Summary
Här presenteras en metod för att berika och analysera de flyktiga komponenterna i teextrakt med hjälp av lösningsmedelsassisterad smakindunstning och lösningsmedelsextraktion följt av gaskromatografi-masspektrometri, som kan appliceras på alla typer av teprover.
Abstract
Te arom är en viktig faktor i tekvalitet, men det är utmanande att analysera på grund av komplexiteten, låg koncentration, mångfald och labilitet av de flyktiga komponenterna i teextrakt. Denna studie presenterar en metod för att erhålla och analysera de flyktiga komponenterna i teextrakt med luktkonservering med användning av lösningsmedelsassisterad smakindunstning (SAFE) och lösningsmedelsextraktion följt av gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS). SAFE är en högvakuumdestillationsteknik som kan isolera flyktiga föreningar från komplexa livsmedelsmatriser utan någon icke-flyktig interferens. En komplett steg-för-steg-procedur för analys av tearom presenteras i denna artikel, inklusive teinfusionsberedning, lösningsmedelsextraktion, SAFE-destillation, extraktkoncentration och analys av GC-MS. Denna procedur tillämpades på två teprover (grönt te och svart te), och kvalitativa såväl som kvantitativa resultat på den flyktiga sammansättningen av teproverna erhölls. Denna metod kan inte bara användas för aromanalys av olika typer av teprover utan också för molekylära sensoriska studier på dem.
Introduction
Te är en föredragen dryck för många människor över hela världen 1,2. Teets doft är ett kvalitetskriterium samt en prisbestämmande faktor för teblad 3,4. Således är analysen av aromkompositionen och innehållet i te av stor betydelse för molekylära sensoriska studier och kvalitetskontroll av te. Som ett resultat har analys av aromkomposition varit ett viktigt ämne i teforskning de senaste åren 5,6,7.
Innehållet av aromkomponenter i te är mycket lågt, eftersom de i allmänhet bara står för 0,01% -0,05% av tebladens torrvikt8. Dessutom stör den stora mängden icke-flyktiga komponenter i provmatrisen signifikant analysen med gaskromatografi 9,10. Därför är ett provberedningsförfarande viktigt för att isolera de flyktiga föreningarna i te. Det viktigaste övervägandet för isolerings- och anrikningsmetoden är att minimera matrisinterferensen och samtidigt maximera bevarandet av provets ursprungliga luktprofil.
Lösningsmedelsassisterad smakindunstning (SAFE), ursprungligen utvecklad av Engel, Bahr och Schieberle, är en förbättrad högvakuumdestillationsteknik som används för att isolera flyktiga föreningar från komplexa livsmedelsmatriser11,12. En kompakt glasenhet ansluten till en högvakuumpump (under ett typiskt arbetstryck på 5 x 10-3 Pa) kan effektivt samla flyktiga föreningar från lösningsmedelsextrakt, oljiga livsmedel och vattenprover.
Denna artikel beskrev en metod som kombinerar SAFE-tekniken med lösningsmedelsextraktion för att isolera flyktiga ämnen från en svart teinfusion, följt av analys med GC-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av den interna standarden och teinfusion
- Stamlösning: Lös 10,0 mg paraxylen-d10 (se materialtabell) i 10,0 ml vattenfri etanol för att bereda en 1 000 ppm stamlösning av intern standard.
- Arbetslösning: Späd 1 ml stamlösning (steg 1.1) till 100 ml med rent vatten för att förbereda en 10 ppm arbetslösning av den interna standarden.
OBS: Arbetslösningen måste beredas samma dag som analysen. - Placera 3 g teblad (både för grönt te och svart te, se Materialtabell) i en Erlenmeyerkolv och tillsätt 150 ml kokande vatten. Täck kolven med en glaspropp.
- Efter 5 minuter, filtrera snabbt bort teinfusionen genom en sikt med 300 maskor.
- Tvätta de förbrukade tebladen två gånger med 30 ml vatten och kombinera tvättlösningen med teinfusionen.
- Kyl teinfusionen till rumstemperatur snabbt i ett isvattenbad.
- Tillsätt 1,00 ml arbetslösning (steg 1.2) i teinfusionen och blanda dem väl.
2. Destillation av teinfusionen genom SAFE och vätske-vätskeextraktion av destillatet
- Förbered SAFE-enheten genom att följa stegen nedan.
- Installera SAFE-enheten (figur 1) och anslut destillationsflaskan längst ned till vänster (figur 1[3]) och uppsamlingsflaskan längst ned till höger (figur 1[4]). Anslut det cirkulerande vattenröret på baksidan av SAFE-glasenheten. Installera kylfällan (figur 1[5]) och anslut röret till vakuumpumpen (se materialförteckning) längst upp till höger på glasenheten.
OBS: Kontrollera anslutningen av cirkulationsvattenröret; Se till att inloppet kommer in i toppen och utloppet går ut från botten. Använd avjoniserat vatten för cirkulationen för att förhindra att vågen blockerar det vita röret i SAFE-enheten, vilket skulle resultera i dålig cirkulation av det cirkulerande vattnet och eventuell explosion av SAFE-enheten. Destillationsbotten (figur 1[3]) kan röras om med en omrörningsstång för att underlätta avdunstningen av provet. - Ställ in temperaturen på cirkulerande vatten på 50 °C och på vattenbadet för kolven på 40 °C. Stäng vakuumventilen (figur 1[2]).
- Installera SAFE-enheten (figur 1) och anslut destillationsflaskan längst ned till vänster (figur 1[3]) och uppsamlingsflaskan längst ned till höger (figur 1[4]). Anslut det cirkulerande vattenröret på baksidan av SAFE-glasenheten. Installera kylfällan (figur 1[5]) och anslut röret till vakuumpumpen (se materialförteckning) längst upp till höger på glasenheten.
- Utför vakuumpumpens drift.
- Slå på vakuumpumpen.
- Öka hastigheten gradvis till maxhastigheten på 100%.
OBS: Om hastigheten inte når 100%, kontrollera om systemet är lufttätt och om det finns lösningsmedelsrester inuti systemet. - Efter att ha nått ett högt vakuum (helst 10-3 Pa)
OBS: Vakuumet förbättras när det flytande kvävet tillsätts till kylfällan.
- Utför provdestillation.
- Starta vattencirkulationen.
- Tillsätt flytande kväve i kylfällan för att täcka utsidan av uppsamlingsflaskan.
- Häll teinfusionen i provtratten längst upp till vänster (figur 1[1]) och täck den sedan med en glaspropp.
- För provet droppvis in i destillationskolven. Kontrollera provets fallhastighet så att vakuumet hålls i rätt intervall på cirka 10-3 Pa.
OBS: Tillsätt flytande kväve under processen för att säkerställa att rätt uppsamlingsflaska alltid är nedsänkt i flytande kväve. Försök att undvika kondensatbildning i kallfällan.
- Stäng av vakuumpumpen när destillationen är klar.
- Tryck på strömbrytaren . När "STOP" blinkar trycker du på Enter-tangenten för att bekräfta.
- Koppla ur nätsladden när molekylpumpens hastighet minskar till "0".
OBS: Starta endast om när hastigheten minskar till "0".
- Återställ systemet till atmosfärstryck.
- Ta bort slippluggen ovanför provtagningsflaskan.
- Skruva loss vakuumventilens ratt långsamt för att återställa systemet till atmosfärstryck.
- Ta ner uppsamlingsflaskan med provet.
- Ta bort det flytande kvävet utanför uppsamlingsflaskan efter att systemet har återställts till atmosfärstryck.
- Skruva loss uppsamlingsflaskan långsamt. Ta försiktigt ner uppsamlingsflaskan med provet.
- Stäng det cirkulerande vattnet.
- Utför vätske-vätskeextraktion av SAFE-destillatet.
- Låt SAFE-destillatet i flaskan värmas till rumstemperatur.
- Extrahera SAFE-destillatet tre gånger med 50 ml diklormetan (se materialförteckning).
- Kombinera diklormetanskikten. Torka extraktet med vattenfritt natriumsulfat (se materialtabellen).
OBS: Det vattenfria natriumsulfatet i lösningsmedlet anses vara tillräckligt torrt när det inte längre är cementerat och kan flöda fritt. - Koncentrera extraktet till ca 2 ml med en mild kväveström.
- Överför till en provflaska med en diameter på 1–2 ml och koncentrera den ytterligare till 200 μl med en mild kväveström.
3. GC-MS-analys och databehandling
- Analysera aromkoncentraten som beretts i protokollavsnitt 2 med hjälp av ett GC-MS-system (figur 2) utrustat med smälta kiseldioxidkapillärkolonner (se materialtabellen).
- Använd helium som bärgas med en linjär hastighet på 40 cm/s.
- Injicera 3 μl koncentrat i spaltfritt injektionsläge.
- Ställ in GC-ugnstemperaturprogrammet: (1) håll vid 40 ° C i 5 minuter; (2) öka till 200 °C vid 5 °C/min, 3) öka till 280 °C vid 10 °C/min, (4) Håll den vid 280 °C i 10 minuter.
- Använd den massselektiva detektorn i positivt EI-läge13 med ett massskanningsområde från 30 m/z till 350 m/z vid 70 eV.
- Dekonvoluera GC-MS-data med hjälp av AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System), se materialtabellen.
- Matcha och kvalificera data efter dekonvolution med hjälp av NIST (National Institute of Standards and Technology) 17 masspektrometersökprogram3.
- Beräkna retentionsindex för föreningarna14 baserat på resultatet av en uppsättning n-alkaner (C5-C25, se materialtabellen) under samma GC-förhållanden.
- Identifiera GC-topparna med hjälp av NIST-masspektrometribiblioteket och retentionsindexdatabasen baserat på samtidig matchning av mass- och retentionsindex.
- Beräkna koncentrationen av varje flyktig komponent i SAFE-provet i förhållande till den interna standarden med hjälp av TIC (total jonkromatografi) topparea.
- Upprepa analysen tre gånger, med utgångspunkt från teinfusionsberedningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det analysförfarande som beskrivs ovan illustreras i detta avsnitt med hjälp av exemplet med aromanalys av prover av svart te och grönt te.
Ett representativt GC-MS-kromatogram visas i figur 3. Figur 3A visar en uppsättning n-alkaner och figur 3B visar profilen för en intern standard. Utvärderingsresultaten för extrakten från proverna grönt te och svart te visas i figur 3C respektive figur 3D. Genom att analysera de interna standarderna kan en definitiv topp med en stabil baslinje detekteras (figur 3B). GC-kromatogrammet visar de fullständiga GC-profilerna erhållna från extrakten av grönt te och svart te infusion efter den totala jonräkningen.
Totalt identifierades 104 aromföreningar i grönt te och svart te prover genom masspektrometri matchning i kombination med retentionsindex. Den relativa kvantifieringen beräknades av föreningens topparea i förhållande till den interna standarden. Värmekartan, ritad enligt de kvalitativa och kvantitativa resultaten, visar aromföreningens innehåll i förhållande till den interna standarden för proverna av grönt te och svart te (figur 4).
Figur 1: Schematiskt diagram över SAFE-systemet. (1) Provflaskan för provsamlingen. (2) Vakuumventilen; Systemet måste hållas stängt innan prover läggs till, och provets droppflöde bör justeras på lämpligt sätt. (3) Destillationsflaskan för provdestillationen. (4) Uppsamlingsflaskan för uppsamling av det destillerade provet. (5) Kylfällan för återvinning av prover som inte samlats in av uppsamlingsflaskan och för att förhindra att lösningsmedlet kommer in i vakuumpumpen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematiskt diagram över GC-MSD-systemet. GC/MS-systemet är utrustat med (1) en insprutningsport med flera lägen, (2) en flödeskontrollmodul (PCM) som styr heliumbärarflödet, (3) en 60 m x 0,25 m x 0,25 m 5 ms kapillärkolonn och (4) en GC-kolonnugn. Teextrakten i det injicerade provet separeras i GC-kolonnen, genom vilken bärgasen strömmar och ugnstemperaturen ökar. Komponenterna joniseras av en EI-jonkälla och analyseras sedan i en massanalysator. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Typiskt totalt jonkromatogram från en lyckad GC-MS-analys . a) Kromatogrammet för n-alkanerna. Alla n-alkantoppar tilldelas motsvarande kolnummer. B) Kromatogrammet för intern standard (paraxylen-d10). c) Representativ aromprofil för infusionen av grönt te. d) Representativ aromprofil för infusionen av svart te. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Värmekarta över 104 aromföreningar identifierade i proverna svart te (BT) och grönt te (GT). Siffran bredvid färgnoten till höger om värmekartan anger innehållet i föreningen (i förhållande till den interna standarden). Färgdjupet anger nivån på materieinnehållet; Ju djupare färg, desto högre relativ halt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel beskriver en effektiv metod för att analysera flyktiga föreningar i teinfusioner med hjälp av SAFE- och GC-MS-analys.
Teinfusioner har en komplex matris med högt innehåll av icke-flyktiga komponenter. Flera metoder har beskrivits i litteraturen för att isolera de flyktiga komponenterna från teinfusioner. En vanlig metod är samtidig destillationsextraktion (SDE)15,16. Det är dock inte lämpligt för analys av tearomer eftersom tebladen måste kokas med vatten under hela destillations-/extraktionsprocessen, vilket resulterar i att tekomponenterna genomgår en kemisk reaktion och därmed ger en luktprofil som skiljer sig mycket från det ursprungliga provet17. SAFE destillerar teinfusionen vid låg temperatur under högt vakuum, vilket minimerar förändringar i analyterna och gör att den ursprungliga aromkompositionen kan bevaras.
Solid-phase microextraction (SPME) är en annan metod som vanligtvis används för aromanalys av te18,19. Dess fördelar ligger i det enkla och lösningsmedelsfria förfarandet. Selektiviteten hos fiberadsorptionen av aromkomponenterna gör det emellertid svårt att erhålla en kvantitativ profil som återspeglar provets aromegenskaper, vilket begränsar tillämpningen av denna metod för tearomanalys20.
Högvakuumöverföringstekniken (HVT) utvecklades för att minska risken för att artefakter bildas i aromanalyser21. HVT har dock ett lågt extraktionsutbyte för ämnen med höga kokpunkter och stark polaritet, vilket begränsar dess användningsområde.
Till skillnad från ovanstående anpassade metoder är SAFE-destillatet av en teinfusion fri från icke-flyktiga komponenter22,23,24. Aromen i destillatet kan extraheras kvantitativt med hjälp av organiska lösningsmedel, vilket innebär att ett extrakt med en luktprofil nära det ursprungliga provet kan erhållas. Engel et al.11 destillerade blandningar av n-alkaner med HVT- eller SAFE-destillation för att kontrollera effektiviteten. Destillatutbytet med SAFE-systemet visade sig vara betydligt högre än för HVT för varje alkan. Dessutom kan alkaner med kokpunkter under 285 °C återvinnas helt av SAFE.
Noggrann uppmärksamhet måste ägnas åt de experimentella detaljerna för ytterligare framgångsrika analyser. (1) Vakuumtrycket under SAFE-destillationen kan påverka återvinningen av de flyktiga komponenterna och måste hållas på en hög nivå, t.ex. genom att provtillsatsen saktar ner. (2) Det är nödvändigt att se till att uppsamlingsflaskan är nedsänkt i flytande kväve innan systemet återgår till atmosfärstryck för att undvika att lösningsmedelsflyktiga ämnen kondenseras av den övre högra kylfällan eller kommer in i vakuumpumpen. (3) Man bör se till att det cirkulerande vattnet slås på först och stängs av sist. Det cirkulerande vattnet bör endast stängas av efter att det flytande kvävet har avlägsnats. Annars fryser den enheten. (4) Vattenbadet bör omröras med en magnet för att underlätta värmeöverföringen.
I denna studie utfördes SAFE-destillation före extraktionen med lösningsmedlet. Ett omvänt förfarande är också genomförbart, och detta skulle vara särskilt fördelaktigt om en stor volym teinfusion extraheras först och det erhållna extraktet destilleras sedan av SAFE. Utmaningen med infusionsextraktion med användning av ett organiskt lösningsmedel är den möjliga bildningen av en emulsion. I detta fall behövs ytterligare steg för att återvinna det organiska skiktet, såsom centrifugering eller val av olika lösningsmedel. Efter experimentet måste SAFE-glasenheten rengöras. Etanol eller aceton kan användas som rengöringslösningsmedel. Delarna ska torkas före användning.
Sammanfattningsvis föreslår detta protokoll en metod för att erhålla ett aromkoncentrat med en luktprofil nära det ursprungliga teprovet med SAFE-destillation följt av lösningsmedelsextraktion. Denna metod kan tillämpas på alla typer av teprover, inklusive till exempel snabbtepulver och tekoncentrat, och är väl lämpad för molekylära sensoriska studier av te.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Natural Science Foundation of China (32002094, 32102444), China Agriculture Research System of MOF och MARA (CARS-19) och Innovation Project for Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-ASTIP-TRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkane mix (C10-C25) | ANPEL | CDAA-M-690035 | |
| Alkane mix (C5-C10) | ANPEL | CDAA-M-690037 | |
| AMDIS | National Institute of Standards and Technology | version 2.72 | Gaithersburg, MD |
| Analytical balance | OHAUS | EX125DH | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm | ||
| Anhydrous sodium sulfate | aladdin | ||
| Black tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| Concentrator | Biotage | TurboVap | |
| Data processor | Agilent | MassHunter | |
| Dichloromethane | TEDIA | ||
| GC | Agilent | 7890B | |
| GC column | Agilent | DB-5MS | |
| Green tea | Qianhe Tea | Huangshan, Anhui province, China | |
| MS | Agilent | 5977B | |
| p-Xylene-d10 | Sigma-Aldrich | ||
| SAFE | Glasbläserei Bahr | ||
| Ultra-pure deionized water | Milipore | Milli-Q | |
| Vacuum pump | Edwards | T-Station 85H |
References
- Liang, S., et al. Processing technologies for manufacturing tea beverages: From traditional to advanced hybrid processes. Trends in Food Science & Technology. 118, 431-446 (2021).
- Guo, X. Y., Ho, C. T., Schwab, W., Wan, X. C. Aroma profiles of green tea made with fresh tea leaves plucked in summer). Food Chemistry. 363, 130328 (2021).
- Feng, Z. H., Li, M., Li, Y. F., Wan, X. C., Yang, X. G. Characterization of the orchid-like aroma contributors in selected premium tea leaves. Food Research International. 129, 108841 (2020).
- Hong, X., et al. Characterization of the key aroma compounds in different aroma types of Chinese yellow tea. Foods. 12 (1), 27 (2023).
- Flaig, M., Qi, S. C., Wei, G., Yang, X., Schieberle, P. Characterisation of the key aroma compounds in aLongjinggreen tea infusion (Camellia sinensis) by the sensomics approach and their quantitative changes during processing of the tea leaves. European Food Research and Technology. 246 (12), 2411-2425 (2020).
- Feng, Z., et al. Tea aroma formation from six model manufacturing processes. Food Chemistry. 285, 347-354 (2019).
- Wang, J. -Q., et al. Effects of baking treatment on the sensory quality and physicochemical properties of green tea with different processing methods. Food Chemistry. 380, 132217 (2022).
- Zhai, X., Zhang, L., Granvogl, M., Ho, C. -T., Wan, X. Flavor of tea (Camellia sinensis): A review on odorants and analytical techniques. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 21 (5), 3867-3909 (2022).
- Chaturvedula, V. S. P., Prakash, I. The aroma, taste, color and bioactive constituents of tea. Journal of Medicinal Plants Research. 5 (11), 2110-2124 (2011).
- Ridgway, K., Lalljie, S. P. D., Smith, R. M. Sample preparation techniques for the determination of trace residues and contaminants in foods. Journal of Chromatography A. 1153 (1-2), 36-53 (2007).
- Engel, W., Bahr, W., Schieberle, P. Solvent assisted flavour evaporation - A new and versatile technique for the careful and direct isolation of aroma compounds from complex food matrices. European Food Research and Technology. 209 (3-4), 237-241 (1999).
- Wang, B., et al. Characterization of aroma compounds of Pu-erh ripen tea using solvent assisted flavor evaporation coupled with gas chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-olfactometry. Food Science and Human Wellness. 11 (3), 618-626 (2022).
- Zou, C., et al. Zijuan tea- based kombucha: Physicochemical, sensorial, and antioxidant profile. Food Chemistry. 363, 130322 (2021).
- Vandendool, H., Kratz, P. D. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. Journal of Chromatography. 11, 463-471 (1963).
- Khvalbota, L., Virba, M., Furdikova, K., Spanik, I. Simultaneous distillation-solvent extraction gas chromatography-mass spectrometry analysis of Tokaj Muscat Yellow wines. Separation Science Plus. 5 (8), 393-406 (2022).
- Ayalew, Y., et al. Volatile organic compounds of anchote tuber and leaf extracted using simultaneous steam distillation and solvent extraction. International Journal of Food Science. 2022, 3265488 (2022).
- Zhu, M., Li, E., He, H. Determination of volatile chemical constitutes in tea by simultaneous distillation extraction, vacuum hydrodistillation and thermal desorption. Chromatographia. 68 (7-8), 603-610 (2008).
- Lau, H., et al. Characterising volatiles in tea (Camellia sinensis). Part I: Comparison of headspace-solid phase microextraction and solvent assisted flavour evaporation. Lwt-Food Science and Technology. 94, 178-189 (2018).
- Li, Z. W., Wang, J. H. Analysis of volatile aroma compounds from five types of Fenghuang Dancong tea using headspace-solid phase microextraction combined with GC-MS and GC-olfactometry. International Food Research Journal. 28 (3), 612-626 (2021).
- Dong, F., et al. Herbivore-induced volatiles from tea (Camellia sinensis) plants and their involvement in intraplant communication and changes in endogenous nonvolatile metabolites. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (24), 13131-13135 (2011).
- Acena, L., Vera, L., Guasch, J., Busto, O., Mestres, M. Comparative study of two extraction techniques to obtain representative aroma extracts for being analysed by gas chromatography-olfactometry: Application to roasted pistachio aroma. Journal of Chromatography A. 1217 (49), 7781-7787 (2010).
- Kumazawa, K., Wada, Y., Masuda, H. Characterization of epoxydecenal isomers as potent odorants in black tea (Dimbula) infusion. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (13), 4795-4801 (2006).
- Wu, H. T., et al. Effects of three different withering treatments on the aroma of white tea. Foods. 11 (16), 2502 (2022).
- Wang, J., et al. Decoding the specific roasty aroma Wuyi rock tea (Camellia sinensis: Dahongpao) by the sensomics approach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (34), 10571-10583 (2022).
