Summary
Aquí se presenta un método para enriquecer y analizar los componentes volátiles de los extractos de té mediante la evaporación de sabor asistida por solventes y la extracción con solventes, seguida de cromatografía de gases-espectrometría de masas, que se puede aplicar a todo tipo de muestras de té.
Abstract
El aroma del té es un factor importante en la calidad del té, pero es difícil de analizar debido a la complejidad, la baja concentración, la diversidad y la labilidad de los componentes volátiles del extracto de té. Este estudio presenta un método para la obtención y análisis de los componentes volátiles del extracto de té con preservación de olores utilizando evaporación de sabor asistida por solventes (SAFE) y extracción con solventes seguida de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). SAFE es una técnica de destilación al alto vacío que puede aislar compuestos volátiles de matrices alimentarias complejas sin ninguna interferencia no volátil. En este artículo se presenta un procedimiento completo paso a paso para el análisis del aroma del té, incluida la preparación de la infusión de té, la extracción con solventes, la destilación SAFE, la concentración del extracto y el análisis mediante GC-MS. Este procedimiento se aplicó a dos muestras de té (té verde y té negro), y se obtuvieron resultados cualitativos y cuantitativos sobre la composición volátil de las muestras de té. Este método no solo se puede utilizar para el análisis de aromas de varios tipos de muestras de té, sino también para estudios sensoriales moleculares sobre ellas.
Introduction
El té es la bebida preferida de muchas personas en todo el mundo 1,2. El aroma del té es un criterio de calidad, así como un factor determinante del precio de las hojas de té 3,4. Por lo tanto, el análisis de la composición aromática y el contenido del té es de gran importancia para los estudios sensoriales moleculares y el control de calidad del té. Como resultado, el análisis de la composición del aroma ha sido un tema importante en la investigación del té en los últimos años 5,6,7.
El contenido de componentes aromáticos en el té es muy bajo, ya que generalmente solo representan el 0,01%-0,05% del peso seco de las hojas de té8. Además, la gran cantidad de componentes no volátiles en la matriz de la muestra interfiere significativamente con el análisis por cromatografía de gases 9,10. Por lo tanto, un procedimiento de preparación de muestras es esencial para aislar los compuestos volátiles en el té. La consideración clave para el método de aislamiento y enriquecimiento es minimizar la interferencia de la matriz y, al mismo tiempo, maximizar la preservación del perfil de olor original de la muestra.
La evaporación de sabor asistida por solventes (SAFE, por sus siglas en inglés), desarrollada originalmente por Engel, Bahr y Schieberle, es una técnica mejorada de destilación al alto vacío que se utiliza para aislar compuestos volátiles de matrices alimentarias complejas11,12. Un conjunto de vidrio compacto conectado a una bomba de alto vacío (bajo una presión de funcionamiento típica de 5 x 10−3 Pa) puede recolectar de manera eficiente compuestos volátiles de extractos de solventes, alimentos aceitosos y muestras acuosas.
En este artículo se describe un método que combina la técnica SAFE con la extracción con disolventes para aislar sustancias volátiles de una infusión de té negro, seguido de un análisis mediante GC-MS.
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Protocol
1. Preparación del estándar interno e infusión de té
- Solución madre: Disolver 10,0 mg de paraxileno-d10 (ver Tabla de Materiales) en 10,0 mL de etanol anhidro para preparar una solución madre de 1.000 ppm del patrón interno.
- Solución de trabajo: Diluir 1 ml de la solución madre (paso 1.1) a 100 ml con agua pura para preparar una solución de trabajo de 10 ppm del patrón interno.
NOTA: La solución de trabajo debe prepararse el mismo día que el análisis. - Coloque 3 g de hojas de té (tanto para té verde como para té negro, consulte la tabla de materiales) en un matraz Erlenmeyer y agregue 150 ml de agua hirviendo. Cubra el matraz con un tapón de vidrio.
- Después de 5 minutos, filtre rápidamente la infusión de té a través de un colador de malla 300.
- Lave las hojas de té gastadas dos veces con 30 ml de agua y combine la solución de lavado con la infusión de té.
- Enfríe la infusión de té a temperatura ambiente rápidamente en un baño de agua helada.
- Agregue 1.00 mL de solución de trabajo (paso 1.2) a la infusión de té y mezcle bien.
2. Destilación de la infusión de té por extracción SEGURA y líquido-líquido del destilado
- Prepare el ensamblaje SAFE siguiendo los pasos a continuación.
- Instale el conjunto SAFE (Figura 1) y conecte la botella de destilación en la parte inferior izquierda (Figura 1[3]) y la botella de recolección en la parte inferior derecha (Figura 1[4]). Conecte el tubo de agua circulante en la parte posterior del conjunto de vidrio SAFE. Instale la trampa de frío (Figura 1[5]) y conecte el tubo a la bomba de vacío (consulte la Tabla de materiales) en la parte superior derecha del conjunto de vidrio.
NOTA: Compruebe la conexión del tubo de agua circulante; Asegúrese de que la entrada entre por la parte superior y la salida salga por la parte inferior. Utilice agua desionizada para la circulación para evitar que la báscula bloquee el tubo blanco en el conjunto SAFE, lo que daría como resultado una mala circulación del agua circulante y la eventual explosión del conjunto SAFE. El fondo de destilación (Figura 1[3]) se puede agitar con una barra de agitación para facilitar la evaporación de la muestra. - Ajuste la temperatura del agua circulante a 50 °C y la del baño de agua para el matraz de muestras a 40 °C. Cierre la válvula de vacío (Figura 1[2]).
- Instale el conjunto SAFE (Figura 1) y conecte la botella de destilación en la parte inferior izquierda (Figura 1[3]) y la botella de recolección en la parte inferior derecha (Figura 1[4]). Conecte el tubo de agua circulante en la parte posterior del conjunto de vidrio SAFE. Instale la trampa de frío (Figura 1[5]) y conecte el tubo a la bomba de vacío (consulte la Tabla de materiales) en la parte superior derecha del conjunto de vidrio.
- Realice la operación de la bomba de vacío.
- Encienda la bomba de vacío.
- Aumente gradualmente la velocidad hasta la velocidad máxima del 100%.
NOTA: Si la velocidad no alcanza el 100%, compruebe si el sistema es hermético y si hay residuos de disolvente en el interior del sistema. - Después de alcanzar un alto vacío (preferiblemente 10-3 Pa)
NOTA: El vacío mejorará cuando se agregue nitrógeno líquido a la trampa fría.
- Realice la destilación de muestras.
- Inicie la circulación del agua.
- Agregue nitrógeno líquido a la trampa fría para cubrir el exterior de la botella recolectora.
- Vierta la infusión de té en el embudo de muestra en la parte superior izquierda (Figura 1 [1]) y luego cúbralo con un tapón de vidrio.
- Introducir la muestra en el matraz de destilación gota a gota. Controle la velocidad de caída de la muestra para que el vacío se mantenga en el rango adecuado de alrededor de 10−3 Pa.
NOTA: Agregue nitrógeno líquido durante el proceso para asegurarse de que la botella colectora correcta esté siempre sumergida en nitrógeno líquido. Trate de evitar la formación de condensación en la trampa fría.
- Apague la bomba de vacío después de completar la destilación.
- Presione el interruptor de encendido . Cuando "STOP" parpadee, presione la tecla Enter para confirmar.
- Desenchufe el cable de alimentación cuando la velocidad de la bomba molecular disminuya a "0".
NOTA: Reinicie solo cuando la velocidad disminuya a "0".
- Restaure el sistema a la presión atmosférica.
- Retire el tapón de molienda situado encima de la botella de muestreo.
- Desenrosque la perilla de la válvula de vacío lentamente para restaurar el sistema a la presión atmosférica.
- Retire el frasco colector con la muestra.
- Retire el nitrógeno líquido fuera de la botella de recolección después de recuperar el sistema a presión atmosférica.
- Desenrosque el frasco de recolección lentamente. Retire el frasco colector con la muestra con cuidado.
- Cierre el agua circulante.
- Realice la extracción líquido-líquido del destilado SAFE.
- Deje que el destilado SAFE en la botella se caliente a temperatura ambiente.
- Extraiga el destilado SAFE tres veces con 50 ml de diclorometano (consulte la tabla de materiales).
- Combina las capas de diclorometano. Secar el extracto con sulfato de sodio anhidro (ver la Tabla de Materiales).
NOTA: El sulfato de sodio anhidro en el solvente se considera lo suficientemente seco cuando ya no está cementado y puede fluir libremente. - Concentrar el extracto a unos 2 ml con un chorro de nitrógeno suave.
- Transfiera a un vial de muestra de 1-2 ml y concéntrelo a 200 μl con un chorro de nitrógeno suave.
3. Análisis GC-MS y procesamiento de datos
- Analice los concentrados aromáticos preparados en la sección 2 del protocolo utilizando un sistema GC-MS (Figura 2) equipado con columnas capilares de sílice fundida (ver la Tabla de Materiales).
- Utilice helio como gas portador con una velocidad lineal de 40 cm/s.
- Inyectar 3 μL del concentrado en modo de inyección splitless.
- Ajuste el programa de temperatura del horno GC: (1) mantener a 40 °C durante 5 min; (2) aumentar a 200 °C a 5 °C/min; (3) aumentar a 280 °C a 10 °C/min; (4) mantener a 280 °C durante 10 min.
- Opere el detector selectivo de masas en el modo EI positivo13 con un rango de barrido de masas de 30 m/z a 350 m/z a 70 eV.
- Deconvolució los datos de GC-MS utilizando el Sistema Automatizado de Deconvolución e Identificación de Espectral de Masas (AMDIS, consulte la Tabla de Materiales).
- Hacer coincidir y calificar los datos después de la deconvolución utilizando el programa de búsqueda de espectrómetro de masas NIST (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología) 173.
- Calcule el índice de retención de los compuestos14 basándose en el resultado de un conjunto de n-alcanos (C5-C25, consulte la Tabla de Materiales) en las mismas condiciones de GC.
- Identifique los picos de GC utilizando la biblioteca de espectrometría de masas del NIST y la base de datos de índices de retención basada en la coincidencia simultánea de los índices de masa y retención.
- Calcule la concentración de cada componente volátil en la muestra SAFE en relación con el patrón interno utilizando el área de pico TIC (cromatografía iónica total).
- Repita el análisis tres veces, comenzando por la preparación de la infusión de té.
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Representative Results
El procedimiento analítico descrito anteriormente se ilustra en esta sección utilizando el ejemplo del análisis de aromas de muestras de té negro y té verde.
En la Figura 3 se muestra un cromatograma GC-MS representativo. La Figura 3A muestra un conjunto de n-alcanos y la Figura 3B muestra el perfil de un patrón interno. Los resultados de la evaluación de los extractos de las muestras de té verde y té negro se muestran en la Figura 3C y la Figura 3D, respectivamente. Al analizar los estándares internos, se puede detectar un pico definitivo con una línea de base estable (Figura 3B). El cromatograma de GC muestra los perfiles completos de GC obtenidos de los extractos de infusión de té verde y té negro después del recuento total de iones.
Se identificaron un total de 104 compuestos aromáticos en las muestras de té verde y té negro mediante espectrometría de masas combinada con el índice de retención. La cuantificación relativa se calculó mediante el área de pico del compuesto en relación con el patrón interno. El mapa de calor, dibujado de acuerdo con los resultados cualitativos y cuantitativos, muestra el contenido de compuestos aromáticos en relación con el estándar interno para las muestras de té verde y té negro (Figura 4).
Figura 1: Diagrama esquemático del sistema SAFE. (1) El frasco de muestras para la recogida de muestras. (2) La válvula de vacío; El sistema debe mantenerse cerrado antes de agregar muestras, y el flujo de gota de la muestra debe ajustarse adecuadamente. (3) La botella de destilación para la destilación de la muestra. (4) La botella de recolección para la recolección de la muestra destilada. (5) La trampa fría para la recuperación de muestras no recogidas por la botella de recogida y para evitar que el disolvente entre en la bomba de vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama esquemático del sistema GC-MSD. El sistema GC/MS está equipado con (1) un puerto de inyección multimodo, (2) un módulo de control de flujo (PCM) que controla el flujo portador de helio, (3) una columna capilar de 60 m x 0,25 m x 0,25 m 5 ms y (4) un horno de columna GC. Los extractos de té en la muestra inyectada se separan en la columna GC, a través de la cual fluye el gas portador y aumenta la temperatura del horno. Los componentes son ionizados por una fuente de iones EI y luego analizados en un analizador de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cromatograma iónico total típico de un análisis GC-MS exitoso. (A) El cromatograma de los n-alcanos. Todos los picos de n-alcanos se asignan al número de carbono correspondiente. (B) El cromatograma del patrón interno (paraxileno-d10). (C) Perfil aromático representativo de la infusión de té verde. (D) Perfil aromático representativo de la infusión de té negro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mapa de calor de 104 compuestos aromáticos identificados en las muestras de té negro (BT) y té verde (GT). El número junto a la nota de color en el lado derecho del mapa de calor indica el contenido del compuesto (en relación con el estándar interno). La profundidad de color indica el nivel de contenido de materia; Cuanto más profundo sea el color, mayor será el contenido relativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo describe un método eficiente para analizar compuestos volátiles en infusiones de té utilizando análisis SAFE y GC-MS.
Las infusiones de té tienen una matriz compleja con un alto contenido de componentes no volátiles. En la literatura se han descrito varios métodos para aislar los componentes volátiles de las infusiones de té. Un método común es la extracción por destilación simultánea (SDE)15,16. Sin embargo, no es adecuado para el análisis de aromas de té porque las hojas de té deben hervirse con agua durante todo el proceso de destilación/extracción, lo que hace que los componentes del té sufran una reacción química y, por lo tanto, produce un perfil de olor muy diferente al de la muestra original17. SAFE destila la infusión de té a baja temperatura bajo un alto vacío, minimizando así los cambios en los analitos y permitiendo conservar la composición original del aroma.
La microextracción en fase sólida (SPME) es otro método comúnmente utilizado para el análisis del aroma del té18,19. Sus ventajas radican en el procedimiento sencillo y sin disolventes. Sin embargo, la selectividad de la adsorción de fibras de los componentes aromáticos dificulta la obtención de un perfil cuantitativo que refleje las características aromáticas de la muestra, lo que limita la aplicación de este método para el análisis del aroma del té20.
La técnica de transferencia de alto vacío (HVT) se desarrolló para reducir la posibilidad de que se formaran artefactos en los análisis de aromas21. Sin embargo, el HVT tiene un bajo rendimiento de extracción para sustancias con altos puntos de ebullición y fuerte polaridad, lo que limita su ámbito de uso.
A diferencia de los métodos personalizados anteriores, el destilado SEGURO de una infusión de té está libre de componentes no volátiles22,23,24. El aroma del destilado se puede extraer cuantitativamente utilizando disolventes orgánicos, lo que significa que se puede obtener un extracto con un perfil de olor cercano a la muestra original. Engel et al.11 destilaron mezclas de n-alcanos utilizando destilación HVT o SAFE para comprobar la eficiencia. Se encontró que los rendimientos de destilados utilizando el sistema SAFE eran significativamente más altos que los de HVT para cada alcano. Además, los alcanos con puntos de ebullición inferiores a 285 °C podrían recuperarse completamente mediante SAFE.
Es necesario prestar mucha atención a los detalles experimentales para que los análisis sean exitosos. (1) La presión de vacío durante la destilación SAFE puede afectar a la recuperación de los componentes volátiles y debe mantenerse a un nivel alto, por ejemplo, ralentizando la adición de la muestra. (2) Es necesario asegurarse de que la botella de recolección esté sumergida en nitrógeno líquido antes de que el sistema vuelva a la presión atmosférica para evitar que los volátiles del solvente se condensen por la trampa fría superior derecha o ingresen a la bomba de vacío. (3) Se debe asegurarse de que el agua circulante se abra primero y se cierre al final. El agua circulante solo debe cerrarse después de que se haya eliminado el nitrógeno líquido; de lo contrario, congelará el dispositivo. (4) El baño de agua debe agitarse con un imán para ayudar a la transferencia de calor.
En este estudio, se realizó la destilación SAFE antes de la extracción con disolvente. También es factible un procedimiento inverso, y esto sería especialmente ventajoso si primero se extrae un gran volumen de infusión de té y luego se destila el extracto obtenido por SAFE. El reto de la extracción por infusión con un disolvente orgánico es la posible formación de una emulsión. En este caso, se necesitan pasos adicionales para recuperar la capa orgánica, como la centrifugación o la elección de diferentes disolventes. Después del experimento, se debe limpiar el conjunto de vidrio SAFE. Se puede utilizar etanol o acetona como disolvente de limpieza. Las piezas deben secarse antes de su uso.
En resumen, este protocolo propone un método para obtener un concentrado aromático con un perfil de olor cercano a la muestra de té original utilizando la destilación SAFE seguida de la extracción con disolventes. Este método se puede aplicar a todo tipo de muestras de té, incluidos, por ejemplo, polvos de té instantáneo y concentrados de té, y es muy adecuado para estudios sensoriales moleculares del té.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32002094, 32102444), el Sistema de Investigación Agrícola de China del Ministerio de Agricultura y el Estudio de Agricultura y Pesca (CARS-19) y el Proyecto de Innovación para la Academia China de Ciencias Agrícolas (CAAS-ASTIP-TRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkane mix (C10-C25) | ANPEL | CDAA-M-690035 | |
| Alkane mix (C5-C10) | ANPEL | CDAA-M-690037 | |
| AMDIS | National Institute of Standards and Technology | version 2.72 | Gaithersburg, MD |
| Analytical balance | OHAUS | EX125DH | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Anhydrous sodium sulfate | aladdin | ||
| Black tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| Concentrator | Biotage | TurboVap | |
| Data processor | Agilent | MassHunter | |
| Dichloromethane | TEDIA | ||
| GC | Agilent | 7890B | |
| GC column | Agilent | DB-5MS | |
| Green tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| MS | Agilent | 5977B | |
| p-Xylene-d10 | Sigma-Aldrich | ||
| SAFE | Glasbläserei Bahr | ||
| Ultra-pure deionized water | Milipore | Milli-Q | |
| Vacuum pump | Edwards | T-Station 85H |
References
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