Summary
Hier wird eine Methode zur Anreicherung und Analyse der flüchtigen Bestandteile von Teeextrakten mittels lösungsmittelunterstützter Aromaverdampfung und Lösungsmittelextraktion mit anschließender Gaschromatographie-Massenspektrometrie vorgestellt, die auf alle Arten von Teeproben angewendet werden kann.
Abstract
Das Teearoma ist ein wichtiger Faktor für die Teequalität, aber es ist aufgrund der Komplexität, der geringen Konzentration, der Vielfalt und der Labilität der flüchtigen Bestandteile des Teeextrakts schwierig zu analysieren. In dieser Studie wird eine Methode zur Gewinnung und Analyse der flüchtigen Bestandteile von Teeextrakt mit Geruchskonservierung unter Verwendung von lösungsmittelunterstützter Aromaverdampfung (SAFE) und Lösungsmittelextraktion mit anschließender Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) vorgestellt. SAFE ist eine Hochvakuum-Destillationstechnik, die flüchtige Verbindungen aus komplexen Lebensmittelmatrices ohne nichtflüchtige Interferenzen isolieren kann. In diesem Artikel wird ein vollständiges Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Teearomaanalyse vorgestellt, einschließlich der Teeaufgusszubereitung, der Lösungsmittelextraktion, der SAFE-Destillation, der Extraktkonzentration und der Analyse mittels GC-MS. Dieses Verfahren wurde an zwei Teeproben (Grüntee und Schwarztee) angewandt und es wurden sowohl qualitative als auch quantitative Ergebnisse über die flüchtige Zusammensetzung der Teeproben erzielt. Diese Methode kann nicht nur für die Aromaanalyse verschiedener Arten von Teeproben verwendet werden, sondern auch für molekularsensorische Untersuchungen an diesen.
Introduction
Tee ist ein bevorzugtes Getränk vieler Menschen auf der ganzen Welt 1,2. Das Aroma des Tees ist sowohl ein Qualitätskriterium als auch ein preisbestimmender Faktor für Teeblätter 3,4. Somit ist die Analyse der Aromazusammensetzung und des Gehaltes von Tee von großer Bedeutung für molekularsensorische Untersuchungen und die Qualitätskontrolle von Tee. Daher ist die Analyse der Aromazusammensetzung in denletzten Jahren ein wichtiges Thema in der Teeforschung 5,6,7.
Der Gehalt an Aromakomponenten im Tee ist sehr gering, da sie in der Regel nur 0,01%-0,05% des Trockengewichts der Teeblätter ausmachen8. Darüber hinaus stört die große Menge an nichtflüchtigen Bestandteilen in der Probenmatrix die Analyse mittels Gaschromatographieerheblich 9,10. Daher ist ein Probenvorbereitungsverfahren unerlässlich, um die flüchtigen Verbindungen im Tee zu isolieren. Die Hauptüberlegung bei der Isolierungs- und Anreicherungsmethode ist die Minimierung der Matrixinterferenz und gleichzeitig die Maximierung der Erhaltung des ursprünglichen Geruchsprofils der Probe.
Die lösungsmittelunterstützte Aromaverdampfung (SAFE), die ursprünglich von Engel, Bahr und Schieberle entwickelt wurde, ist eine verbesserte Hochvakuum-Destillationstechnik, die zur Isolierung flüchtiger Verbindungen aus komplexen Lebensmittelmatrizen verwendet wird11,12. Eine kompakte Glasbaugruppe, die mit einer Hochvakuumpumpe (unter einem typischen Betriebsdruck von 5 x 10−3 Pa) verbunden ist, kann flüchtige Verbindungen aus Lösungsmittelextrakten, öligen Lebensmitteln und wässrigen Proben effizient auffangen.
In diesem Artikel wurde eine Methode beschrieben, die die SAFE-Technik mit der Lösungsmittelextraktion kombiniert, um flüchtige Substanzen aus einem Schwarzteeaufguss zu isolieren, gefolgt von einer Analyse mittels GC-MS.
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Protocol
1. Zubereitung des internen Standards und des Teeaufgusses
- Stammlösung: 10,0 mg Paraxylol-d10 (siehe Materialtabelle) werden in 10,0 ml wasserfreiem Ethanol gelöst, um eine 1.000 ppm Stammlösung des internen Standards herzustellen.
- Arbeitslösung: 1 ml der Stammlösung (Schritt 1.1) auf 100 ml mit reinem Wasser verdünnen, um eine 10 ppm Arbeitslösung des internen Standards herzustellen.
HINWEIS: Die Arbeitslösung muss am selben Tag wie die Analyse vorbereitet werden. - 3 g Teeblätter (sowohl für grünen als auch für schwarzen Tee, siehe Materialtabelle) in einen Erlenmeyerkolben geben und 150 ml kochendes Wasser hinzufügen. Decken Sie den Kolben mit einem Glasstopfen ab.
- Nach 5 Minuten den Teeaufguss schnell durch ein Sieb mit 300 Maschen herausfiltern.
- Waschen Sie die verbrauchten Teeblätter zweimal mit 30 ml Wasser und vermischen Sie die Waschlösung mit dem Teeaufguss.
- Den Teeaufguss im Eiswasserbad schnell auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Geben Sie 1,00 ml Arbeitslösung (Schritt 1.2) in den Teeaufguss und mischen Sie sie gut.
2. Destillation des Teeaufgusses durch SAFE und Flüssig-Flüssig-Extraktion des Destillats
- Bereiten Sie die SAFE-Baugruppe vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Montieren Sie die SAFE-Baugruppe (Abbildung 1) und verbinden Sie die Destillationsflasche unten links (Abbildung 1[3]) und die Auffangflasche unten rechts (Abbildung 1[4]). Schließen Sie den Umlaufwasserschlauch an der Rückseite der SAFE-Glasbaugruppe an. Montieren Sie die Kühlfalle (Abbildung 1[5]) und verbinden Sie den Schlauch mit der Vakuumpumpe (siehe Materialtabelle) oben rechts an der Glasbaugruppe.
HINWEIS: Überprüfen Sie den Anschluss des Umlaufwasserschlauchs. Stellen Sie sicher, dass der Einlass oben und der Auslass unten austritt. Verwenden Sie deionisiertes Wasser für die Zirkulation, um zu verhindern, dass die Waage das weiße Rohr in der SAFE-Baugruppe blockiert, was zu einer schlechten Zirkulation des zirkulierenden Wassers und schließlich zur Explosion der SAFE-Baugruppe führen würde. Der Destillationsboden (Abbildung 1[3]) kann durch einen Rührstab gerührt werden, um die Verdampfung der Probe zu erleichtern. - Stellen Sie die Temperatur des Umlaufwassers auf 50 °C und die des Wasserbades für den Probenkolben auf 40 °C ein. Schließen Sie das Vakuumventil (Abbildung 1[2]).
- Montieren Sie die SAFE-Baugruppe (Abbildung 1) und verbinden Sie die Destillationsflasche unten links (Abbildung 1[3]) und die Auffangflasche unten rechts (Abbildung 1[4]). Schließen Sie den Umlaufwasserschlauch an der Rückseite der SAFE-Glasbaugruppe an. Montieren Sie die Kühlfalle (Abbildung 1[5]) und verbinden Sie den Schlauch mit der Vakuumpumpe (siehe Materialtabelle) oben rechts an der Glasbaugruppe.
- Führen Sie den Betrieb der Vakuumpumpe durch.
- Schalten Sie die Vakuumpumpe ein.
- Erhöhen Sie die Geschwindigkeit allmählich auf die maximale Geschwindigkeit von 100 %.
HINWEIS: Wenn die Drehzahl nicht 100 % erreicht, prüfen Sie, ob das System luftdicht ist und ob sich Lösungsmittelrückstände im Inneren des Systems befinden. - Nach Erreichen eines Hochvakuums (vorzugsweise 10-3 Pa)
HINWEIS: Das Vakuum verbessert sich, wenn der flüssige Stickstoff in die Kühlfalle gegeben wird.
- Führen Sie eine Probendestillation durch.
- Starten Sie den Wasserkreislauf.
- Geben Sie flüssigen Stickstoff in die Kühlfalle, um die Außenseite der Auffangflasche zu bedecken.
- Gießen Sie den Teeaufguss in den Probentrichter oben links (Abbildung 1[1]) und decken Sie ihn dann mit einem Glasstopfen ab.
- Die Probe wird tropfenweise in den Destillationskolben gegeben. Kontrollieren Sie die Probenabfallgeschwindigkeit so, dass das Vakuum im richtigen Bereich von etwa 10−3 Pa gehalten wird.
HINWEIS: Fügen Sie während des Vorgangs flüssigen Stickstoff hinzu, um sicherzustellen, dass die richtige Auffangflasche immer in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Versuchen Sie, Kondensatbildung in der Kühlfalle zu vermeiden.
- Schalten Sie die Vakuumpumpe nach Abschluss der Destillation aus.
- Drücken Sie den Netzschalter . Wenn "STOP" blinkt, drücken Sie zur Bestätigung die Eingabetaste.
- Ziehen Sie den Netzstecker, wenn die Drehzahl der Molekularpumpe auf "0" sinkt.
HINWEIS: Starten Sie den Computer nur neu, wenn die Geschwindigkeit auf "0" sinkt.
- Stellen Sie das System wieder auf atmosphärischen Druck her.
- Entfernen Sie den Mahlstopfen über der Probenahmeflasche.
- Schrauben Sie den Knopf des Vakuumventils langsam ab, um das System wieder auf atmosphärischen Druck zu bringen.
- Nehmen Sie die Auffangflasche mit der Probe herunter.
- Entfernen Sie den flüssigen Stickstoff aus der Auffangflasche, nachdem Sie das System wieder auf atmosphärischen Druck gebracht haben.
- Schrauben Sie die Auffangflasche langsam ab. Nehmen Sie die Auffangflasche mit der Probe vorsichtig herunter.
- Schließen Sie das zirkulierende Wasser.
- Führen Sie eine Flüssig-Flüssig-Extraktion des SAFE-Destillats durch.
- Lassen Sie das SAFE-Destillat in der Flasche auf Raumtemperatur erwärmen.
- Extrahieren Sie das SAFE-Destillat dreimal mit 50 ml Dichlormethan (siehe Materialtabelle).
- Verbinden Sie die Dichlormethanschichten. Trocknen Sie den Extrakt mit wasserfreiem Natriumsulfat (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Das wasserfreie Natriumsulfat im Lösungsmittel gilt als trocken genug, wenn es nicht mehr zementiert ist und frei fließen kann. - Konzentrieren Sie den Extrakt mit einem sanften Stickstoffstrom auf etwa 2 ml.
- In ein Probenfläschchen mit 1-2 ml überführen und mit einem sanften Stickstoffstrom weiter auf 200 μl konzentrieren.
3. GC-MS-Analyse und Datenverarbeitung
- Analysieren Sie die in Protokollabschnitt 2 hergestellten Aromakonzentrate mit einem GC-MS-System (Abbildung 2), das mit Quarzglaskapillarsäulen ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
- Verwenden Sie Helium als Trägergas mit einer linearen Geschwindigkeit von 40 cm/s.
- Injizieren Sie 3 μl des Konzentrats im splitless-Injektionsmodus.
- Stellen Sie das GC-Ofentemperaturprogramm ein: (1) 5 Minuten lang bei 40 °C halten; (2) auf 200 °C bei 5 °C/min erhöhen; (3) auf 280 °C bei 10 °C/min erhöhen; (4) 10 Minuten bei 280 °C halten.
- Betreiben Sie den massenselektiven Detektor im positiven EI-Modus13 mit einem Massenscanbereich von 30 m/z bis 350 m/z bei 70 eV.
- Dekonvolutieren Sie die GC-MS-Daten mit dem Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System (AMDIS, siehe Materialtabelle).
- Vergleichen und qualifizieren Sie die Daten nach der Dekonvolution mit dem NIST (National Institute of Standards and Technology) 17 Massenspektrometer-Suchprogramm3.
- Berechnen Sie den Retentionsindex der Verbindungen14 basierend auf dem Ergebnis eines Satzes von n-Alkanen (C5-C25, siehe Materialtabelle) unter den gleichen GC-Bedingungen.
- Identifizieren Sie die GC-Peaks mithilfe der NIST-Massenspektrometrie-Bibliothek und der Retention-Index-Datenbank basierend auf dem gleichzeitigen Abgleich der Massen- und Retentionsindizes.
- Berechnen Sie die Konzentration jeder flüchtigen Komponente in der SAFE-Probe relativ zum internen Standard unter Verwendung der TIC-Peakfläche (Gesamtionenchromatographie).
- Wiederholen Sie die Analyse dreimal, beginnend mit der Teeaufgusszubereitung.
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Representative Results
Das oben beschriebene analytische Vorgehen wird in diesem Abschnitt am Beispiel der Aromaanalyse von Schwarztee- und Grünteeproben veranschaulicht.
Ein repräsentatives GC-MS-Chromatogramm ist in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 3A zeigt einen Satz von n-Alkanen und Abbildung 3B zeigt das Profil eines internen Standards. Die Auswertungsergebnisse für die Extrakte aus den Proben aus grünem Tee und schwarzem Tee sind in Abbildung 3C bzw. Abbildung 3D dargestellt. Durch die Analyse der internen Standards kann ein definitiver Peak mit einer stabilen Basislinie nachgewiesen werden (Abbildung 3B). Das GC-Chromatogramm zeigt die vollständigen GC-Profile, die aus den Grüntee- und Schwarztee-Aufgussextrakten nach der Gesamtionenzählung erhalten wurden.
Insgesamt wurden 104 Aromastoffe in den Grüntee- und Schwarzteeproben durch massenspektrometrischen Abgleich in Kombination mit dem Retentionsindex identifiziert. Die relative Quantifizierung wurde anhand der Peakfläche der Verbindung relativ zum internen Standard berechnet. Die Heatmap, die nach den qualitativen und quantitativen Ergebnissen erstellt wurde, zeigt die Aromastoffgehalte relativ zum internen Standard für die Grüntee- und Schwarzteeproben (Abbildung 4).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des SAFE-Systems. (1) Die Probenflasche für die Probenentnahme. (2) Das Vakuumventil; Das System muss vor der Zugabe von Proben geschlossen gehalten werden, und der Tropfenfluss der Probe sollte entsprechend eingestellt werden. (3) Die Destillationsflasche für die Probendestillation. (4) Die Sammelflasche für die Entnahme der destillierten Probe. (5) Die Kühlfalle zur Rückgewinnung von Proben, die nicht von der Auffangflasche aufgefangen wurden, und zur Verhinderung des Eindringens des Lösungsmittels in die Vakuumpumpe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des GC-MSD-Systems. Das GC/MS-System ist ausgestattet mit (1) einem Multimode-Injektionsanschluss, (2) einem Durchflusskontrollmodul (PCM), das den Heliumträgerfluss steuert, (3) einer 60 m x 0,25 m x 0,25 m großen 5-ms-Kapillarsäule und (4) einem GC-Säulenofen. Die Teeextrakte in der injizierten Probe werden in der GC-Säule abgetrennt, durch die das Trägergas strömt und die Ofentemperatur steigt. Die Komponenten werden durch eine EI-Ionenquelle ionisiert und anschließend in einem Massenanalysator analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Typisches Gesamtionenchromatogramm aus einer erfolgreichen GC-MS-Analyse . (A) Das Chromatogramm der n-Alkane. Alle n-Alkan-Peaks sind der entsprechenden Kohlenstoffzahl zugeordnet. (B) Das Chromatogramm des internen Standards (Paraxylol-d10). (C) Repräsentatives Aromaprofil des Grüntee-Aufgusses. (D) Repräsentatives Aromaprofil des Schwarztee-Aufgusses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Heatmap von 104 Aromastoffen, die in den Proben von schwarzem Tee (BT) und grünem Tee (GT) identifiziert wurden. Die Zahl neben dem Farbhinweis auf der rechten Seite der Heatmap gibt den Inhalt der Verbindung (relativ zum internen Standard) an. Die Farbtiefe gibt den Grad des Materiegehalts an; Je tiefer die Farbe, desto höher der relative Gehalt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Methode zur Analyse flüchtiger Verbindungen in Teeaufgüssen mittels SAFE- und GC-MS-Analyse.
Teeaufgüsse haben eine komplexe Matrix mit einem hohen Gehalt an nichtflüchtigen Bestandteilen. In der Literatur wurden mehrere Methoden zur Isolierung der flüchtigen Bestandteile aus Teeaufgüssen beschrieben. Eine gängige Methode ist die simultane Destillationsextraktion (SDE)15,16. Es ist jedoch nicht für die Analyse von Teearomen geeignet, da die Teeblätter für den gesamten Destillations-/Extraktionsprozess mit Wasser gekocht werden müssen, was dazu führt, dass die Teebestandteile eine chemische Reaktion durchlaufen und somit ein Geruchsprofil ergeben, das sich stark von der ursprünglichen Probe unterscheidet17. SAFE destilliert den Teeaufguss bei niedriger Temperatur unter Hochvakuum, wodurch Veränderungen der Analyten minimiert werden und die ursprüngliche Aromakomposition erhalten bleibt.
Die Festphasen-Mikroextraktion (SPME) ist eine weitere Methode, die häufig für die Aromaanalyse von Tee verwendet wird18,19. Seine Vorteile liegen in dem einfachen und lösungsmittelfreien Verfahren. Die Selektivität der Faseradsorption der Aromakomponenten macht es jedoch schwierig, ein quantitatives Profil zu erhalten, das die Aromaeigenschaften der Probe widerspiegelt, was die Anwendung dieser Methode für die Teearomaanalyse einschränkt20.
Die Hochvakuum-Transfertechnik (HVT) wurde entwickelt, um die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Artefakten bei Aromaanalysen zu verringern21. HVT hat jedoch eine geringe Extraktionsausbeute für Substanzen mit hohem Siedepunkt und starker Polarität, was seinen Anwendungsbereich einschränkt.
Im Gegensatz zu den oben genannten benutzerdefinierten Methoden ist das SAFE-Destillat eines Teeaufgusses frei von nichtflüchtigen Bestandteilen22, 23, 24. Das Aroma im Destillat kann mit organischen Lösungsmitteln quantitativ extrahiert werden, so dass ein Extrakt mit einem Geruchsprofil erhalten werden kann, das der ursprünglichen Probe nahe kommt. Engel et al.11 destillierten Mischungen von n-Alkanen mittels HVT- oder SAFE-Destillation, um die Effizienz zu überprüfen. Es wurde festgestellt, dass die Destillatausbeuten mit dem SAFE-System für jedes Alkan signifikant höher sind als die von HVT. Darüber hinaus konnten Alkane mit einem Siedepunkt unter 285 °C vollständig durch SAFE zurückgewonnen werden.
Für weitere erfolgreiche Analysen muss den experimentellen Details besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. (1) Der Vakuumdruck während der SAFE-Destillation kann die Rückgewinnung der flüchtigen Bestandteile beeinträchtigen und muss auf einem hohen Niveau gehalten werden, z. B. durch Verlangsamung der Probenzugabe. (2) Es muss sichergestellt werden, dass die Auffangflasche in flüssigen Stickstoff getaucht wird, bevor das System zum atmosphärischen Druck zurückkehrt, um zu vermeiden, dass flüchtige Lösungsmittel durch die Kühlfalle oben rechts kondensieren oder in die Vakuumpumpe gelangen. (3) Man sollte darauf achten, dass das zirkulierende Wasser zuerst eingeschaltet und zuletzt ausgeschaltet wird. Das zirkulierende Wasser sollte erst abgestellt werden, nachdem der flüssige Stickstoff entfernt wurde. Andernfalls friert das Gerät ein. (4) Das Wasserbad sollte mit einem Magneten gerührt werden, um die Wärmeübertragung zu unterstützen.
In dieser Studie wurde die SAFE-Destillation vor der Lösungsmittelextraktion durchgeführt. Auch ein umgekehrtes Verfahren ist möglich, und dies wäre besonders vorteilhaft, wenn zunächst eine große Menge Teeaufguss extrahiert und der erhaltene Extrakt dann durch SAFE destilliert wird. Die Herausforderung bei der Infusionsextraktion mit einem organischen Lösungsmittel ist die mögliche Bildung einer Emulsion. In diesem Fall sind zusätzliche Schritte erforderlich, um die organische Schicht zurückzugewinnen, wie z. B. Zentrifugation oder die Auswahl verschiedener Lösungsmittel. Nach dem Experiment muss die SAFE-Glasbaugruppe gereinigt werden. Als Reinigungsmittel kann Ethanol oder Aceton verwendet werden. Die Teile sollten vor dem Gebrauch getrocknet werden.
Zusammenfassend wird in diesem Protokoll eine Methode vorgeschlagen, um ein Aromakonzentrat mit einem Geruchsprofil zu erhalten, das der ursprünglichen Teeprobe nahe kommt, indem die SAFE-Destillation mit anschließender Lösungsmittelextraktion verwendet wird. Diese Methode kann auf alle Arten von Teeproben angewendet werden, darunter z. B. Instant-Teepulver und Teekonzentrate, und eignet sich gut für molekularsensorische Untersuchungen von Tee.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (32002094, 32102444), dem China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-19) und dem Innovation Project for Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-ASTIP-TRI) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkane mix (C10-C25) | ANPEL | CDAA-M-690035 | |
| Alkane mix (C5-C10) | ANPEL | CDAA-M-690037 | |
| AMDIS | National Institute of Standards and Technology | version 2.72 | Gaithersburg, MD |
| Analytical balance | OHAUS | EX125DH | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Anhydrous sodium sulfate | aladdin | ||
| Black tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| Concentrator | Biotage | TurboVap | |
| Data processor | Agilent | MassHunter | |
| Dichloromethane | TEDIA | ||
| GC | Agilent | 7890B | |
| GC column | Agilent | DB-5MS | |
| Green tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| MS | Agilent | 5977B | |
| p-Xylene-d10 | Sigma-Aldrich | ||
| SAFE | Glasbläserei Bahr | ||
| Ultra-pure deionized water | Milipore | Milli-Q | |
| Vacuum pump | Edwards | T-Station 85H |
References
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