루타메이트, K-글루타메이트 및 DTT를 각 반응에 추가하여 각 반응을 최대 50μL로 만듭니다.
- 형광 검출 및 분석을 위해 마이크로타이터 플레이트를 플레이트 리더로 옮깁니다(mCherry의 경우): 여기: 587nm, 방출: 610nm, 파장 대역폭: 12nm, 광학: 상단, 온도: 37°C, 형광 판독값은 총 판독 시간의 4시간 동안 5분마다 수집됩니다. 60rpm의 펄스 설정에서 흔들면서 플레이트를 배양합니다.
- 결과를 JMP DOE 설계에 업로드하고 원하는 반응 변수를 기반으로 K-글루타메이트, Mg-글루타메이트 및 DTT에 대한 최적 농도 수준을 결정하기 위한 예측 프로파일을 생성합니다. 이 경우, 최대 형광 및 반응 속도는 반응 변수였다.
- 표 3과 같이 시약을 결합하여 2X CFPS 버퍼를 만듭니다
- 분취량 및 -80°C에서 보관
7. 재수화된 동결건조 하이드로겔의 CFPS(방법 A)
참고: CFPS 반응에 사용된 플라스미드는 대장균36 에 대한 EcoFlex 모듈식 툴킷의 구성 요소를 사용하여 생성되었으며 Whitfield et al.11에 설명되어 있습니다. mCherry 및 eGFP는 구성적 JM23100 프로모터의 제어 하에 있었습니다. 이러한 구성 요소는 Addgene에서 사용할 수 있습니다.
- 무세포 추출물을 -80°C 저장소에서 회수하고 약 20분 동안 얼음에서 해동합니다.
- 2x CFPS 버퍼와 플라스미드 DNA를 수집하고 얼음에서 해동합니다.
- 동결 건조된 하이드로겔을 수집하고 겔을 벤치에 세워 놓아 15분 동안 실온에 도달하도록 합니다.
- 겔을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 필요한 경우 메스로 젤을 다듬어 웰에 맞도록 합니다.
- 1.5mL 미세원심분리기 튜브에서 무세포 추출물 10μL와 2x CFPS 완충액 25μL 및 플라스미드 DNA 4μg을 결합합니다. ddH2O로 총 부피 50 μL를 만들어 CFPS 용액을 만든다.
- CFPS 용액을 동결건조된 하이드로겔 상에 피펫팅한다.
- 젤을 실온에서 5-10분 동안 CFPS 시스템에 담가둡니다.
- 주걱을 사용하여 겔을 검은색 384웰 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다.
- 형광 검출 및 분석을 위해 마이크로타이터 플레이트를 플레이트 리더로 옮기고, 6.6단계에서 설명한 플레이트 리더 설정을 사용합니다. 대표적인 결과는 이전 연구31,33에서 사용할 수 있습니다.
8. 배치 가능한 하이드로겔에서 cell-free 단백질 합성(방법 B)
- -80°C 보관에서 무세포 추출물을 회수하고 약 20분 동안 얼음에서 해동합니다.
- 플라스미드 DNA를 수집하고 얼음에서 해동합니다.
- 얼음 위의 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 cell-free 추출물 10μL와 플라스미드 DNA 3μg 및 2x CFPS 완충액 25μL를 결합하여 총 부피 37.5μL를 만듭니다.
- 3 g의 아가로스를 측정하고, 100 mL의ddH2O완충액에 첨가하여 3% 아가로스를 생성한다.
- 전자레인지에 3% 아가로스를 고출력으로 30초 동안 터뜨립니다.
- 용융된 아가로스 12.5 μL를 총 부피 50 μL의 CFPS가 들어있는 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 피펫으로 혼합한다.
- 용융된 아가로스를 냉각시키되 중합하지 않도록 하고, 아가로스를 50°C로 설정된 열 블록에 남겨둔다.
- 용융된 아가로스를 CFPS 용액과 합하고; 피펫팅을 통해 혼합하고 팁으로 교반하고 CFPS 용액을 혼합하기 전에 겔 중합을 피하기 위해 빠르게 움직여야 합니다.
- 겔을 실온에서 식히고 약 2분 동안 중합합니다.
- 중합된 아가로스를 주걱으로 1.5mL 미세원심분리 튜브로 옮기고, 액체 질소에서 급속 동결시킨다.
- 급속 냉동 하이드로겔을 -80°C에 1시간 동안 보관합니다.
- 저장소에서 젤을 회수하십시오. 미세 원심분리기 튜브 뚜껑을 제거하고 튜브를 왁스 필름으로 덮고 필름을 뚫어 수분이 건조되도록 합니다.
- 다음 설정으로 동결 건조기를 작동시키십시오: 온도: -20 °C, 압력: 0.1 mbar, 18 시간 동안 동결 건조(야간).
- 동결 건조된 CFPS 장치를 사용할 때까지 -80°C 보관에 보관하십시오.
- 대략 습윤 부피가 50μL인 동결건조 CFPS 장치는 과잉 액체 없이 50μL의ddH2O로 재수화될 수 있습니다. 수분 보충에는 약 30분이 소요됩니다.
- 주걱을 사용하여 겔을 검은색 384웰 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다.
- 형광 검출 및 분석을 위해 마이크로타이터 플레이트를 플레이트 리더로 옮기고, 6.6단계에서 설명한 플레이트 리더 설정을 사용합니다. 대표적인 결과는 이전 간행물31,33에서 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 CFPS 반응을 하이드로겔 매트릭스에 삽입하는 두 가지 방법을 자세히 설명하며, 그림 1 은 두 가지 접근 방식에 대한 개략도를 보여줍니다. 두 방법 모두 동결 건조 및 장기 보관이 가능합니다. 방법 A는 두 가지 이유로 가장 많이 활용되는 방법론입니다. 첫째, 다양한 하이드로겔 물질(11)을 사용하는 데 가장 적합한 방법인 것으로 나타났다. 둘째, 방법 A는 유전 구조의 병렬 테스트를 허용합니다. 방법 B는 최적화된 시스템 제작 및 현장 배치에 더 적합합니다. 두 프로토콜 모두 실험 재현성을 돕기 위해 한 번에 많은 샘플을 준비할 수 있습니다. 이 기능은 또한 동결 건조 장치가 건조 상태로 배송되고 필요할 때 현장에서 재구성될 수 있기 때문에 기술의 장기적인 개발에도 유용합니다.
프로토콜 및 도 1 에 요약된 접근법은 단일 유전자 구축물의 발현 또는 다중 유전자의 동시발현을 위해 사용될 수 있다. 그림 2 에 제시된 데이터는 0.75% 아가로스 겔에서 eGFP와 mCherry의 발현을 보여줍니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 단백질 발현이 내부 평면 내를 포함하여 하이드로겔 전체에서 균질하다는 것을 확인했습니다. 구체적으로, 단백질 합성은 하이드로 젤의 바깥 가장자리에 국한되지 않았으며, 내부 형광은 단백질 확산의 결과가 아니었다. 이를 확인하기 위해 eGFP 발현 하이드로젤을 mCherry 발현 하이드로젤과 물리적으로 접촉시켜 하이드로젤 간에 단백질 확산을 확인할 수 있었습니다. 둘 사이의 확산 속도는 물질 내부의 적색 또는 녹색 형광의 광범위한 국소화를 설명하기에 충분하지 않았습니다. 이 실험은 또한 히드로겔에 무세포 장치를 배치하는 것의 주요 이점을 보여줍니다-장치 기능은 액체 무세포 반응에서는 불가능한 방식으로 공간적으로 구성될 수 있습니다. 또한, 유전자 네트워크의 생성을 위해서는 하나 이상의 유전자 산물의 동시 합성이 필요합니다. 도 2 (하단 행)에 나타낸 결과는 아가로스에서 mCherry 및 eGFP 모두의 동시 발현을 확인하였다. 이 연구에서는 두 단백질이 모두 발현되었으며 단백질 간의 공간적 경쟁은 없었습니다. 다시 말하지만, 적색 및 녹색 파장 범위의 오버레이는 하이드로겔 내에서 두 단백질의 균일한 공간 분포를 보여줍니다.
표 1: 14x 에너지 솔루션 주식. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: cell-free 단백질 합성 반응 내에서 DTT, Mg-글루타메이트 및 K-글루타메이트의 최적화를 위한 실험 어레이 설계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 2x CFPS 버퍼 구성 요소. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: 두 프로토콜의 개략도. 첫 번째 방법(방법 A, 이 논문에서 입증됨)에서는 하이드로겔 재료를 먼저 준비한 다음 무세포 성분 없이 동결 건조(1단계)합니다. 이러한 건조된 하이드로겔은 단백질 생산을 위한 배양 전에 정확한 부피의 무세포 반응으로 필요할 때(단계 2) 저장 및 재구성될 수 있으며(단계 3) 변형 방법인 방법 B는 초기 하이드로겔 제조에서 무세포 반응 성분의 전부 또는 일부를 통합합니다. 동결 건조 후(단계 1), 하이드로겔은 물 단독 또는 관심 분석물을 포함하는 완충액에서 재구성될 수 있습니다(단계 2). 단백질 생산 (3 단계)은 이전과 같이 계속됩니다. 동결 건조된 무세포 성분을 하이드로겔 폴리머로 재구성하는 세 번째 방법은 Whitfield et al.11 에 설명되어 있지만 현재까지 제한된 수의 하이드로겔에서만 사용되는 것으로 나타났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대장균 세포 용해물을 사용한 하이드로겔에서 eGFP 및 mCherry의 Cell-free 단백질 합성. 아가로스 겔(0.75%)은 4μg의 eGFP 또는 mCherry 주형(중간) 또는 4μg의 eGFP 및 mCherry 주형(아래)으로 DNA 주형(위) 없이 제조되었습니다. 하이드로겔을 적색 및 녹색 채널에서 공초점 현미경 검사 전에 4시간 동안 배양했습니다. 두 채널의 오버레이도 표시되며 오버레이에는 DIC(Differential Interference Contrast) 이미지가 포함됩니다. eGFP 또는 mCherry 템플릿을 포함하는 하이드로겔은 별도로 준비되었지만 서로 물리적으로 접촉하여 배양되었습니다. 겔 직경은 6mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 요약된 것은 대장균 세포 용해물 기반 CFPS 반응을 아가로스 하이드로겔에 통합하기 위한 두 가지 프로토콜입니다. 이러한 방법은 물질 전체에 걸쳐 동시 유전자 발현을 허용합니다. 이 프로토콜은 다른 CFPS 시스템에 적용할 수 있으며 여기에 자세히 설명된 실험실에서 준비한 세포 용해물 외에도 상업적으로 이용 가능한 CFPS 키트를 사용하여 성공적으로 수행되었습니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 외부 액상이 없는 상태에서 유전자 발현을 허용합니다. 이는 시스템이 독립적이며 cell-free 반응 수조가 필요하지 않음을 의미합니다. 하이드로겔 내에서 CFPS 반응이 발생했던 이전 방법과 달리 이 방법을 사용하면 외부 완충액 및 반응 용기에 대한 요구 사항이 제거됩니다. 이러한 방법을 통해 연구자들은 하이드로겔 물질을 무세포 합성 생물학 장치의 섀시로 사용하는 방법을 탐색할 수 있을 것으로 예상되며, 궁극적으로 이러한 장치를 실험실 밖으로 옮기는 경로를 제공할 수 있습니다.
두 접근법의 성공에 중요한 것은 고품질 세포 용해물의 사용입니다. 고품질 세포 용해물은 단백질 농도가 높아야 하고(>40mg/mL) 준비 기간 동안 차갑게 보관해야 하며 반복적인 동결-해동 주기를 거치지 않아야 합니다. 또한 DNA 템플릿의 순도가 높은 것이 중요합니다. 이를 위해서는 CFPS 환경 내에서 전사 반응이 진행될 수 있도록 고순도, 고수율 플라스미드 준비 키트를 사용하여 세포에서 플라스미드를 추출해야 합니다. 이러한 중요한 단계는 모든 CFPS 응용 분야에 공통적이며 이 방법에만 국한된 것은 아닙니다. 그럼에도 불구하고 프로토콜의 효율성에 가장 큰 영향을 미치는 것은 CFPS 구성 요소의 준비입니다. 재료 측면에서, 하이드로겔의 효과적이고 신속한 동결건조가 달성될 필요가 있다. 동결 건조기가 충분히 차가운 온도(-45°C 미만)에 도달하지 않으면 겔이 동결 건조되지 않고 건조되어 하이드로겔 매트릭스의 내부 구조가 손상되고 임베디드 CFPS 시스템이 저하될 수 있습니다. 방법 B 에는 또한 고유한 우려 사항이 있습니다. 구체적으로, 용융된 아가로스에 CFPS 혼합물을 첨가하여 겔을 형성하는 경우, 용융된 아가로스는 CFPS 반응에 대한 열분해를 방지하기 위해 CFPS 혼합물이 첨가되기 전에 충분히 냉각되도록 방치되어야 한다. 그러나, 아가로오스를 너무 많이 냉각시키도록 허용하면 겔의 중합이 초래되고 CFPS 시스템의 첨가가 방지된다. 마지막으로, 하이드로겔은 CFPS 반응 중에 생성된 형광 신호와 충돌할 수 있는 어느 정도의 자가형광을 가지고 있습니다. 따라서 물질과 동일한 형광 특성을 갖지 않는 적절한 음성 대조군과 유전자 리포터를 포함하는 것이 중요합니다.
여기에서 입증된 프로토콜은 모델 하이드로겔로서 아가로스의 사용에 중점을 둡니다. Agarose는 널리 이용 가능하고 저렴하며 우수한 단백질 생산 능력을 보여주기 때문에 이 작업을 위한 우수한 모델 시스템입니다. 이전의 연구들은 또한 아가로스가 CFPS 반응에서 밀집제 PEG에 대한 대체물이 될 수 있다는 것을 입증하였으며, 이는 중합체 섀시와 CFPS 반응 사이의 상호작용이 단백질 생산을 향상시킬 수 있음을 나타낸다11. 그러나 이러한 방법은 다양한 물리적 및 화학적 특성을 가진 광범위한 대체 하이드로겔 매트릭스를 사용하여 변형할 수도 있습니다. 상기 방법은 잔탄검, 알지네이트, 아실젤란검, 폴리아크릴아미드, 히알루론산 하이드로겔, 및 폴록사머 겔 F-108 및 F-127에 적용되었다9. 일부 시나리오에서는 액체 대조군 또는 다른 하이드로겔에 비해 감소된 단백질 생산이 관찰됩니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 시나리오에서, 물질 자체의 기능성(예를 들어, 그의 접착 특성 또는 생체적합성)이 단백질 생산의 감소가 받아들여질 수 있도록 상당한 이점을 갖는 트레이드-오프가 충족될 수 있다. 하이드로겔의 농도에 대한 변형도 이루어질 수 있다. 아가로스의 경우, 상기 방법은 예를 들어 0.5%-1.5% w/v 범위의 중합체 농도에 순응할 수 있다. 일반적으로 물질적 의미에서 겔 농도가 높을수록 취급에 더 탄력적이고 내부의 CFPS 반응을 더 잘 보존하는 보다 견고한 장치가 생성됩니다. 그러나, 증가된 겔 농도와의 트레이드오프는 반응이 감소된 생산 속도 또는 단백질 수율을 가질 수 있다는 것이다11,37. 그러나 고분자 농도와 단백질 생산 사이의 관계는 선형적이지 않으며 사용된 하이드로겔에 따라 다르다11. 따라서 새로운 하이드로겔 폴리머의 경우 재료 기능성과 무세포 기능의 균형을 맞추기 위해 어느 정도의 실험이 필요합니다.
외부 완충액 없이 하이드로겔 물질에 CFPS 반응을 임베딩하는 것은 cell-free 장치의 배치를 위한 흥미로운 경로를 나타냅니다. 무세포 장치는 통제된 실험실 환경 외부에서 유전자 조작 유기체를 방출할 필요가 없다는 이점이 있습니다. 또한, 하이드로겔에 반응을 내장하면 재구성 후 반응 용기(일반적으로 플라스틱 용기)가 필요하지 않습니다. 많은 하이드로겔이 생분해된다는 점을 감안할 때 이는 플라스틱 폐기물을 줄일 수 있는 잠재적인 경로를 제공합니다. 마찬가지로, 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 하이드로겔과 CFPS 모두 동결 건조가 가능하다는 것을 보여줍니다. 동결건조의 반복적인 주기는 권장되지 않으며 CFPS 및 하이드로겔 기능을 손상시킬 수 있지만 일회용 장치의 경우. 부품을 동결 건조 및 재구성할 수 있는 기능은 장치 무게를 줄이고 운송 중 콜드 체인에 대한 요구 사항을 제거합니다. 이러한 특성은 궁극적으로 물류를 단순화하고 장치의 운송 비용을 절감합니다. 또한, 하이드로겔은 그 자체로 많은 유용한 기능적 특성을 가지고 있습니다. 예를 들어, 페이스트, 윤활제 및 접착제 역할을 할 수 있습니다. 하이드로겔은 또한 생체 적합성, 생분해성, 그리고 그 자체로 자극 반응을 가질 수 있습니다. 종합하면, 생물학적 기능성과 재료 과학 간의 시너지 효과를 달성하여 새로운 종류의 생체 프로그래밍 가능 재료를 만들 수 있습니다.
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Disclosures
없음.
Acknowledgments
저자는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회(Biotechnology and Biological Sciences Research Council) 상 BB/V017551/1(S.K., T.P.H.) 및 BB/W01095X/1(A.L., T.P.H.)과 공학 및 물리 과학 연구 위원회(Engineering and Physical Sciences Research Council) - 국방 과학 기술 연구소(Defense Science and Technology Laboratories) 상 EP/N026683/1(C.J.W., A.M.B., T.P.H.)의 지원을 크게 인정합니다. 이 간행물을 뒷받침하는 데이터는 10.25405/data.ncl.22232452에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 CC BY(Creative Commons Attribution) 라이선스를 적용했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
References
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