Summary
Apresenta-se aqui um método para enriquecimento e análise dos componentes voláteis de extratos de chá usando evaporação de sabor assistida por solvente e extração por solvente seguida de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, que pode ser aplicado a todos os tipos de amostras de chá.
Abstract
O aroma do chá é um fator importante na qualidade do chá, mas é difícil de analisar devido à complexidade, baixa concentração, diversidade e labilidade dos componentes voláteis do extrato do chá. Este estudo apresenta um método para obtenção e análise dos componentes voláteis do extrato de chá com preservação de odor utilizando evaporação assistida por solvente (SAFE) e extração por solvente seguida de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). SAFE é uma técnica de destilação de alto vácuo que pode isolar compostos voláteis de matrizes alimentares complexas sem qualquer interferência não volátil. Um procedimento passo-a-passo completo para análise do aroma do chá é apresentado neste artigo, incluindo a preparação para infusão de chá, extração com solvente, destilação SAFE, concentração do extrato e análise por CG-EM. Este procedimento foi aplicado em duas amostras de chá (chá verde e chá preto), obtendo-se resultados qualitativos e quantitativos sobre a composição volátil das amostras de chá. Este método não só pode ser usado para a análise de aroma de vários tipos de amostras de chá, mas também para estudos sensoriais moleculares sobre eles.
Introduction
O chá é a bebida preferida de muitas pessoas em todo o mundo 1,2. O aroma do chá é um critério de qualidade, bem como um fator determinante de preço para as folhas de chá 3,4. Assim, a análise da composição e do teor de aromas do chá é de grande importância para os estudos sensoriais moleculares e para o controle de qualidade do chá. Como resultado, a análise da composição de aromas tem sido um tópico importante na pesquisa do chá nos últimos anos 5,6,7.
O teor de componentes do aroma no chá é muito baixo, pois eles geralmente representam apenas 0,01%-0,05% do peso seco das folhas do chá8. Além disso, a grande quantidade de componentes não voláteis na matriz da amostra interfere significativamente na análise por cromatografia gasosa 9,10. Portanto, um procedimento de preparo da amostra é essencial para isolar os compostos voláteis presentes no chá. A principal consideração para o método de isolamento e enriquecimento é minimizar a interferência da matriz e, ao mesmo tempo, maximizar a preservação do perfil odorífero original da amostra.
A evaporação de sabor assistida por solvente (SAFE), originalmente desenvolvida por Engel, Bahr e Schieberle, é uma técnica aprimorada de destilação a alto vácuo usada para isolar compostos voláteis de matrizes alimentares complexas11,12. Um conjunto compacto de vidro conectado a uma bomba de alto vácuo (sob uma pressão de operação típica de 5 x 10−3 Pa) pode coletar eficientemente compostos voláteis de extratos solventes, alimentos oleosos e amostras aquosas.
Este artigo descreveu um método que combina a técnica SAFE com extração por solvente para isolar substâncias voláteis de uma infusão de chá preto, seguido de análise usando GC-MS.
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Protocol
1. Preparo do padrão interno e infusão de chá
- Solução-mãe: Dissolver 10,0 mg de paraxileno-d10 (ver Tabela de Materiais) em 10,0 mL de etanol anidro para preparar uma solução-mãe de 1.000 ppm do padrão interno.
- Solução de trabalho: Diluir 1 ml da solução-mãe (passo 1.1) para 100 ml com água pura para preparar uma solução de trabalho de 10 ppm do padrão interno.
NOTA: A solução de trabalho deve ser preparada no mesmo dia da análise. - Coloque 3 g de folhas de chá (tanto para o chá verde como para o chá preto, ver Tabela de Materiais) num balão de Erlenmeyer e adicione 150 ml de água a ferver. Cubra o balão com uma rolha de vidro.
- Após 5 minutos, filtre rapidamente a infusão de chá através de uma peneira de 300 mehas.
- Lave as folhas de chá gastas duas vezes com 30 mL de água e combine a solução de lavagem com a infusão de chá.
- Resfriar a infusão de chá à temperatura ambiente rapidamente em um banho de água gelada.
- Adicionar 1,00 ml de solução de trabalho (passo 1.2) à perfusão de chá e misturá-los bem.
2. Destilação da perfusão de chá por SAFE e extracção líquido-líquido do destilado
- Prepare o conjunto SAFE seguindo as etapas abaixo.
- Instale o conjunto SAFE (Figura 1) e conecte o frasco de destilação no canto inferior esquerdo (Figura 1[3]) e o frasco de coleta no canto inferior direito (Figura 1[4]). Conecte o tubo de água circulante na parte traseira do conjunto de vidro SAFE. Instale a armadilha fria (Figura 1[5]) e conecte o tubo à bomba de vácuo (ver Tabela de Materiais) no canto superior direito do conjunto de vidro.
OBS: Verifique a conexão do tubo de água circulante; Certifique-se de que a entrada entra na parte superior e a saída sai pela parte inferior. Use água deionizada para a circulação para evitar que a balança bloqueie o tubo branco no conjunto SAFE, o que resultaria na má circulação da água circulante e na eventual explosão do conjunto SAFE. O fundo de destilação (Figura 1[3]) pode ser agitado por uma barra de agitação para facilitar a evaporação da amostra. - Fixar a temperatura da água circulante em 50 °C e a do banho-maria do balão de amostra em 40 °C. Feche a válvula de vácuo (Figura 1[2]).
- Instale o conjunto SAFE (Figura 1) e conecte o frasco de destilação no canto inferior esquerdo (Figura 1[3]) e o frasco de coleta no canto inferior direito (Figura 1[4]). Conecte o tubo de água circulante na parte traseira do conjunto de vidro SAFE. Instale a armadilha fria (Figura 1[5]) e conecte o tubo à bomba de vácuo (ver Tabela de Materiais) no canto superior direito do conjunto de vidro.
- Execute a operação da bomba de vácuo.
- Ligue a bomba de vácuo.
- Aumente gradualmente a velocidade até a velocidade máxima de 100%.
NOTA: Se a velocidade não atingir 100%, verifique se o sistema é hermético e se há resíduo de solvente dentro do sistema. - Depois de atingir um vácuo alto (de preferência 10-3 Pa)
NOTA: O vácuo irá melhorar quando o nitrogênio líquido é adicionado à armadilha fria.
- Realizar a destilação da amostra.
- Inicie a circulação da água.
- Adicione azoto líquido à armadilha fria para cobrir o exterior do frasco de recolha.
- Despeje a infusão de chá no funil de amostra no canto superior esquerdo (Figura 1[1]) e, em seguida, cubra-o com uma rolha de vidro.
- Introduzir a amostra no balão de destilação gota a gota. Controle a velocidade de queda da amostra para que o vácuo seja mantido na faixa adequada de cerca de 10−3 Pa.
NOTA: Adicione nitrogênio líquido durante o processo para garantir que o frasco de coleta correto esteja sempre submerso em nitrogênio líquido. Tente evitar a formação de condensado na armadilha fria.
- Desligue a bomba de vácuo após a conclusão da destilação.
- Pressione o botão liga/desliga . Quando "STOP" piscar, pressione a tecla Enter para confirmar.
- Desconecte o cabo de alimentação quando a velocidade da bomba molecular diminuir para "0".
Observação : reinicie somente quando a velocidade diminui para "0".
- Restaurar o sistema à pressão atmosférica.
- Retire o tampão de moagem acima do frasco de amostragem.
- Desparafuse o botão da válvula de vácuo lentamente para restaurar o sistema à pressão atmosférica.
- Retire o frasco de coleta com a amostra.
- Retire o nitrogênio líquido do lado de fora do frasco de coleta após recuperar o sistema à pressão atmosférica.
- Desparafuse o frasco de coleta lentamente. Retire o frasco coletor com a amostra cuidadosamente.
- Feche a água circulante.
- Realizar extração líquido-líquido do destilado SAFE.
- Deixe o destilado SAFE no frasco aquecer até à temperatura ambiente.
- Extrair o destilado SAFE três vezes com 50 ml de diclorometano (ver Tabela de Materiais).
- Combine as camadas de diclorometano. Secar o extrato com sulfato de sódio anidro (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O sulfato de sódio anidro no solvente é considerado seco o suficiente quando não é mais cimentado e pode fluir livremente. - Concentre o extrato em cerca de 2 mL usando uma corrente de nitrogênio suave.
- Transfira para um frasco para injetáveis de amostra de 1-2 ml e concentre-se ainda mais para 200 μL utilizando uma corrente de azoto suave.
3. Análise GC-MS e processamento de dados
- Analise os concentrados de aroma preparados na seção 2 do protocolo usando um sistema GC-MS (Figura 2) equipado com colunas capilares de sílica fundida (consulte a Tabela de Materiais).
- Use hélio como gás carreador com uma velocidade linear de 40 cm/s.
- Injetar 3 μL do concentrado no modo de injeção splitless.
- Ajuste o programa de temperatura do forno GC: (1) segure a 40 °C por 5 min; (2) aumentar para 200 °C a 5 °C/min; (3) aumentar para 280 °C a 10 °C/min; (4) Segurar a 280 °C durante 10 min.
- Opere o detector seletivo de massa no modo EI positivo13 com uma faixa de varredura de massa de 30 m/z a 350 m/z a 70 eV.
- Desconvolute os dados do GC-MS usando o Sistema Automatizado de Deconvolução e Identificação Espectral de Massa (AMDIS, consulte a Tabela de Materiais).
- Combine e qualifique os dados após a deconvolução usando o programa de busca de espectrômetros de massa NIST (National Institute of Standards and Technology)17 3.
- Calcular o índice de retenção dos compostos14 com base no resultado de um conjunto de n-alcanos (C5-C25, ver Tabela de Materiais) sob as mesmas condições de CG.
- Identifique os picos de GC usando a biblioteca de espectrometria de massa NIST e o banco de dados de índice de retenção com base na correspondência simultânea dos índices de massa e retenção.
- Calcular a concentração de cada componente volátil na amostra SAFE em relação ao padrão interno utilizando a área do pico TIC (cromatografia total de iões).
- Repita a análise três vezes, a partir da preparação da infusão de chá.
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Representative Results
O procedimento analítico descrito acima é ilustrado nesta seção usando o exemplo da análise de aroma de amostras de chá preto e chá verde.
Um cromatograma GC-MS representativo é mostrado na Figura 3. A Figura 3A mostra um conjunto de n-alcanos e a Figura 3B mostra o perfil de um padrão interno. Os resultados da avaliação dos extratos das amostras de chá verde e chá preto são apresentados na Figura 3C e Figura 3D, respectivamente. Analisando os padrões internos, pode-se detectar um pico definitivo com uma linha de base estável (Figura 3B). O cromatograma GC mostra os perfis completos de GC obtidos dos extratos de infusão de chá verde e chá preto após a contagem total de íons.
Um total de 104 compostos aromáticos foi identificado nas amostras de chá verde e chá preto por acoplamento por espectrometria de massas combinada com o índice de retenção. A quantificação relativa foi calculada pela área do pico do composto em relação ao padrão interno. O mapa de calor, elaborado de acordo com os resultados qualitativos e quantitativos, mostra os teores de compostos aromáticos em relação ao padrão interno para as amostras de chá verde e chá preto (Figura 4).
Figura 1: Diagrama esquemático do sistema SAFE. (1) O frasco de amostra para a coleta da amostra. (2) A válvula de vácuo; O sistema deve ser mantido fechado antes da adição de amostras e o fluxo de gota da amostra deve ser ajustado adequadamente. (3) O frasco de destilação para a destilação da amostra. (4) O frasco de recolha para a recolha da amostra destilada. (5) A armadilha fria para a recuperação de amostras não recolhidas pelo frasco de recolha e para impedir a entrada do solvente na bomba de vácuo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama esquemático do sistema GC-MSD. O sistema GC/MS é equipado com (1) uma porta de injeção multimodo, (2) um módulo de controle de fluxo (PCM) que controla o fluxo portador de hélio, (3) uma coluna capilar de 60 m x 0,25 m x 0,25 m 5 ms e (4) um forno de coluna GC. Os extratos de chá na amostra injetada são separados na coluna GC, através da qual o gás transportador flui e a temperatura do forno aumenta. Os componentes são ionizados por uma fonte de íons EI e, em seguida, analisados em um analisador de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cromatograma de íons totais típico de uma análise bem-sucedida de CG-EM . (A) O cromatograma dos n-alcanos. Todos os picos de n-alcano são atribuídos ao número de carbono correspondente. (B) O cromatograma do padrão interno (paraxileno-d10). (C) Perfil aromático representativo da infusão de chá verde. (D) Perfil aromático representativo da infusão de chá preto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mapa térmico de 104 compostos aromáticos identificados nas amostras de chá preto (BT) e chá verde (GT). O número ao lado da nota de cor no lado direito do mapa de calor indica o conteúdo do composto (em relação ao padrão interno). A profundidade de cor indica o nível de conteúdo de matéria; quanto mais profunda a cor, maior o conteúdo relativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve um método eficiente para análise de compostos voláteis em infusões de chá usando análise SAFE e GC-MS.
As infusões de chá têm uma matriz complexa com um alto teor de componentes não voláteis. Vários métodos têm sido descritos na literatura para o isolamento dos componentes voláteis das infusões de chá. Um método comum é a extração por destilação simultânea (SDE)15,16. No entanto, não é adequado para a análise de aromas de chá, pois as folhas de chá devem ser fervidas com água durante todo o processo de destilação/extração, o que resulta em uma reação química dos componentes do chá e, assim, produz um perfil de odor muito diferente da amostra original17. SAFE destila a infusão de chá a baixa temperatura sob alto vácuo, minimizando assim as alterações nos analitos e permitindo que a composição original do aroma seja preservada.
A microextração em fase sólida (EMSP) é outro método comumente utilizado para a análise do aroma do chá18,19. Suas vantagens estão no procedimento simples e isento de solventes. Entretanto, a seletividade da adsorção de fibras dos componentes do aroma dificulta a obtenção de um perfil quantitativo que reflita as características aromáticas da amostra, o que limita a aplicação desse método para análise do aroma do chá20.
A técnica de transferência de alto vácuo (HVT) foi desenvolvida para reduzir a chance de formação de artefatos nas análises de aromas21. No entanto, o HVT tem um baixo rendimento de extração para substâncias com altos pontos de ebulição e forte polaridade, o que limita seu escopo de uso.
Ao contrário dos métodos personalizados acima, o destilado SAFE de uma infusão de chá é livre de quaisquer componentes não voláteis22,23,24. O aroma no destilado pode ser extraído quantitativamente usando solventes orgânicos, o que significa que um extrato com um perfil de odor próximo à amostra original pode ser obtido. Engel et al.11 destilaram misturas de n-alcanos usando HVT ou destilação SAFE para verificar a eficiência. Os rendimentos de destilados usando o sistema SAFE foram significativamente maiores do que os de HVT para cada alcano. Além disso, alcanos com pontos de ebulição abaixo de 285 °C podem ser completamente recuperados pelo SAFE.
É necessário prestar muita atenção aos detalhes experimentais para futuras análises bem sucedidas. (1) A pressão de vácuo durante a destilação SAFE pode afectar a recuperação dos componentes voláteis e deve ser mantida a um nível elevado, por exemplo, retardando a adição da amostra. (2) É necessário assegurar que o frasco de recolha seja imerso em azoto líquido antes de o sistema regressar à pressão atmosférica, a fim de evitar que os voláteis de solvente sejam condensados pela armadilha fria superior direita ou entrem na bomba de vácuo. (3) Deve-se garantir que a água circulante seja ligada primeiro e desligada por último. A água circulante só deve ser desligada após a remoção do nitrogênio líquido; caso contrário, ele congelará o dispositivo. (4) O banho-maria deve ser agitado com um ímã para auxiliar a transferência de calor.
Neste estudo, a destilação SAFE foi realizada antes da extração com solvente. Um procedimento reverso também é viável, e isso seria especialmente vantajoso se um grande volume de infusão de chá fosse extraído primeiro e o extrato obtido fosse então destilado por SAFE. O desafio da extração por infusão usando um solvente orgânico é a possível formação de uma emulsão. Nesse caso, etapas adicionais são necessárias para recuperar a camada orgânica, como centrifugação ou escolha de diferentes solventes. Após o experimento, o conjunto de vidro SAFE deve ser limpo. Etanol ou acetona podem ser usados como solvente de limpeza. As peças devem ser secas antes do uso.
Em resumo, este protocolo propõe um método para obter um concentrado de aroma com um perfil de odor próximo à amostra original de chá usando destilação SAFE seguida de extração com solvente. Este método pode ser aplicado a todos os tipos de amostras de chá, incluindo, por exemplo, pós de chá instantâneo e concentrados de chá, e é adequado para estudos sensoriais moleculares de chá.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32002094, 32102444), pelo Sistema de Pesquisa Agrícola da China de MOF e MARA (CARS-19) e pelo Projeto de Inovação para a Academia Chinesa de Ciências Agrárias (CAAS-ASTIP-TRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkane mix (C10-C25) | ANPEL | CDAA-M-690035 | |
| Alkane mix (C5-C10) | ANPEL | CDAA-M-690037 | |
| AMDIS | National Institute of Standards and Technology | version 2.72 | Gaithersburg, MD |
| Analytical balance | OHAUS | EX125DH | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Anhydrous sodium sulfate | aladdin | ||
| Black tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| Concentrator | Biotage | TurboVap | |
| Data processor | Agilent | MassHunter | |
| Dichloromethane | TEDIA | ||
| GC | Agilent | 7890B | |
| GC column | Agilent | DB-5MS | |
| Green tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| MS | Agilent | 5977B | |
| p-Xylene-d10 | Sigma-Aldrich | ||
| SAFE | Glasbläserei Bahr | ||
| Ultra-pure deionized water | Milipore | Milli-Q | |
| Vacuum pump | Edwards | T-Station 85H |
References
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