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Biology

Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65500
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo due protocolli per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in matrici di idrogel su macroscala senza la necessità di una fase liquida esterna.

Abstract

Le reti di geni sintetici forniscono una piattaforma per scienziati e ingegneri per progettare e costruire nuovi sistemi con funzionalità codificate a livello genetico. Mentre il paradigma dominante per l'implementazione di reti geniche è all'interno di un telaio cellulare, le reti genetiche sintetiche possono anche essere implementate in ambienti privi di cellule. Le applicazioni promettenti delle reti di geni privi di cellule includono i biosensori, poiché questi dispositivi sono stati dimostrati contro bersagli biotici (virus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abiotici (metalli pesanti, solfuri, pesticidi e altri contaminanti organici). I sistemi privi di cellule sono tipicamente distribuiti in forma liquida all'interno di un recipiente di reazione. Essere in grado di incorporare tali reazioni in una matrice fisica, tuttavia, può facilitare la loro più ampia applicazione in un insieme più ampio di ambienti. A tal fine, sono stati sviluppati metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica libera da cellule (CFPS) in una varietà di matrici di idrogel. Una delle proprietà chiave degli idrogel che favoriscono questo lavoro è l'elevata capacità di ricostituzione dell'acqua dei materiali idrogel. Inoltre, gli idrogel possiedono caratteristiche fisiche e chimiche funzionalmente vantaggiose. Gli idrogel possono essere liofilizzati per la conservazione e reidratati per un uso successivo. Vengono presentati due protocolli passo-passo per l'inclusione e il dosaggio delle reazioni CFPS negli idrogel. In primo luogo, un sistema CFPS può essere incorporato in un idrogel tramite reidratazione con un lisato cellulare. Il sistema all'interno dell'idrogel può quindi essere indotto o espresso costitutivamente per la completa espressione proteica attraverso l'idrogel. In secondo luogo, il lisato cellulare può essere introdotto in un idrogel nel punto di polimerizzazione e l'intero sistema può essere liofilizzato e reidratato in un secondo momento con una soluzione acquosa contenente l'induttore per il sistema di espressione codificato all'interno dell'idrogel. Questi metodi hanno il potenziale per consentire reti geniche prive di cellule che conferiscono capacità sensoriali ai materiali idrogel, con il potenziale per la distribuzione al di fuori del laboratorio.

Introduction

La biologia sintetica integra diverse discipline ingegneristiche per progettare e ingegnerizzare parti, dispositivi e sistemi a base biologica in grado di svolgere funzioni che non si trovano in natura. La maggior parte degli approcci di biologia sintetica sono ancora legati a cellule viventi. Al contrario, i sistemi di biologia sintetica senza cellule facilitano livelli senza precedenti di controllo e libertà nella progettazione, consentendo una maggiore flessibilità e un tempo ridotto per l'ingegnerizzazione dei sistemi biologici, eliminando al contempo molti dei vincoli dei tradizionali metodi di espressione genica basati sulle cellule 1,2,3. La CFPS viene utilizzata in un numero crescente di applicazioni in numerose discipline, tra cui la costruzione di cellule artificiali, la prototipazione di circuiti genetici, lo sviluppo di biosensori e la produzione di metaboliti 4,5,6. La CFPS è stata anche particolarmente utile per la produzione di proteine ricombinanti che non possono essere prontamente espresse nelle cellule viventi, come le proteine inclini all'aggregazione, le proteine transmembrana e le proteine tossiche 6,7,8.

La CFPS viene tipicamente eseguita in reazioni liquide. Questo, tuttavia, può limitarne l'impiego in alcune situazioni, poiché qualsiasi dispositivo privo di cellule liquide deve essere contenuto all'interno di un recipiente di reazione. La logica per lo sviluppo dei metodi qui presentati era quella di fornire protocolli robusti per incorporare dispositivi di biologia sintetica privi di cellule in idrogel, non come piattaforma di produzione di proteine di per sé ma, invece, per consentire l'uso di idrogel come telaio fisico per l'implementazione di dispositivi privi di cellule al di fuori del laboratorio. L'uso di idrogel come telaio CFPS presenta diversi vantaggi. Gli idrogel sono materiali polimerici che, nonostante un elevato contenuto di acqua (a volte superiore al 98%), possiedono proprietà solide 9,10,11. Hanno usi come paste, lubrificanti e adesivi e sono presenti in prodotti diversi come lenti a contatto, medicazioni per ferite, nastri adesivi marini, ammendanti e pannolini per bambini 9,11,12,13,14. Anche gli idrogel sono oggetto di studio attivo come veicoli di somministrazionedi farmaci 9,15,16,17. Gli idrogel possono anche essere biocompatibili, biodegradabili e possedere alcune risposte agli stimoliproprie 9,18,19,20. Pertanto, l'obiettivo è quello di creare una sinergia tra la funzionalità derivata dalla biologia molecolare e la scienza dei materiali. A tal fine, sono stati compiuti sforzi per integrare la biologia sintetica priva di cellule con una serie di materiali, tra cui collagene, laponite, poliacrilammide, fibrina, peptide PEG e agarosio 11,21,22, nonché per rivestire superfici di vetro, carta e stoffa11,23,24 con dispositivi CFPS. I protocolli qui presentati dimostrano due metodi per incorporare reazioni CFPS in matrici di idrogel su macroscala (cioè >1 mm), utilizzando l'agarosio come materiale esemplare. L'agarosio è stato scelto per la sua elevata capacità di assorbimento d'acqua, le proprietà autogelificanti controllate e le proprietà meccaniche regolabili 11,24,25,26. L'agarosio supporta anche la CFPS funzionale, è più economico di molte altre alternative all'idrogel ed è biodegradabile, il che lo rende una scelta interessante come sistema modello sperimentale. Tuttavia, questi metodi si sono dimostrati in precedenza appropriati per incorporare la CFPS in una gamma di idrogel alternativi11. Considerando l'ampia gamma di applicazioni degli idrogel e la funzionalità della CFPS, i metodi qui dimostrati possono fornire una base da cui i ricercatori sono in grado di sviluppare materiali idrogel biologicamente migliorati adatti ai propri scopi.

In studi precedenti, sono stati utilizzati sistemi microgel con una gamma di dimensioni da 1 μm a 400 μm per eseguire CFPS in idrogel immersi nel tampone di reazione 23,27,28,29,30,31. L'obbligo di immergere gli idrogel all'interno dei tamponi di reazione CFPS, tuttavia, limita le opportunità per il loro impiego come materiali a sé stanti. I protocolli qui presentati consentono alle reazioni CFPS di avvenire all'interno degli idrogel senza la necessità di immergere i gel nei tamponi di reazione. In secondo luogo, l'uso di gel su macroscala (di dimensioni comprese tra 2 mm e 10 mm) consente lo studio dell'interazione fisica tra idrogel ed espressione genica cell-free. Ad esempio, con questa tecnica, è possibile studiare come la matrice di idrogel influenzi le reazioni di CFPS11 e come le reazioni di CFPS possano influenzare la matrice di idrogel31. Le dimensioni maggiori degli idrogel consentono inoltre lo sviluppo di nuovi materiali bioprogrammabili32. Infine, incorporando le reazioni CFPS negli idrogel, c'è anche una potenziale riduzione della necessità di recipienti di reazione in plastica. Per l'impiego di sensori privi di celle, questo presenta chiari vantaggi rispetto ai dispositivi che dipendono dalla plastica. Nel complesso, l'incorporazione di reazioni CFPS in idrogel offre diversi vantaggi per l'implementazione di dispositivi privi di cellule al di fuori del laboratorio.

L'obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di consentire il funzionamento di reazioni CFPS all'interno di matrici di idrogel. Sono stati dimostrati due diversi metodi per incorporare reazioni di produzione di proteine prive di cellule in materiali idrogel su macroscala (Figura 1). Nel metodo A, i componenti della CFPS vengono introdotti in idrogel di agarosio liofilizzati per formare un sistema attivo. Nel metodo B, l'agarosio fuso viene miscelato con i componenti della reazione CFPS per formare un sistema completo di idrogel CFPS, che viene quindi liofilizzato e conservato fino al momento del bisogno. Questi sistemi possono essere reidratati con un volume di acqua o tampone e analita per iniziare la reazione.

Questo studio utilizza sistemi basati su lisato cellulare di Escherichia coli. Questi sono alcuni dei sistemi CFPS sperimentali più popolari, poiché la preparazione del lisato cellulare di E. coli è semplice, poco costosa e raggiunge elevate rese proteiche. Il lisato cellulare è integrato con i componenti macromolecolari necessari per eseguire la trascrizione e la traduzione, inclusi ribosomi, tRNA, aminoacil-tRNA sintetasi e fattori di inizio, allungamento e terminazione. In particolare, questo articolo dimostra la produzione di eGFP e mCherry in idrogel di agarosio utilizzando lisati cellulari di E. coli e monitora l'aspetto della fluorescenza utilizzando un lettore di piastre e microscopia confocale. I risultati rappresentativi per il lettore di piastre per microtitolazione possono essere visti in Whitfield et al.31 e i dati sottostanti sono disponibili al pubblico 33. Inoltre, l'espressione di proteine fluorescenti in tutti i gel è confermata utilizzando la microscopia confocale. I due protocolli dimostrati in questo documento consentono l'assemblaggio e la conservazione di dispositivi genetici basati su CFPS in materia con l'obiettivo finale di creare un ambiente fisico adatto per la distribuzione di circuiti genici privi di cellule in modo da supportare la distribuzione sul campo.

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Protocol

1. Tampone di lisato cellulare e preparazione dei terreni

  1. Preparazione di 2x YT+P agar e terreno
    1. Preparare 2x YT+P agar misurando 16 g/L di triptone, 10 g/L di estratto di lievito, 5 g/L di NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH2PO4 e 15 g/L di agar. Per il brodo 2x YT+P, seguire la composizione precedente ma omettere l'agar.
    2. Sterilizzare in autoclave il 2x YT+P.
  2. Preparazione del tampone S30A
    1. Preparare il tampone S30A con 5,88 g/L di Mg-glutammato, 12,195 g/L di K-glutammato e 25 mL/L 2 M Tris, regolato a pH 7,7 con acido acetico.
    2. Conservare il tampone S30A a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
  3. Preparazione del tampone S30B
    1. Preparare il tampone S30B con 5,88 g/L di Mg-glutammato e 12,195 g/L di K-glutammato, regolato a pH 8,2 con 2 M Tris.
    2. Conservare il tampone S30B a 4 °C per un massimo di 1 settimana.

2. Preparazione del lisato cellulare (protocollo di 4 giorni)

  1. Giorno 1
    1. Versare i 2x YT+P in piastre di agar integrate con 100 μg/mL di ampicillina.
    2. Striare E. coli da un ceppo di glicerolo a -80 °C e incubare per una notte a 37 °C.
  2. Giorno 2
    1. Inoculare una singola colonia dalla piastra 2x YT+P in 400 mL di brodo 2x YT+P (integrato con ampicillina) in un pallone deflettore da 1 L.
    2. Incubare per 24 ore a 37 °C agitando a 220 giri/min.
  3. Giorno 3
    1. Misurare e registrare l'OD600 delle colture 24 h; la crescita è sufficiente ad un OD600 di 3-4.
      NOTA: Prelevare un'aliquota di 1 mL di coltura batterica ed eseguire una diluizione seriale con terreno (brodo 2x YT+P) prima di misurare l'OD600 nm. Tenere conto dell'effetto di diluizione nel calcolo dell'OD600.
    2. Trasferire la coltura in modo uniforme tra flaconi da centrifuga da 500 ml prerefrigerati.
    3. Centrifugare a 4.500 x g per 15 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante.
    4. Durante la centrifugazione, completare la preparazione del tampone S30A aggiungendo 2 mL/L di 1 M DTT al tampone S30A precedentemente preparato, mescolando e mantenendo il tampone su ghiaccio.
    5. Risospendere i pellet cellulari in 200 mL di tampone S30A.
    6. Agitare energicamente le bottiglie fino a quando l'intero pellet non è completamente solubilizzato, mantenendo le cellule il più possibile ghiacciate.
    7. Centrifugare a 4.500 x g per 15 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante.
    8. Ripetere i passaggi 2.3.5-2.3.7 (inclusi).
    9. Aggiungere 40 mL di tampone S30A a ciascun flacone da centrifuga, risospendere i pellet e trasferirli in provette da centrifuga da 50 mL prepesate.
    10. Centrifugare a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante per decantazione e rimuovere il surnatante residuo con una pipetta, tenendolo il più possibile in ghiaccio.
    11. Pesare nuovamente le provette da centrifuga, registrare la nuova massa e calcolare la massa dei pellet.
    12. Congelare i pellet in azoto liquido e conservarli a -80 °C.
  4. Giorno 4
    1. Scongelare i pellet sul ghiaccio.
    2. Per 1 g di pellet, aggiungere quanto segue: 1,2 mL di tampone S30A (DTT aggiunto prima dell'uso), 275 μL di inibitore della proteasi (stock da 8 mM) e 25 μL di lisozima (stock da 10 mg/mL).
    3. Vorticare energicamente fino a quando i pellet non sono completamente solubilizzati senza lasciare grumi, mantenendoli il più possibile in ghiaccio.
    4. In provette da centrifuga da 50 mL, sonicare le sospensioni cellulari a 120 W, 20 kHz, ampiezza del 30% e impulsi on/off di 20 s/40 s per 5 minuti di sonicazione.
    5. Centrifugare a 4.000 x g per 1 ora a 4 °C per pellettare i detriti cellulari.
    6. Trasferire il surnatante in provette da centrifuga fresche da 50 ml.
    7. Incubare le provette a 37 °C a 220 rpm per 80 min.
    8. Preparare i materiali per dialisi aggiungendo 1 mL/L di 1 M DTT al tampone S30B. Mescolare e aggiungere 900 ml in un becher sterile da 1 L. Aggiungere un agitatore magnetico e mantenerlo a 4 °C.
    9. Dopo la reazione di deflusso, trasferire l'estratto cellulare del passaggio 2.4.7 in provette da microcentrifuga da 2 mL e centrifugare a 20.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
    10. Consolidare il surnatante senza pellet su ghiaccio in una provetta da centrifuga da 50 mL.
    11. Determinare il volume totale di estratto cellulare prodotto e idratare il numero necessario di cassette per dialisi MWCO da 10K immergendole in S30B per 2 minuti.
    12. Caricare le cassette tramite una siringa con un massimo di 3 ml di estratto. Dializzare fino a tre cassette per becher da 1 L, agitando a 4 °C per 3 ore.
    13. Al termine della dialisi, che chiarifica l'estratto, trasferire l'estratto in provette da microcentrifuga da 2 ml. Centrifugare a 20.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
    14. Consolidare l'estratto chiarificato in una provetta da centrifuga fresca su ghiaccio e agitare brevemente per mescolare.
    15. Determinare la concentrazione proteica dell'estratto utilizzando un fluorimetro.
    16. Diluire l'estratto a una concentrazione di 44,5 mg/mL utilizzando ddH2O pre-raffreddato.
    17. Aliquote in aliquote da 200 μL, surgelazione in azoto liquido e conservazione a −80 °C.

3. Preparazione di idrogel liofilizzati (Metodo A)

  1. Pesare 0,75 g di agarosio, aggiungere ddH2O a un volume di 100 mL e cuocere nel microonde a raffica di 30 s ad alte temperature per creare un brodo di agarosio fuso.
  2. Utilizzando una pipetta, trasferire 50 μL di agarosio fuso in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e lasciare polimerizzare il gel per 20-30 minuti (la polimerizzazione avviene più velocemente se i gel vengono trasferiti in frigorifero).
  3. Congelare le provette della microcentrifuga, contenenti i gel polimerizzati, in azoto liquido.
  4. Rimuovere il coperchio delle provette da centrifuga, coprire le aperture delle provette da centrifuga con una pellicola di cera e forare la pellicola più volte con la punta di un ago o di una pipetta.
  5. Trasferire le provette della microcentrifuga contenenti i gel polimerizzati a una temperatura di conservazione a -80 °C per 1-2 ore.
  6. Recuperare le provette da centrifuga dalla conservazione a -80 °C e metterle in un liofilizzatore, assicurandosi che le provette siano completamente asciutte.
  7. Attivare il liofilizzatore con le seguenti impostazioni: temperatura: −20 °C, pressione: 0,1 mbar.
  8. Lasciare asciugare il gel per una notte.
  9. Recuperare i gel dal liofilizzatore e riporli in una temperatura di conservazione a −80 °C fino al momento del bisogno.
    NOTA: I gel possono essere conservati liofilizzati per un massimo di 1 anno.

4. Preparazione dello stock di soluzioni energetiche 14x

  1. Combinare tutti i componenti della reazione (Tabella 1) in una provetta da centrifuga da 15 mL su ghiaccio per produrre una soluzione energetica 14x.
  2. Aliquotare la soluzione energetica 14x in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a -80 °C (è possibile utilizzare aliquote di volume inferiore).
    NOTA: La soluzione energetica 14x può essere conservata per diversi mesi a -80 °C se si evita il congelamento ripetuto dei tubi.

5. Preparazione del brodo di aminoacidi 4x

  1. Scongelare, sul ghiaccio, tutti i 20 componenti aminoacidici di un kit RTS Amino Acid Sampler. Agitare gli amminoacidi per assicurarsi che siano completamente disciolti.
  2. In una provetta da centrifuga da 50 mL, unire tutti i 20 amminoacidi e aggiungere 12 mL di ddH2O. Vortex sterile fino a quando la soluzione diventa limpida, con solo una leggera foschia di colorazione bianca.
  3. Aliquotare i 4 amminoacidi in provette da microcentrifuga da 1,5 mL (aliquote da 500 μL).
  4. Congelare le aliquote di 4 soluzioni di amminoacidi in azoto liquido e portare le aliquote a una temperatura di conservazione a -80 °C.

6. Calibrazione del tampone senza cellule

NOTA: Il tampone CFPS utilizzato per le reazioni di idrogel è stato calibrato per concentrazioni ottimali di DTT, Mg-glutammato e K-glutammato seguendo il protocollo di Banks et al.34 modificato da Sun et al.35. Le composizioni delle reazioni di calibrazione sono state selezionate utilizzando il metodo di progettazione degli esperimenti (DOE), con sette livelli di fattori selezionati per K-glutammato (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutammato (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) e DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM). JMP Pro 15 è stato utilizzato per generare un progetto DOE personalizzato (Tabella 2) e condurre l'analisi per determinare le concentrazioni ottimali dei fattori.

  1. Recuperare l'estratto privo di cellule dalla conservazione a −80 °C e scongelare su ghiaccio.
  2. Scongelare i 4 amminoacidi, la soluzione energetica 14x, il 40% di PEG-8000, il DNA plasmidico, il K-glutammato 3 M, il glutammato Mg 100 mM e il DTT 100 mM sul ghiaccio.
  3. Creare una miscela master di calibrazione combinando 12,5 μL dei 4 amminoacidi, 3,57 μL della soluzione energetica 14x, 2,5 μL di PEG-8000 al 40%, 3 μg di DNA plasmidico e 10 μL di estratto privo di cellule (44,5 mg/mL) e ottenere fino a 35 μL per reazione con ddH2O.
  4. Distribuire i 35 μL di master mix nei pozzetti di una piastra nera per microtitolazione da 384 pozzetti.
  5. Seguendo il progetto DOE, aggiungere il volume appropriato di Mg-glutammato, K-glutammato e DTT a ciascuna reazione, insieme a ddH2O per rendere ogni reazione fino a 50 μL.
  6. Trasferire la piastra per microtitolazione a un lettore di piastre per il rilevamento e l'analisi della fluorescenza utilizzando le impostazioni del lettore di piastre descritte (per mCherry): eccitazione: 587 nm, emissione: 610 nm, larghezza di banda della lunghezza d'onda: 12 nm, ottica: superiore, temperatura: 37 °C, con letture della fluorescenza raccolte ogni 5 minuti per 4 ore di tempo di lettura totale. Incubare le piastre agitando a 60 giri/min.
  7. Caricare i risultati nel progetto JMP DOE e generare un profilo di previsione per determinare i livelli di concentrazione ottimali per K-glutammato, Mg-glutammato e DTT in base alle variabili di risposta desiderate; In questo caso, la fluorescenza massima e la velocità di reazione erano le variabili di risposta.
  8. Combinare i reagenti come mostrato nella Tabella 3 per creare il tampone CFPS 2X
  9. Aliquote e conservare a −80 °C

7. CFPS in idrogel liofilizzati reidratati (Metodo A)

NOTA: I plasmidi utilizzati nelle reazioni CFPS sono stati creati utilizzando componenti del toolkit modulare EcoFlex per E. coli36 e descritti in Whitfield et al.11 L'mCherry e l'eGFP erano sotto il controllo del promotore costitutivo JM23100. Questi componenti sono disponibili presso Addgene.

  1. Recuperare l'estratto privo di cellule dalla conservazione a -80 °C e scongelare su ghiaccio per circa 20 minuti.
  2. Raccogli il tampone CFPS 2x e il DNA plasmidico e scongela sul ghiaccio.
  3. Raccogliere gli idrogel liofilizzati e lasciarli raggiungere la temperatura ambiente per 15 minuti lasciando riposare i gel sul banco.
  4. Trasferire i gel in provette per microcentrifuga da 1,5 mL, tagliando i gel con un bisturi se necessario per farli entrare nei pozzetti.
  5. In una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL, combinare 10 μL di estratto privo di cellule con 25 μL di tampone CFPS 2x e 4 μg di DNA plasmidico; fino a un volume totale di 50 μL con ddH2O per creare la soluzione CFPS.
  6. Pipettare la soluzione di CFPS sugli idrogel liofilizzati.
  7. Lasciare in ammollo i gel nel sistema CFPS per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
  8. Trasferire i gel su una piastra nera per microtitolazione a 384 pozzetti utilizzando una spatola.
  9. Trasferire la piastra per microtitolazione su un lettore di piastre per il rilevamento e l'analisi della fluorescenza utilizzando le impostazioni del lettore di piastre descritte al punto 6.6. I risultati rappresentativi sono disponibili in studi precedenti31,33.

8. Sintesi proteica cellulo-free in idrogel distribuibili (Metodo B)

  1. Recuperare l'estratto privo di cellule dalla conservazione a -80 °C e scongelare su ghiaccio per circa 20 minuti.
  2. Raccogli il DNA plasmidico e scongelalo sul ghiaccio.
  3. In una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio, combinare 10 μL di estratto privo di cellule con 3 μg di DNA plasmidico e 25 μL di tampone CFPS 2x, per un volume totale di 37,5 μL.
  4. Misurare 3 g di agarosio e aggiungerli a 100 mL di tampone ddH2O per creare il 3% di agarosio.
  5. Microonde l'agarosio al 3% in 30 s esplode ad alta potenza.
  6. Pipettare 12,5 μL di agarosio fuso in provette per microcentrifuga da 1,5 mL contenenti miscela CFPS per un volume totale di 50 μL.
  7. Lasciare raffreddare l'agarosio fuso, ma non polimerizzare, lasciando l'agarosio in un blocco termico impostato a 50 °C.
  8. Combinare l'agarosio fuso con la soluzione CFPS; miscelare tramite pipettaggio e agitazione con la punta e assicurarsi di muoversi rapidamente per evitare la polimerizzazione del gel prima che la soluzione CFPS possa essere miscelata.
  9. Lasciare raffreddare i gel a temperatura ambiente e polimerizzare per circa 2 minuti.
  10. Trasferire l'agarosio polimerizzato in provette da microcentrifuga da 1,5 mL con una spatola e congelare in azoto liquido.
  11. Mettere gli idrogel surgelati in un luogo di conservazione a −80 °C per 1 ora.
  12. Recuperare i gel dallo stoccaggio; Rimuovere i coperchi delle provette della microcentrifuga, coprire le provette con una pellicola di cera e forare la pellicola per consentire l'asciugatura dell'umidità.
  13. Attivare il liofilizzatore con le seguenti impostazioni: temperatura: −20 °C, pressione: 0,1 mbar, liofilizzazione per 18 ore (notte).
  14. Conservare i dispositivi CFPS liofilizzati in un luogo di conservazione a −80 °C fino all'uso.
  15. I dispositivi CFPS liofilizzati, con un volume umido approssimativo di 50 μL, possono essere reidratati con 50 μL di ddH2O senza liquidi in eccesso. La reidratazione dura circa 30 minuti.
  16. Trasferire i gel su una piastra nera per microtitolazione a 384 pozzetti utilizzando una spatola.
  17. Trasferire la piastra per microtitolazione su un lettore di piastre per il rilevamento e l'analisi della fluorescenza utilizzando le impostazioni del lettore di piastre descritte al punto 6.6. I risultati rappresentativi sono disponibili in pubblicazioni precedenti31,33.

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Representative Results

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi per incorporare le reazioni CFPS in matrici di idrogel, con la Figura 1 che presenta una panoramica schematica dei due approcci. Entrambi i metodi sono suscettibili di liofilizzazione e conservazione a lungo termine. Il metodo A è il metodo più utilizzato per due motivi. In primo luogo, è stato dimostrato che è il metodo più applicabile per lavorare con una gamma di materiali idrogel11. In secondo luogo, il metodo A consente di testare in parallelo i costrutti genetici. Il metodo B è più appropriato per la fabbricazione di un sistema ottimizzato e per l'implementazione sul campo. Entrambi i protocolli consentono di preparare molti campioni in una volta sola per favorire la riproducibilità sperimentale. Questa caratteristica è utile anche per lo sviluppo a lungo termine della tecnologia, poiché i dispositivi liofilizzati possono essere spediti allo stato secco e ricostituiti in loco quando necessario.

L'approccio delineato nel protocollo e nella Figura 1 può essere utilizzato per l'espressione di costrutti di singoli geni o per la co-espressione di più geni. I dati presentati nella Figura 2 mostrano l'espressione sia di eGFP che di mCherry in un gel di agarosio allo 0,75%. La microscopia confocale è stata utilizzata per confermare che l'espressione proteica era omogenea in tutto l'idrogel, compresi i piani interni. In particolare, la sintesi proteica non era confinata ai bordi esterni dell'idrogel e la fluorescenza interna non era il risultato della diffusione delle proteine. A conferma di ciò, ponendo un idrogel che esprime eGFP a contatto fisico con un idrogel che esprime mCherry, è stato possibile vedere la diffusione della proteina da un idrogel all'altro. La velocità di diffusione tra i due era insufficiente a spiegare l'ampia localizzazione della fluorescenza rossa o verde all'interno del materiale. Questo esperimento illustra anche un vantaggio chiave dell'implementazione di dispositivi privi di cellule in idrogel: la funzionalità del dispositivo può essere organizzata spazialmente in un modo che non è possibile nelle reazioni liquide prive di cellule. Inoltre, per la creazione di reti geniche, è necessaria la sintesi simultanea di più di un singolo prodotto genico. I risultati mostrati nella Figura 2 (riga in basso) hanno confermato la co-espressione di mCherry ed eGFP nell'agarosio. In questo lavoro, entrambe le proteine sono state espresse e non c'era competizione spaziale tra le proteine. Ancora una volta, una sovrapposizione della gamma di lunghezze d'onda rossa e verde dimostra la distribuzione spaziale uniforme di entrambe le proteine all'interno dell'idrogel.

Tabella 1: Le scorte di soluzioni energetiche 14x. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Progettazione di un array sperimentale per l'ottimizzazione di DTT, Mg-glutammato e K-glutammato all'interno delle reazioni di sintesi proteica cell-free. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: I 2 componenti del buffer CFPS. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figure 1
Figura 1: Schema dei due protocolli. Nel primo metodo (Metodo A, illustrato in questo articolo) i materiali idrogel vengono prima preparati e poi liofilizzati (fase 1) senza componenti privi di cellule. Questi idrogel essiccati possono essere conservati e ricostituiti quando necessario (fase 2) con il volume corretto di reazione priva di cellule prima dell'incubazione per la produzione di proteine (fase 3) Il metodo variante, il metodo B, incorpora tutti o alcuni dei componenti di reazione privi di cellule nella fabbricazione iniziale dell'idrogel. Dopo la liofilizzazione (fase 1), gli idrogel possono essere ricostituiti in sola acqua o in tampone contenente un analita di interesse (fase 2). La produzione di proteine (fase 3) continua come prima. Un terzo metodo, in cui i componenti liofilizzati privi di cellule vengono ricostituiti con polimeri idrogelici, è descritto in Whitfield et al.11 , ma ha trovato impiego solo con un numero limitato di idrogel fino ad oggi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Sintesi proteica senza cellule di eGFP e mCherry in un idrogel utilizzando lisati cellulari di E. coli. I gel di agarosio (0,75%) sono stati preparati senza stampo di DNA (in alto) con 4 μg di eGFP o mCherry (al centro) o con 4 μg di eGFP e mCherry (in basso). Gli idrogel sono stati incubati per 4 ore prima della microscopia confocale nei canali rosso e verde. Viene inoltre mostrata una sovrapposizione dei due canali e la sovrapposizione include l'immagine del contrasto di interferenza differenziale (DIC). Gli idrogel contenenti eGFP o mCherry sono stati preparati separatamente ma incubati a contatto fisico tra loro. Il diametro del gel è di 6 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Di seguito sono delineati due protocolli per l'incorporazione di reazioni CFPS a base di lisato di cellule di E. coli in idrogel di agarosio. Questi metodi consentono l'espressione genica simultanea in tutto il materiale. Il protocollo può essere adattato ad altri sistemi CFPS ed è stato condotto con successo con i kit CFPS disponibili in commercio, oltre ai lisati cellulari preparati in laboratorio descritti qui. È importante sottolineare che il protocollo consente l'espressione genica in assenza di una fase liquida esterna. Ciò significa che il sistema è autonomo e non richiede un bagno di reazione privo di cellule. A differenza dei metodi precedenti in cui le reazioni CFPS avvenivano all'interno di idrogel, con questo metodo viene eliminato il requisito di tamponi esterni e recipienti di reazione. Si prevede che questi metodi consentiranno ai ricercatori di esplorare l'uso di materiali idrogel come chassis per dispositivi di biologia sintetica privi di cellule, fornendo in ultima analisi un percorso per spostare tali dispositivi fuori dal laboratorio.

Fondamentale per il successo di entrambi gli approcci è l'uso di lisati cellulari di alta qualità. Un lisato cellulare di alta qualità deve avere un'alta concentrazione proteica (>40 mg/mL), deve essere mantenuto freddo per tutta la durata della preparazione e non deve essere stato sottoposto a ripetuti cicli di gelo-disgelo. Inoltre, è fondamentale che i modelli di DNA siano di elevata purezza. Per raggiungere questo obiettivo, i plasmidi devono essere estratti dalle cellule utilizzando un kit di preparazione di plasmidi ad alta purezza e ad alto rendimento affinché le reazioni trascrizionali procedano all'interno dell'ambiente CFPS. Queste fasi critiche sono comuni a tutte le applicazioni CFPS e non sono esclusive di questo metodo. Ciononostante, è la preparazione dei componenti del CFPS che ha il maggiore impatto sull'efficacia dei protocolli. Per quanto riguarda i materiali, è necessario ottenere una liofilizzazione efficace e rapida degli idrogel. Se il liofilizzatore non raggiunge una temperatura sufficientemente fredda (inferiore a -45 °C), il gel verrà essiccato anziché liofilizzato, il che può compromettere la struttura interna della matrice di idrogel e può causare il degrado dei sistemi CFPS incorporati. Anche il metodo B ha una preoccupazione unica; in particolare, quando si aggiunge la miscela CFPS all'agarosio fuso per formare il gel, l'agarosio fuso deve essere lasciato raffreddare a sufficienza prima di aggiungere la miscela CFPS per evitare la degradazione termica delle reazioni CFPS. Tuttavia, lasciare raffreddare troppo l'agarosio comporterà la polimerizzazione del gel e impedirà l'aggiunta del sistema CFPS. Infine, gli idrogel possiedono un certo grado di autofluorescenza, che può entrare in conflitto con i segnali di fluorescenza generati durante le reazioni CFPS. È importante, quindi, includere appropriati controlli negativi e reporter genetici che non abbiano le stesse caratteristiche di fluorescenza del materiale.

I protocolli qui dimostrati sono incentrati sull'uso dell'agarosio come idrogel modello. L'agarosio è un eccellente sistema modello per questo lavoro in quanto è ampiamente disponibile, poco costoso e dimostra eccellenti capacità di produzione di proteine. Precedenti indagini hanno anche dimostrato che l'agarosio può essere un sostituto dell'agente di affollamento PEG nelle reazioni CFPS, indicando che le interazioni tra il telaio polimerico e le reazioni CFPS possono migliorare la produzione di proteine11. Questi metodi, tuttavia, sono anche suscettibili di modifiche utilizzando un'ampia gamma di matrici alternative di idrogel con proprietà fisiche e chimiche variabili. Il metodo è stato applicato alla gomma di xantano, all'alginato, alla gomma di gellano acilico, al poliacrilammide, agli idrogel di acido ialuronico e ai gel di polossamero F-108 e F-1279. In alcuni scenari, si osserva una ridotta produzione di proteine rispetto ai controlli liquidi o ad altri idrogel. Ciononostante, in questi scenari, può essere raggiunto un compromesso, in cui la funzionalità del materiale stesso (ad esempio, le sue proprietà adesive o la biocompatibilità) è di beneficio significativo in modo tale che una riduzione della produzione di proteine possa essere accettata. Possono anche essere apportate modifiche alle concentrazioni degli idrogel. Per l'agarosio, i metodi sono suscettibili di concentrazioni di polimero nell'intervallo 0,5%-1,5% p/v, ad esempio. Una maggiore concentrazione di gel si traduce in genere, in senso materiale, in un dispositivo più robusto che è più resistente alla manipolazione e preserva meglio la reazione CFPS all'interno. Il compromesso con l'aumento della concentrazione di gel, tuttavia, è che la reazione può avere un tasso di produzione ridotto o una resa proteicaridotta 11,37. La relazione tra la concentrazione del polimero e la produzione di proteine, tuttavia, non è lineare e varia a seconda dell'idrogel utilizzato11. Pertanto, per qualsiasi nuovo polimero idrogel, è necessario un certo grado di sperimentazione per bilanciare la funzionalità del materiale con la funzionalità priva di cellule.

L'inclusione di reazioni CFPS in materiali idrogel senza la necessità di tamponi esterni rappresenta un percorso interessante per l'implementazione di dispositivi privi di cellule. I dispositivi privi di cellule hanno il vantaggio di eliminare la necessità di rilascio di organismi geneticamente modificati al di fuori di un ambiente di laboratorio controllato. Inoltre, l'inclusione delle reazioni negli idrogel elimina la necessità di recipienti di reazione (tipicamente articoli in plastica) dopo la ricostituzione. Dato che molti idrogel sono biodegradabili, questo offre un potenziale percorso per ridurre i rifiuti di plastica. Allo stesso modo, il protocollo qui dettagliato dimostra anche che sia l'idrogel che il CFPS sono suscettibili di liofilizzazione. Mentre i cicli ripetuti di liofilizzazione non sono raccomandati e probabilmente danneggeranno la funzione CFPS e idrogel, per i dispositivi monouso. La capacità di liofilizzare e ricostituire i componenti riduce il peso del dispositivo ed elimina la necessità di una catena del freddo durante il trasporto. Queste proprietà semplificano la logistica e riducono i costi di trasporto dei dispositivi. Inoltre, gli idrogel hanno molte proprietà funzionali utili proprie; Ad esempio, possono fungere da paste, lubrificanti e adesivi. Gli idrogel possono anche essere biocompatibili, biodegradabili e possedere stimoli-risposte a pieno titolo. Nel complesso, è possibile ottenere una sinergia tra la funzionalità biologica e la scienza dei materiali per creare una nuova classe di materiali bioprogrammabili.

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Disclosures

Nessuno.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono il sostegno dei premi BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), e del premio EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). I dati a supporto di questa pubblicazione sono disponibili all'indirizzo: 10.25405/data.ncl.22232452. Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
3-PGA Santa Cruz Biotechnology sc-214793B
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Agar Thermo Fisher Scientific A10752.22
Agarose Severn Biotech 30-15-50
Amino Acid Sampler Kit VWR BTRABR1401801
ATP Sigma-Aldrich A8937-1G
cAMP Sigma-Aldrich A9501-1G
Coenzyme A (CoA) Sigma-Aldrich C4282-100MG
CTP Alfa Aesar J14121.MC
DTT Thermo Fisher Scientific R0862
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
GTP Carbosynth NG01208
HEPES Sigma-Aldrich H4034-25G
K-glutamate Sigma-Aldrich G1149-100G
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
Mg-glutamate Sigma-Aldrich 49605-250G
NAD Sigma-Aldrich N6522-250MG
PEG-8000 Promega V3011
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit Thermo Fisher Scientific A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli Sigma-Aldrich 71397-3
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888-500G
Spermidine Sigma-Aldrich 85558-1G
Tryptone Thermo Fisher Scientific 211705
Tris Sigma-Aldrich GE17-1321-01
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
UTP Alfa Aesar J23160.MC
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes Thermo Fisher Scientific 66381
15 mL centrifuge tube Sarstedt 62.554.502
50 mL centrifuge bottles Sarstedt 62.547.254
500 mL centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific 3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer Christ part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge Thermo Fisher Scientific H-X3R
Black 384 well microtitre plates Fischer Scientific 66
Cuvettes Thermo Fisher Scientific 222S
Elga Purelab Chorus Elga #####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R Eppendorf EP00532
High Speed Centrifuge Beckman Coulter B34183
JMP license SAS Institute 15
Magnetic Stirrer Fischer Scientific 15353518
Parafilm Amcor PM-966
Photospectrometer (Biophotometer) Eppendorf 16713
Pipettes and tips Gilson #####
Precision Balance Sartorius 16384738
Qubit 2.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32866
Shaking Incubator Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator) Thermo Fisher Scientific 12893543
Static Incubator Sanyo MIR-162
Syringe and needles Thermo Fisher Scientific 66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) Thermo Fisher Scientific SHKE8000
Varioskan Lux platereader Thermo Fisher Scientific VLBL00GD1
Vortex Genie 2 Cole-parmer OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter VWR 662-1657

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Biologia Numero 196 Sintesi proteica cell-free CFPS biologia sintetica reti geniche sintetiche idrogel biosensori espressione genica espressione proteica
Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala
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Kavil, S., Laverick, A., Whitfield, C. J., Banks, A. M., Howard, T. P. Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels. J. Vis. Exp. (196), e65500, doi:10.3791/65500 (2023).

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