Summary
ここでは、ラットモデルに迅速、簡単、信頼性の高い採血の代替手段を提供するためのプロトコルを紹介します。状況に応じて、麻酔下または意識のある動物に対する尾静脈穿刺と、麻酔下での背側陰茎静脈穿刺の3つの異なる採血方法について説明します。
Abstract
血液サンプルは、さまざまな血液学的パラメータを評価するために、ほとんどの実験動物設計で必要とされます。この論文では、ラットの採血のための2つの手順、外側尾静脈穿刺と背側陰茎静脈穿刺を提示し、これらは他の前述の技術よりも大きな利点を提供します。この研究は、これら2つの手順により、高速サンプリング(10分未満)が可能になり、ほとんどのアッセイ(202 μL±67.7 μL)に十分な血液量が得られることを示しています。背側陰茎静脈穿刺は麻酔下で行う必要がありますが、外側尾静脈穿刺は意識のある拘束された動物に対して行うことができます。
したがって、これら2つの技術を交互に使用すると、どのような状況でも採血が可能になります。動物福祉を確保するために、処置中にオペレーターを支援することが常に推奨されますが、これらの手法では、2人を必要とするほとんどの採血方法とは異なり、オペレーターは1人しか必要としません。さらに、これらの前述の方法(例えば、頸静脈スティック、鎖骨下静脈採血)は、動物への危害または死を避けるために広範な事前訓練を必要とするが、尾静脈および背側陰茎静脈穿刺はめったに致命的ではない。これらすべての理由から、そして文脈に応じて(例えば、雄ラットを含む研究の場合、周術期または術直後の期間中、細い尾静脈を有する動物の場合)、両方の技術を交互に使用して、繰り返し採血を可能にすることができる。
Introduction
採血は、 インビボ と インビトロの両方で、ほとんどの動物実験に必要です。ラットでは、採血の頻度と量が重要である可能性があるため、収集のためのさまざまな選択肢があると便利です。これまでの研究では様々な方法が記載されている。
最も一般的に使用される技術は、尾静脈穿刺と伏在静脈採血です。尾静脈サンプリングは、すべてのラット系統に適しています。適切な訓練を受ければ、この手順は簡単に実行でき、動物への苦痛は最小限に抑えられます1。同様に、伏在静脈採血は、適切に行われていれば、迅速で簡単な収集方法でもあります。どちらの方法も麻酔を必要とせず、どちらも少量の血液を繰り返し採取することができます。ただし、伏在静脈穿刺は通常、血液量1が低く、穿刺2のために1 つの後肢を露出したままにするために2人の存在が必要です。
1匹の動物から大量の血液を採取する必要がある場合は、心臓穿刺または大静脈穿刺を使用できます(心臓穿刺2で150 gのラットから最大10 mLの血液を採取できます)。これらの技術は麻酔を必要とし、最終的な手順です。動物は、これら2つの技術のいずれかの後に安楽死させなければなりません2.頸静脈スティックは、まだその終点に達していない研究で大量の血液を採取する必要がある場合に使用できる代替手段です。ただし、この手法では、動物への害を避けるために重要な技術的スキルも必要です。したがって、その使用は制限されるべきです3.
鎖骨下静脈採血などの他の技術は、採血前に麻酔薬を使用する必要がなく、少量の血液を繰り返しサンプリングすることができます。ただし、この技術には、拘束された取り扱いと適切な針切開が必要です。不適切な手術は動物の痛みや死亡率さえも引き起こす可能性があり、この方法のトレーニングは潔癖である可能性があります4。
他の事例手順には、眼窩穿刺と舌下静脈穿刺が含まれますが、どちらも麻酔薬が必要であり、推奨も広く使用もされていません。以前の研究では、尾静脈穿刺よりも眼窩穿刺の方が採血が速いことが示されていますが、ジエチルエーテル麻酔下での眼窩穿刺は後者の方法よりも忍容性が低いことがわかりました(動物の興奮スコアと尿産生に基づく)5。さらに、この方法は、手順を実行する人のスキルに大きく影響され、主に経験豊富な獣医師によって実行されます。同様に、舌下静脈穿刺は苦痛が少なく、繰り返し採血することをお勧めします6。しかし、この手法は、食物や水分の摂取量の減少などの深刻な悪影響を示し、動物の死につながる可能性があります7。
本研究では,当研究室で採血を繰り返すために用いられている2つの方法について述べる。尾静脈穿刺は意識のある動物に対して行うことができ、組織の損傷や悪影響は最小限です。この研究におけるこの技術の修正には、人差し指と中指で尾を安定させることが含まれ、これにより1人のオペレーターが採血を行うことができます。背側陰茎静脈穿刺は、単純な静脈内注射についてすでに説明されています。この技術は麻酔下で行われ、他の方法(例えば、術直後、小動物、麻酔下で周術期採血を行う場合)に信頼できる血液源を可能にする。尾静脈サンプリングと同様に、穿刺部位での損傷は、上記の技術と比較して動物に軽微な全体的な影響を及ぼします8。この方法の論文の目的は、経験の浅い研究者に、状況に応じてシンプルで信頼性の高い採血の選択肢を提供することです(たとえば、麻酔下で行われる手順、雄ラットを含む研究、細い尾静脈を持つ動物)。
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Protocol
この手順は、それぞれ体重が300〜400gの3ヶ月齢の雄のルイスラットで実施された。12匹が麻酔なしの尾静脈穿刺(麻酔なしのグループTV)と、さらに12匹が麻酔をかけ、尾静脈穿刺(麻酔付きグループTV)と陰茎静脈穿刺(麻酔付きグループPV)の両方を麻酔した合計24匹が含まれていました。すべての手順は承認され、施設動物管理使用委員会(IACUC)のガイドラインを尊重しました。すべての動物は、研究の終了時(1か月の追跡調査後)に二酸化炭素の過剰摂取によって安楽死させた。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 一般的なガイドライン
- IACUCガイドラインに沿って、採取される最大血液量が10週間ごとに総血液量の2%以下であることを確認してください9。たとえば、300 gのラットの総血液量は約19.2 mLである必要があります。最初の週だけで4回の採血が必要なプロトコルの場合(0日目、1日目、3日目、7日目)、収集をサンプルあたり最大250μLの血液に制限します。
- 麻酔下で行われる処置のために、動物を麻酔するために精密気化器 を介して イソフルランを投与する。3%〜5%イソフルランの用量のチャンバー内で5分間麻酔を誘発し、処置中にノーズコーンを通して1%〜3%のイソフルランの用量を使用して維持する。呼吸数の継続的なモニタリングに基づいてイソフルランレベルを調整します。手順を開始する前に、つま先をつまんで鎮静が十分かどうかを確認してください。
- 処置中、または胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
- 採血後、ケージに戻す前に完全に回復するまで動物を監視し、完全に回復するまで他の動物の会社に紹介しないでください。
注:獣医サービスに同意して、尾静脈または陰茎静脈穿刺後に処置後の鎮痛剤は必要ありませんでした。
2.陰茎静脈から採血する
- 準備
- 次の機器を準備します:滅菌ガーゼ、手袋、アルコールワイプ、マイクロキャピラリー採血EDTAチューブ(紫色のキャップ)、および30 Gインスリン注射器(30 Uまたは50 U)。
- ラットをケージから取り出し、精密気化器(用量:3%〜5%) を介して イソフルランによる誘導のためにチャンバーに入れます。動物が鎮静されたら、それを処置表に移し、麻酔を維持するために鼻を鼻円錐形に置いた状態で動物を仰向けに寝かせます。呼吸数を監視し、それに応じてイソフルランレベルを調整します(維持用量:1%-3%)。.手順を開始する前に、動物がつま先をつまんで十分に鎮静されていることを確認してください。
- 採血
- シリンジ内でプランジャーを数回前後に動かして、引き出しをスムーズにします。プランジャーを引っ張って数マイクロリットルを取り除くことにより、シリンジ内に負圧を作り出します。
- 利き手ではない手の助けを借りて、陰茎の端から包皮を引っ込め、人差し指と親指の間に亀頭を持ち、そっと引っ張ります。背側陰茎静脈は表面的な青い紐として表示されます。図 1 および 図 2 を参照してください。
- 針の目を上に向けて、インスリン注射器を35°の角度で静脈に挿入します。針が静脈に入ると、血液が注射器に流れ込みます。
- シリンジのプランジャーをゆっくりと安定した速度でゆっくりと引き出して、目的の容量を収集します。
注意: プランジャーを速く引き抜くと、静脈が崩壊して血流が止まるため、引き出さないでください。 - 血流が減少した場合は、針を時計回りまたは反時計回りに少し回転させます。
- シリンジを取り外します。穿刺部位に血液滴が形成され、その吸引により、非滅菌処置の場合にさらに数マイクロリットルの血液を採取することができます。
- 最初の穿刺が失敗した場合は、針を静脈のより近位に再挿入します。
注:尾静脈サンプリングとは異なり、背側陰茎静脈の反復穿刺は通常失敗します。 - 穿刺部位に軽い圧力を加えて出血を止め、新しいアルコールワイプでその領域を拭きます。
- 陰茎をニュートラル位置に戻します。
- イソフルランをオフにし、完全に回復するまでラットを監視します。.ラットをケージに戻します。
3.尾静脈穿刺
- 準備
- 次の機器を準備します:プラスチック製の拘束ホルダー、滅菌ガーゼ、手袋、アルコールワイプ、マイクロキャピラリー採血EDTAチューブ(紫色のキャップ)、および28 G 1/2インスリンシリンジ(30 Uまたは50 U)。
- ラットをケージから取り出し、プラスチック製の拘束コーンにすばやく固定します。尾の付け根の周りの円錐の大きな端を閉じます。動物が快適であり、手順全体を通して呼吸が制限されていないことを確認してください。
- 尾を温水(37°C)に約1分間浸して静脈を拡張します。ペーパータオルで尾を乾かします。尾を加熱パッドの上に横たえた状態で、動物を(拘束具に)伏せて置きます。
- 動物全体を両側に回転させてサンプリングする右または左の尾静脈(青い線)を選択します(これにより、尾のねじれが回避されます)。このゾーンでは血管がより表面的になるため、血管の穿刺には尾の末端3番目を使用します。動脈は腹側にあり、2本の静脈は外側10です。
- 穿刺部位で70%エタノールワイプで尾を拭きます。
- テールを加熱パッドの端に置き、テールのターミナル3分の1に角度を付けます。これにより、静脈が表面にもたらされ、サンプルを採取するためのスペースが増えます。
- 採血
- シリンジ内でプランジャーを数回前後に動かして、引き出しをスムーズにします。プランジャーを引っ張って数マイクロリットルを取り除くことにより、シリンジ内に負圧を作り出します。
- 非支配的な人差し指と中指の助けを借りて、加熱パッドに尾を平らに固定します。中指を近位に、人差し指を遠位に置き、これら2本の指の間に穿刺部位を置きます。人差し指よりも中指にもっと圧力を加えて尾を固定し、血管を近位にのみ塞ぎ、血液を溜めます。図 1 および 図 3 を参照してください。
- 針の目を上に向けて、インスリン注射器を人差し指に対して静脈に挿入されるまでスライドさせます(これにより、針と尾の間に35°の角度が作成されます)。針が静脈に入ると、血液が注射器に流れ込みます。この時点で、人差し指と中指の圧力を解放して、血流が塞がれないようにします。
- シリンジのプランジャーを安定した速度でゆっくりと引き出して、目的の容量を収集します。
注意: プランジャーを速く引き出さないでください。これにより、静脈が崩壊し、血流が停止します。 - 血流が減少した場合は、針をいずれかの方向にわずかに回転させます。
- シリンジを尾から取り外します。尾の穿刺部位に血滴が形成されます。この血液の吸引は、非滅菌処置の場合にはさらに数マイクロリットルの血液の採取を可能にする。
- 最初の穿刺が失敗した場合は、針を静脈のより近位に再挿入します。
注:静脈は尾の付け根に近づくにつれて次第に深くなります。シリンジ内に血流がない場合は、シリンジとテールの間の角度を大きくするか、針を回転させます。 - 穿刺部位に圧力を加えて出血を止め、新しいアルコールワイプでその領域を拭きます。ラットをプラスチックコーンから取り出し、ケージに戻します。
- 麻酔下での尾静脈穿刺
- 麻酔を誘発および維持するためのステップ2.1.1およびステップ2.1.2を実行します。
- 採血のためにステップ3.1.3-3.2.7を実行します。 図1を参照してください。
- 動物の回復のためにステップ2.2.10を実行します。
図1:このプロトコルのさまざまな穿刺方法の概略図 。 (A)意識のある拘束された動物に対する尾静脈の修正穿刺。(B)麻酔下での修正尾静脈穿刺および陰茎静脈穿刺。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
成功は、10分未満(穿刺時間から採血終了まで)に少なくとも100μLの採血を生じる採血として定義され、失敗は、100μL未満の血液を生成するか、必要な血液量を回収するのに10分以上かかる採血として定義されました。サンプルあたり最大250μLの血液が許可されました。統計分析は、多重比較のための一元配置分散分析とカイ二乗検定を使用して実施されました。データは平均値±標準偏差として提示され、 p < 0.05が統計的有意性を決定するためのカットオフとして使用されました。
成功率を比較すると、図4に示すように、意識のあるラットの尾静脈穿刺(92%)と麻酔下での陰茎静脈穿刺(83%)(p = 0.0543)で同様の結果を示しました。興味深いことに、麻酔下では尾静脈は非常に信頼性が低くなり、麻酔下での尾静脈穿刺は、おそらく静脈の菲薄化のために、この研究では25%の成功率しかありませんでした。麻酔の場合、陰茎静脈穿刺は尾静脈穿刺よりもサンプリングに成功した(p < 0.0001)。
麻酔下でラットに行った尾静脈・背側陰茎静脈穿刺と意識のあるラットに行った尾静脈穿刺の採血量と処置期間を比較した。図5は、麻酔なしの尾静脈穿刺(217.5 μL ± 69.04 μL)と麻酔下(185.8 μL±66.4 μL)の血液量が同等(p = 0.4966)であり、これらの血液量は麻酔下で尾静脈穿刺で採取した量(54.4 μL±68.8 μL)よりも有意に多かった(p < 0.0001)。
処置期間は、麻酔群での陰茎静脈穿刺(315.2秒±160秒)と麻酔群なしの尾静脈穿刺群(262.5秒±171秒)で類似していた(p = 0.6632)。 図 6は、両群とも6分未満でサンプリングが行われたのに対し、麻酔下での尾静脈穿刺は多発不全により8分以上(500.8秒±196秒)を要した(p < 0.0382)。
図2:背側陰茎静脈穿刺法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:尾静脈穿刺法の修正。 尾が押さえられ、穿刺部位が人差し指と中指の間にあることに注意してください。シリンジは、安定した穿刺角度を維持するために、人差し指に対して静止してスライドする必要があります。利き手ではない手を使用すると、意識のある動物の尾を安定させることができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:麻酔下での尾静脈穿刺、麻酔下での陰茎静脈穿刺、および麻酔なしの尾静脈穿刺の成功率 。 カイ二乗検定で0.0001< p 。略語:TV =尾静脈;PV =陰茎静脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:3つのグループで得られた血液量(μL)の比較。 ***p < 0.001;p < 0.0001 多重比較のためのANOVA分析で。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:3つのグループにおける、穿刺の瞬間から採血の終わりまでの時間として定義されるサンプリング時間(秒単位)の比較。 失敗は、600秒(10分)より長く続く採血期間として定義されました。*p < 0.05;**p < 0.01 多重比較のための分散分析あり。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
尾静脈穿刺は、意識のあるラットから血液を得るための効率的な方法です。しかし、動物が麻酔下にある場合、イソフルランの効果は血管のけいれんを引き起こし、尾静脈穿刺を不適切にする可能性があります11。この研究に示されているように、この状況での代替案は、陰茎静脈から血液を収集することであり、これはより成功し、より短い時間で大幅に大量の血液を生成します。最初の試行でこの方法が失敗した場合、後続の試行が失敗する可能性があることを覚えておくことが重要です。対照的に、尾静脈穿刺は、最初の試行で困難な場合にいくつかの後続の穿刺を可能にします(2つの静脈があり、尾の高いところに穿刺を試みることができます)1。しかしながら、反復穿刺はサンプル中で溶血を引き起こす可能性があり、それはヘモグロビンおよび赤血球膜の内部成分の放出のために結果を歪める。これは、プラズマを分析する場合に特に当てはまります12。複数の穿刺を避け、1回の採血でサンプルを取得することが望ましいです。
この作業では、このプロトコルと、複数回サンプリングの場合に動物福祉を尊重するためのIACUCガイドラインに従って、サンプリングはサンプルあたり250μLを超えませんでした。バイオ分析技術の進歩により、血液生化学および代謝パラメータを評価するために50μL未満のマイクロサンプルを使用できるようになりました 13。したがって、両方の方法が将来の研究に効率的であると結論付けるには、250 μLで十分です。しかし、尾静脈と陰茎静脈はどちらも小さな血管であり、大量の血液を採取することはできません。これらの記載された方法は、反復サンプリングおよび生きている動物のモニタリングに適している。大量の血液が必要な場合(たとえば、研究終了手順の場合)、心臓穿刺など、より多くの血液を生成する他の方法を検討する必要があります。
これらの説明されている手順は、多くの手順のうちの2つです。私たちの手順の選択は、いくつかの利点によって動機付けられました。これらの手法はどちらも、1 人のオペレーターで実行できます。人差し指と中指を使用して尾静脈を安定させる 修正された尾静脈法では、補完的な人間の拘束が不要になります。ただし、動物の福祉を評価する必要があり、動物を不必要な痛みや苦痛にさらさないように、専門家(獣医師や獣医技術者など)による支援が常に推奨されます2。
さらに、前述の方法(例えば、頸静脈スティック、鎖骨下静脈採血)は、動物への危害または死を避けるために広範な事前訓練を必要とする。対照的に、尾静脈または背側陰茎静脈の穿刺は、たとえうまく実行されていなくても、ラットにとって致命的になることはめったにありません。この研究では両方の方法でいくつかの失敗がありましたが、他の有害作用や死亡は観察されませんでした。背側陰茎注射後の尿閉のいくつかの症例が報告されているが、注射自体または注射された薬剤がこの結果の原因であるかどうかは不明である。この副作用も、穿刺部位での異常な治癒または感染も、研究期間中に認められませんでした。さらに、動物の状態の毎日の評価では、どのグループでも痛みや苦痛は明らかになりませんでした(ポルフィリン染色なし、体重減少なし、研究チームと獣医専門家によって快適であると判断された動物)。ただし、長時間の拘束や複数の穿刺は動物の苦痛を引き起こす可能性があります。これを回避するには、穿刺を繰り返すのではなく、血流が遅くなったときに針を回転させる必要があります。拘束時間を短縮するには、お湯と加熱パッドで尾静脈を適切に温めて尾静脈を血管拡張し、これらの方法を実践することをお勧めします。
尾静脈穿刺法および背側陰茎静脈穿刺法は、高速サンプリング(6分未満)を可能にし、ほとんどのアッセイに十分な血液量をもたらします。意識のある動物に対して行う場合、尾静脈穿刺は血液を得るための効率的で信頼性の高い方法です。しかし、鎮静された動物では、麻酔薬は血管のけいれんを引き起こす傾向があり、尾静脈は重要な間伐を受けます11。このシナリオでは、陰茎背静脈穿刺は、採血の信頼性が低い傾向がある尾静脈穿刺よりも成功率が高いです。ただし、陰茎静脈採血の1つの制限は、雄ラットでのみ実行できるため、雌ラットの研究には適さないことです。したがって、状況(すなわち、動物の性別、周術期または術後の採血、細い尾静脈を有する動物)に応じて、陰茎静脈穿刺と尾静脈穿刺の両方を交互に使用して、動物実験の経験がほとんどまたはまったくない研究者でも、繰り返し採血することができます。
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Disclosures
どの著者も、宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、シュラインズチルドレンズボストン(B. E. U.、K.U.、C.L.C.)によって資金提供されました。L.C.は、「La Bourse des Gueules Cassées」、「La Bourse Année Recherche」、「La Bourse de l'Amicale des Anciens, Internes des Hôpitaux de Paris」によって資金提供されています。Y.B.は「ラ・ブルス・デ・グール・カッセ」から資金提供を受けています。Y.B.とI.F.v.R.は、シュラインズ・ホスピタルズ・フォー・チルドレン(フェローシップIDはそれぞれ#84308-BOS-22、#84302-BOS-21)から資金提供を受けています。この資料は、助成金番号の下で国立科学財団が支援する作業に部分的に基づいています。EEC 1941543。米国国立衛生研究所(R01EB028782、R56AI171958、およびR01DK114506)からの部分的な支援に感謝しています。図 1 は BioRender.com を使用して作成しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL | 28 G ½ Insulin Syringes | BD | 329424 | for tail vein puncture |
| 0.5 mL | 30 G x 5/16 Insulin Syringes | BD | 320468 | for penile vein puncture |
| 250 L Microtainer blood collection tubes with K2EDTA | BD | 365974 | |
| Gauze Sponges | Curity | 6939 | |
| Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine | E-Z Systems | EZ-190F | for penile vein puncture |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 1403-704-06 | for penile vein puncture |
| Nosecone for Anesthesia | World Precision Instruments | EZ-112 | for penile vein puncture |
| Rodent Restraint Cone | Harvard Apparatus | ST2 52-95-86 | for tail vein puncture |
| Small Animal Heated Operating Table (Adjustable) | Peco Services Ltd | 69023 | |
| Webcol Alcohol prep pads | Simply Medical | 5110 |
References
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