Summary
Présenté ici est une méthode d’enrichissement et d’analyse des composants volatils des extraits de thé en utilisant l’évaporation de saveur assistée par solvant et l’extraction par solvant suivie d’une chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse, qui peut être appliquée à tous les types d’échantillons de thé.
Abstract
L’arôme du thé est un facteur important dans la qualité du thé, mais il est difficile à analyser en raison de la complexité, de la faible concentration, de la diversité et de la labilité des composants volatils de l’extrait de thé. Cette étude présente une méthode d’obtention et d’analyse des composants volatils de l’extrait de thé avec préservation des odeurs par évaporation d’arômes assistée par solvant (SAFE) et extraction par solvant suivie d’une chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS). SAFE est une technique de distillation sous vide poussé qui permet d’isoler des composés volatils à partir de matrices alimentaires complexes sans aucune interférence non volatile. Une procédure complète étape par étape pour l’analyse des arômes de thé est présentée dans cet article, y compris la préparation de l’infusion de thé, l’extraction par solvant, la distillation SAFE, la concentration de l’extrait et l’analyse par GC-MS. Cette procédure a été appliquée à deux échantillons de thé (thé vert et thé noir), et des résultats qualitatifs et quantitatifs sur la composition volatile des échantillons de thé ont été obtenus. Cette méthode peut non seulement être utilisée pour l’analyse aromatique de divers types d’échantillons de thé, mais également pour des études sensorielles moléculaires sur ceux-ci.
Introduction
Le thé est une boisson préférée de nombreuses personnes dans le mondeentier 1,2. L’arôme du thé est un critère de qualité ainsi qu’un facteur déterminant le prix des feuilles de thé 3,4. Ainsi, l’analyse de la composition aromatique et de la teneur du thé est d’une grande importance pour les études sensorielles moléculaires et le contrôle de la qualité du thé. En conséquence, l’analyse de la composition aromatique a été un sujet important dans la recherche sur le thé ces dernières années 5,6,7.
La teneur en composants aromatiques du thé est très faible, car ils ne représentent généralement que 0,01% à 0,05% du poids sec des feuilles de thé8. De plus, la grande quantité de composants non volatils dans la matrice d’échantillon interfère de manière significative avec l’analyse par chromatographie en phase gazeuse 9,10. Par conséquent, une procédure de préparation d’échantillon est essentielle pour isoler les composés volatils dans le thé. La principale considération pour la méthode d’isolement et d’enrichissement est de minimiser l’interférence de la matrice et, en même temps, de maximiser la préservation du profil olfactif original de l’échantillon.
L’évaporation d’arômes assistée par solvant (SAFE), développée à l’origine par Engel, Bahr et Schieberle, est une technique améliorée de distillation sous vide poussé utilisée pour isoler les composés volatils des matrices alimentaires complexes11,12. Un ensemble de verre compact connecté à une pompe à vide poussé (sous une pression de fonctionnement typique de 5 x 10−3 Pa) peut collecter efficacement les composés volatils des extraits de solvants, des aliments huileux et des échantillons aqueux.
Cet article décrit une méthode qui combine la technique SAFE avec l’extraction par solvant pour isoler les substances volatiles d’une infusion de thé noir, suivie d’une analyse à l’aide de la GC-MS.
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Protocol
1. Préparation de l’étalon interne et infusion de thé
- Solution mère : Dissoudre 10,0 mg de paraxylène-d10 (voir le tableau des matières) dans 10,0 mL d’éthanol anhydre pour préparer une solution mère de 1 000 ppm de l’étalon interne.
- Solution de travail : Diluer 1 mL de la solution mère (étape 1.1) à 100 mL avec de l’eau pure pour préparer une solution de travail de 10 ppm de l’étalon interne.
NOTE: La solution de travail doit être préparée le même jour que l’analyse. - Placer 3 g de feuilles de thé (pour le thé vert et le thé noir, voir le tableau des matières) dans une fiole d’erlenmeyer et ajouter 150 ml d’eau bouillante. Couvrir la fiole d’un bouchon en verre.
- Après 5 min, filtrer rapidement l’infusion de thé à travers un tamis à 300 mailles.
- Lavez les feuilles de thé épuisées deux fois avec 30 ml d’eau et combinez la solution de lavage avec l’infusion de thé.
- Refroidir rapidement l’infusion de thé à température ambiante dans un bain d’eau glacée.
- Ajouter 1,00 mL de solution de travail (étape 1.2) dans l’infusion de thé et bien mélanger.
2. Distillation de l’infusion de thé par SAFE et extraction liquide-liquide du distillat
- Préparez l’assemblage SAFE en suivant les étapes ci-dessous.
- Installez l’ensemble SAFE (Figure 1) et connectez la bouteille de distillation en bas à gauche (Figure 1[3]) et la bouteille de collecte en bas à droite (Figure 1[4]). Connectez le tube d’eau circulant à l’arrière de l’ensemble de verre SAFE. Installez le piège à froid (Figure 1[5]) et connectez le tube à la pompe à vide (voir Tableau des matériaux) en haut à droite de l’ensemble en verre.
REMARQUE: Vérifiez le raccordement du tube d’eau en circulation; Assurez-vous que l’entrée pénètre dans le haut et que la sortie sort par le bas. Utiliser de l’eau désionisée pour la circulation afin d’empêcher le tartre de bloquer le tube blanc dans l’assemblage SAFE, ce qui entraînerait une mauvaise circulation de l’eau en circulation et l’explosion éventuelle de l’assemblage SAFE. Le fond de distillation (figure 1[3]) peut être agité par une barre d’agitation pour faciliter l’évaporation de l’échantillon. - Régler la température de l’eau en circulation à 50 °C et celle du bain-marie du ballon de prélèvement à 40 °C. Fermez la soupape de dépression (Figure 1[2]).
- Installez l’ensemble SAFE (Figure 1) et connectez la bouteille de distillation en bas à gauche (Figure 1[3]) et la bouteille de collecte en bas à droite (Figure 1[4]). Connectez le tube d’eau circulant à l’arrière de l’ensemble de verre SAFE. Installez le piège à froid (Figure 1[5]) et connectez le tube à la pompe à vide (voir Tableau des matériaux) en haut à droite de l’ensemble en verre.
- Effectuez le fonctionnement de la pompe à vide.
- Mettez la pompe à vide sous tension.
- Augmentez progressivement la vitesse jusqu’à la vitesse maximale de 100%.
REMARQUE: Si la vitesse n’atteint pas 100%, vérifiez si le système est étanche à l’air et s’il y a des résidus de solvant à l’intérieur du système. - Après avoir atteint un vide poussé (de préférence 10-3 Pa)
REMARQUE: Le vide s’améliorera lorsque l’azote liquide sera ajouté au piège à froid.
- Effectuer la distillation de l’échantillon.
- Commencez la circulation de l’eau.
- Ajouter de l’azote liquide dans le piège à froid pour couvrir l’extérieur de la bouteille collectrice.
- Versez l’infusion de thé dans l’entonnoir d’échantillonnage en haut à gauche (Figure 1[1]), puis recouvrez-la d’un bouchon en verre.
- Introduire goutte à goutte l’échantillon dans la fiole de distillation. Contrôler la vitesse de chute de l’échantillon afin que le vide soit maintenu dans la plage appropriée d’environ 10−3 Pa.
REMARQUE: Ajoutez de l’azote liquide pendant le processus pour vous assurer que la bonne bouteille collectrice est toujours immergée dans de l’azote liquide. Essayez d’éviter la formation de condensat dans le piège à froid.
- Éteignez la pompe à vide une fois la distillation terminée.
- Appuyez sur l’interrupteur d’alimentation . Lorsque « STOP » clignote, appuyez sur la touche Entrée pour confirmer.
- Débranchez le cordon d’alimentation lorsque la vitesse de la pompe moléculaire diminue à « 0 ».
REMARQUE: Redémarrez uniquement lorsque la vitesse diminue à « 0 ».
- Rétablissez la pression atmosphérique du système.
- Retirez le bouchon de broyage au-dessus du flacon d’échantillonnage.
- Dévissez lentement le bouton de la soupape de vide pour rétablir la pression atmosphérique du système.
- Démonter le flacon collecteur avec l’échantillon.
- Retirez l’azote liquide à l’extérieur du flacon de collecte après avoir rétabli le système à la pression atmosphérique.
- Dévissez lentement le flacon de collecte. Démontez soigneusement le flacon collecteur avec l’échantillon.
- Fermez l’eau en circulation.
- Effectuer l’extraction liquide-liquide du distillat SAFE.
- Laissez le distillat SAFE dans la bouteille chauffer à température ambiante.
- Extraire le distillat SAFE trois fois avec 50 mL de dichlorométhane (voir le tableau des matières).
- Combiner les couches de dichlorométhane. Sécher l’extrait avec du sulfate de sodium anhydre (voir le tableau des matières).
NOTE: Le sulfate de sodium anhydre dans le solvant est considéré comme suffisamment sec lorsqu’il n’est plus cimenté et peut s’écouler librement. - Concentrer l’extrait à environ 2 mL en utilisant un léger jet d’azote.
- Transférer dans un flacon d’échantillon de 1 à 2 mL et poursuivre le concentré à 200 μL à l’aide d’un léger flux d’azote.
3. Analyse GC-SM et traitement des données
- Analyser les concentrés aromatiques préparés dans la section 2 du protocole à l’aide d’un système GC-MS (figure 2) équipé de colonnes capillaires de silice fondue (voir le tableau des matériaux).
- Utiliser de l’hélium comme gaz porteur avec une vitesse linéaire de 40 cm/s.
- Injecter 3 μL du concentré en mode injection splitless.
- Régler le programme de température du four GC: (1) maintenir à 40 ° C pendant 5 min; 2) porter à 200 °C à 5 °C/min; 3) augmenter à 280 °C à 10 °C/min; (4) maintenir à 280 °C pendant 10 min.
- Faire fonctionner le détecteur sélectif de masse en mode EI positif13 avec une plage de balayage de masse de 30 m/z à 350 m/z à 70 eV.
- Déconvoluer les données GC-MS à l’aide du Système automatisé de déconvolution et d’identification spectrales de masse (AMDIS, voir le tableau des matériaux).
- Faire correspondre et qualifier les données après déconvolution en utilisant le programme de recherche de spectromètre de masse NIST (National Institute of Standards and Technology)17 3.
- Calculer l’indice de rétention des composés14 à partir du résultat d’un ensemble de n-alcanes (C5-C25, voir le tableau des matériaux) dans les mêmes conditions GC.
- Identifiez les pics GC à l’aide de la bibliothèque de spectrométrie de masse du NIST et de la base de données de l’indice de rétention en fonction de la correspondance simultanée des indices de masse et de rétention.
- Calculer la concentration de chaque composant volatil dans l’échantillon SAFE par rapport à l’étalon interne en utilisant la surface du pic de chromatographie ionique totale (TIC).
- Répétez l’analyse trois fois, en commençant par la préparation de l’infusion de thé.
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Representative Results
La procédure analytique décrite ci-dessus est illustrée dans cette section à l’aide de l’exemple de l’analyse aromatique d’échantillons de thé noir et de thé vert.
Un chromatogramme GC-MS représentatif est illustré à la figure 3. La figure 3A montre un ensemble de n-alcanes, et la figure 3B montre le profil d’un étalon interne. Les résultats de l’évaluation des extraits des échantillons de thé vert et de thé noir sont présentés à la figure 3C et à la figure 3D, respectivement. En analysant les étalons internes, un pic définitif avec une ligne de base stable peut être détecté (Figure 3B). Le chromatogramme GC montre les profils GC complets obtenus à partir des extraits d’infusion de thé vert et de thé noir après comptage total des ions.
Un total de 104 composés aromatiques ont été identifiés dans les échantillons de thé vert et de thé noir par correspondance par spectrométrie de masse combinée à l’indice de rétention. La quantification relative a été calculée par la surface des pics du composé par rapport à l’étalon interne. La carte thermique, dessinée en fonction des résultats qualitatifs et quantitatifs, montre les teneurs en composés aromatiques par rapport à l’étalon interne pour les échantillons de thé vert et de thé noir (Figure 4).
Figure 1: Schéma du système SAFE. (1) Le flacon d’échantillon pour le prélèvement de l’échantillon. 2° la soupape de dépression; Le système doit être maintenu fermé avant d’ajouter des échantillons, et le débit de goutte de l’échantillon doit être ajusté en conséquence. (3) La bouteille de distillation pour la distillation de l’échantillon. (4) Le flacon de collecte pour le prélèvement de l’échantillon distillé. (5) Le piège à froid pour la récupération des échantillons non prélevés par le flacon de collecte et pour empêcher le solvant de pénétrer dans la pompe à vide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Diagramme schématique du système GC-MSD. Le système GC/MS est équipé (1) d’un orifice d’injection multimode, (2) d’un module de contrôle de débit (PCM) qui contrôle le débit porteur d’hélium, (3) d’une colonne capillaire de 60 m x 0,25 m x 0,25 m 5 ms et (4) d’un four à colonne GC. Les extraits de thé dans l’échantillon injecté sont séparés dans la colonne GC, à travers laquelle le gaz porteur circule et la température du four augmente. Les composants sont ionisés par une source d’ions EI, puis analysés dans un analyseur de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Chromatogramme ionique total typique d’une analyse GC-MS réussie. (A) Le chromatogramme des n-alcanes. Tous les pics de n-alcane sont affectés au nombre de carbone correspondant. (B) Le chromatogramme de l’étalon interne (paraxylène-d10). (C) Profil aromatique représentatif de l’infusion de thé vert. (D) Profil aromatique représentatif de l’infusion de thé noir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Carte thermique de 104 composés aromatiques identifiés dans les échantillons de thé noir (BT) et de thé vert (GT). Le nombre à côté de la note de couleur sur le côté droit de la carte thermique indique le contenu du composé (par rapport à la norme interne). La profondeur de couleur indique le niveau de teneur en matière ; Plus la couleur est profonde, plus le contenu relatif est élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cet article décrit une méthode efficace pour analyser les composés volatils dans les infusions de thé à l’aide de l’analyse SAFE et GC-MS.
Les infusions de thé ont une matrice complexe avec une teneur élevée en composants non volatils. Plusieurs méthodes ont été décrites dans la littérature pour isoler les composants volatils des infusions de thé. Une méthode courante est l’extraction par distillation simultanée (SDE)15,16. Cependant, il ne convient pas à l’analyse des arômes du thé car les feuilles de thé doivent être bouillies avec de l’eau pendant tout le processus de distillation / extraction, ce qui entraîne une réaction chimique des composants du thé et, par conséquent, donne un profil d’odeur très différent de l’échantillon original17. SAFE distille l’infusion de thé à basse température sous vide poussé, minimisant ainsi les changements dans les analytes et permettant de préserver la composition aromatique d’origine.
La microextraction en phase solide (SPME) est une autre méthode couramment utilisée pour l’analyse aromatique du thé18,19. Ses avantages résident dans la procédure simple et sans solvant. Cependant, la sélectivité de l’adsorption des fibres des composants aromatiques rend difficile l’obtention d’un profil quantitatif reflétant les caractéristiques aromatiques de l’échantillon, ce qui limite l’application de cette méthode pour l’analyse des arômes de thé20.
La technique de transfert sous vide poussé (HVT) a été développée pour réduire le risque de formation d’artefacts dans les analyses d’arômes21. Cependant, HVT a un faible rendement d’extraction pour les substances ayant des points d’ébullition élevés et une forte polarité, ce qui limite son champ d’utilisation.
Contrairement aux méthodes personnalisées ci-dessus, le distillat SAFE d’une infusion de thé est exempt de tout composant non volatil22,23,24. L’arôme dans le distillat peut être extrait quantitativement à l’aide de solvants organiques, ce qui signifie qu’un extrait avec un profil d’odeur proche de l’échantillon original peut être obtenu. Engel et coll.11 ont distillé des mélanges de n-alcanes en utilisant la distillation HVT ou SAFE pour vérifier l’efficacité. Les rendements en distillats obtenus à l’aide du système SAFE se sont avérés significativement plus élevés que ceux du HVT pour chaque alcane. De plus, les alcanes dont le point d’ébullition est inférieur à 285 °C pourraient être complètement récupérés par SAFE.
Une attention particulière doit être accordée aux détails expérimentaux pour d’autres analyses réussies. (1) La pression de vide pendant la distillation SAFE peut affecter la récupération des composants volatils et doit être maintenue à un niveau élevé, par exemple en ralentissant l’ajout de l’échantillon. (2) Il est nécessaire de s’assurer que le flacon de collecte est immergé dans l’azote liquide avant que le système ne revienne à la pression atmosphérique afin d’éviter que les solvants volatils ne soient condensés par le piège froid supérieur droit ou ne pénètrent dans la pompe à vide. (3) Il faut s’assurer que l’eau en circulation est allumée en premier et éteinte en dernier. L’eau en circulation ne doit être coupée qu’après l’élimination de l’azote liquide; Sinon, il gèlera l’appareil. (4) Le bain-marie doit être agité avec un aimant pour faciliter le transfert de chaleur.
Dans cette étude, la distillation SAFE a été réalisée avant l’extraction par solvant. Une procédure inversée est également possible, ce qui serait particulièrement avantageux si un grand volume d’infusion de thé est extrait d’abord et que l’extrait obtenu est ensuite distillé par SAFE. Le défi de l’extraction par infusion à l’aide d’un solvant organique est la formation possible d’une émulsion. Dans ce cas, des étapes supplémentaires sont nécessaires pour récupérer la couche organique, telles que la centrifugation ou le choix de différents solvants. Après l’expérience, l’ensemble de verre SAFE doit être nettoyé. L’éthanol ou l’acétone peuvent être utilisés comme solvant de nettoyage. Les pièces doivent être séchées avant utilisation.
En résumé, ce protocole propose une méthode pour obtenir un concentré aromatique avec un profil d’odeur proche de l’échantillon de thé original en utilisant une distillation SAFE suivie d’une extraction au solvant. Cette méthode peut être appliquée à tous les types d’échantillons de thé, y compris, par exemple, les poudres de thé instantanées et les concentrés de thé, et est bien adaptée aux études sensorielles moléculaires du thé.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32002094, 32102444), le Système chinois de recherche agricole du MOF et du MARA (CARS-19) et le Projet d’innovation pour l’Académie chinoise des sciences agricoles (CAAS-ASTIP-TRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkane mix (C10-C25) | ANPEL | CDAA-M-690035 | |
| Alkane mix (C5-C10) | ANPEL | CDAA-M-690037 | |
| AMDIS | National Institute of Standards and Technology | version 2.72 | Gaithersburg, MD |
| Analytical balance | OHAUS | EX125DH | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Anhydrous sodium sulfate | aladdin | ||
| Black tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| Concentrator | Biotage | TurboVap | |
| Data processor | Agilent | MassHunter | |
| Dichloromethane | TEDIA | ||
| GC | Agilent | 7890B | |
| GC column | Agilent | DB-5MS | |
| Green tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| MS | Agilent | 5977B | |
| p-Xylene-d10 | Sigma-Aldrich | ||
| SAFE | Glasbläserei Bahr | ||
| Ultra-pure deionized water | Milipore | Milli-Q | |
| Vacuum pump | Edwards | T-Station 85H |
References
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