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Biology

Expression de transgènes dans des cellules en culture à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés recombinants non purifiés

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65572

Summary

Le virus adéno-associé recombinant (rAAV) est largement utilisé pour l’administration de gènes cliniques et précliniques. Une utilisation sous-estimée des rAAV est la transduction robuste des cellules en culture sans avoir besoin de purification. Pour les chercheurs qui découvrent le rAAV, nous fournissons un protocole pour le clonage de cassettes transgéniques, la production de vecteurs bruts et la transduction de cultures cellulaires.

Abstract

Les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) peuvent obtenir une expression transgénique puissante et durable sans intégration dans un large éventail de types de tissus, ce qui en fait un choix populaire pour l’administration de gènes dans des modèles animaux et dans des contextes cliniques. En plus des applications thérapeutiques, les rAAV sont un outil de laboratoire utile pour fournir des transgènes adaptés aux besoins expérimentaux et aux objectifs scientifiques du chercheur dans des cellules en culture. Parmi les exemples, citons les gènes rapporteurs exogènes, les cassettes de surexpression, l’interférence de l’ARN et les outils basés sur CRISPR, y compris ceux pour les criblages à l’échelle du génome. Les transductions de rAAV sont moins nocives pour les cellules que l’électroporation ou la transfection chimique et ne nécessitent pas d’équipement spécial ou de réactifs coûteux pour être produites. Des lysats bruts ou des milieux conditionnés contenant des rAAV peuvent être ajoutés directement aux cellules en culture sans purification supplémentaire pour transduire de nombreux types de cellules, une caractéristique sous-estimée des rAAV. Ici, nous fournissons des protocoles pour le clonage de base de cassettes de transgènes et démontrons comment produire et appliquer des préparations brutes de rAAV sur des cellules en culture. Comme preuve de principe, nous démontrons la transduction de trois types de cellules qui n’ont pas encore été rapportés dans les applications de rAAV : les cellules placentaires, les myoblastes et les organoïdes de l’intestin grêle. Nous discutons des utilisations appropriées des préparations brutes de rAAV, des limites des rAAV pour l’administration des gènes et des considérations relatives au choix de la capside. Ce protocole décrit une méthode simple, peu coûteuse et efficace permettant aux chercheurs d’obtenir une livraison productive d’ADN en culture cellulaire à l’aide de rAAV sans avoir besoin d’étapes laborieuses de titrage et de purification.

Introduction

L’élucidation des bases moléculaires des fonctions cellulaires nécessite souvent l’expression d’ADN transgénique en culture cellulaire. Pour être exprimés, les transgènes doivent pénétrer à travers la membrane sélective d’une cellule et atteindre le noyau 1,2. Par conséquent, la capacité de contourner efficacement les barrières physiques de la cellule et de manipuler ses processus centraux est une nécessité pour appliquer la transgénèse à la découverte de nouveaux phénomènes biologiques. L’une d’entre elles s’appuie sur la capacité intrinsèque des virus à délivrer et à exprimer de l’ADN étranger 3,4.

Le virus adéno-associé (AAV) est l’un des plus petits virus de mammifères : son génome d’ADN simple brin de 4,7 kilobases (kb) contient deux gènes, rep (pour réplicase) et cap (pour capside), emballés à l’intérieur d’une capside icosaédrique de 60 mères mesurant 25 nm. Les gènes rep/cap ont de multiples promoteurs, cadres de lecture et produits d’épissage qui codent pour au moins neuf protéines uniques nécessaires à la réplication, à la production et à l’emballage du virus 5,6. De plus, les deux extrémités du génome contiennent des structures secondaires appelées répétitions terminales inversées (ITR) qui sont nécessaires à la réplication de l’ADN, à l’empaquetage du génome et au traitement en aval lors de la transduction 7,8,9,10. Les ITR sont les seuls éléments d’ADN nécessaires à l’empaquetage du génome dans la capside, et par conséquent, l’AAV peut être cloné à des fins d’administration de transgènes en remplaçant les gènes rep/cap viraux par le choix d’un chercheur d’éléments régulateurs et/ou de gènes d’intérêt6. L’AAV recombinant (rAAV) qui en résulte, avec un génome vectoriel modifié (VG), est largement utilisé en clinique pour la thérapie génique humaine et a accumulé des succès11. Une utilisation sous-estimée du vecteur est en laboratoire ; Les rAAV peuvent atteindre efficacement l’expression de transgènes dans des cellules en culture pour répondre aux besoins expérimentaux d’un chercheur12.

La méthode la plus courante pour produire du rAAV est la transfection de trois plasmides dans des cellules HEK293 ou 293T (Figure 1). Le premier plasmide, communément appelé plasmide cis, contient le transgène souhaité flanqué d’ITR (pAAV). Selon l’application, des plasmides cis avec des éléments communs, tels que des promoteurs puissants ou des outils basés sur CRISPR, sont disponibles à l’achat. Le second est le plasmide pRep/Cap qui contient les gènes AAV rep et cap de type sauvage fournis en trans – c’est-à-dire sur un plasmide séparé non ITR qui exprime des éléments régulateurs et structurels qui interagissent ensuite avec le plasmide cis – et est donc appelé plasmide trans. En plus d’enfermer physiquement la VG, la capside influence le tropisme cellulaire12,13. En fournissant le gène de la coiffe spécifique au sérotype in-trans, les chercheurs sont facilement en mesure de maximiser l’efficacité de la transduction en choisissant un sérotype de capside optimisé pour leur cellule cible donnée. Enfin, en tant que Dependoparvovirus, l’AAV a besoin d’un virus auxiliaire pour activer l’expression rep/cap de ses promoteurs viraux, obtenue par des gènes auxiliaires adénoviraux, fournis sur un troisième plasmide tel que pAdΔF614,15. Après 72 h de transfection de trois plasmides, le vecteur peut être libéré des cellules productrices dans le milieu de culture par des cycles répétés de congélation/décongélation. L’ensemble du contenu de la plaque est ensuite collecté et les gros débris cellulaires sont éliminés par centrifugation ; le surnageant de média qui en résulte est une préparation brute de rAAV prête pour les transductions en aval.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble de la production de vecteurs rAAV bruts. La production et la transduction de rAAV brut peuvent être accomplies en 5 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le rAAV peut être plus favorable à l’administration de transgènes par rapport à d’autres méthodes de transfection, qui sont généralement associées à une toxicité cellulaire, à une faible efficacité et à des réactifs et équipements coûteux, tels que l’électroporation ou la transfection à base de produits chimiques/lipidiques16,17. Le rAAV contourne ces obstacles et fournit souvent une puissante expression de transgène avec une toxicité minimale et un temps de manipulation minimal. Il est important de noter que la production de rAAV et son application en culture cellulaire sont simples et nécessitent rarement la purification du vecteur à partir du milieu de culture (Figure 1). De plus, le rAAV n’intègre pas son VG dans le génome de l’hôte, contrairement à l’administration du transgène lentiviral, et réduit ainsi le risque de mutagénèse insertionnelle18. Malgré les avantages potentiels de l’utilisation du rAAV pour l’administration de transgènes, des limites doivent être prises en compte. Il est important de noter que la taille du transgène, y compris les ITR, ne doit pas dépasser 4,9 kb en raison des contraintes physiques de la capside, ce qui limite la capacité d’un chercheur à fournir efficacement de grands éléments régulateurs et transgènes. De plus, étant donné que le rAAV est un virus non intégrateur, la transduction entraîne l’expression transitoire du transgène dans les cellules en division et peut ne pas être pratique pour une expression stable. Cependant, des méthodes utilisant deux modèles Cas9 délivrés par rAAV et des modèles de réparation dirigée par homologie (HDR) peuvent être utilisées pour insérer de manière stable des séquences à des loci génomiques spécifiques si un chercheur le souhaite19.

Protocol

1. Acquisition de plasmides

NOTE : Ce protocole permet de cloner un gène d’intérêt (GOI) dans un plasmide contenant de l’ITR avec un promoteur de cytomégalovirus (CMV) et une séquence de polyadénylation SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Cependant, ce plasmide peut être utilisé sans clonage supplémentaire pour produire des rAAV, ce qui permet d’obtenir un double rapporteur pratique d’EGFP et de luciférase. Les plasmides avec différents éléments régulateurs ou pour différentes applications, comme pour les expériences basées sur CRISPR, sont disponibles en ligne et suivront des étapes de clonage similaires à celles ci-dessous (voir la discussion pour les étapes de clonage supplémentaires). De plus, il est possible d’utiliser des plasmides rep/cap, ou trans, pour différents sérotypes – ce protocole utilisera rep/cap pour le sérotype 2 de l’AAV.

  1. Achetez des stabs bactériens contenant un plasmide cis contenant de l’ITR, un plasmide auxiliaire d’adénovirus, un plasmide rep/cap et un plasmide contenant un GOI. Étalez les bactéries sur des plaques de gélose individuelles contenant des antibiotiques spécifiques à la résistance de chaque plasmide. Incubez les bactéries à 30 °C pendant la nuit pour qu’elles se développent.
    REMARQUE : Si un plasmide avec un GOI n’est pas facilement disponible à l’achat, un fragment d’ADN synthétique (voir le tableau des matériaux) peut être acheté en ligne. De plus, un fragment d’ADN synthétique peut être utilisé pour sauter l’ensemble du processus de PCR si vous le souhaitez.
  2. Prélever une seule colonie dans chaque assiette et la cultiver dans 3 mL de tampon Luria Bertani (LB) complété par l’antibiotique correspondant à 30 °C pendant la nuit, en agitant à 180 tr/min. Transférez 1 mL de la bactérie dans un erlenmeyer stérile de 250 mL contenant 50 mL de tampon LB complété par l’antibiotique correspondant. Agiter à 30 °C, 180 tr/min toute la nuit.
  3. Transférez les bactéries dans un tube conique de 50 ml et centrifugez pendant 20 minutes à 3 000 x g à température ambiante. Jeter le surnageant. Isolez le plasmide à l’aide d’un kit midiprep à faible teneur en endotoxines ou sans endotoxines, conformément aux instructions du fabricant.
    REMARQUE : Les RTI sont des structures instables. Pour prévenir les délétions ou les mutations de l’ITR, les cellules bactériennes doivent être cultivées à 30 °C pour ralentir la division cellulaire et atténuer les erreurs de réplication. Pour augmenter le rendement et la pureté des plasmides, un kit midiprep ou maxiprep est idéal. Il est recommandé d’utiliser un kit à faible teneur en endotoxines ou sans endotoxines pour réduire la contamination des cellules par les endotoxines en aval. Il n’est pas nécessaire d’isoler le plasmide à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire, car la contamination de la préparation plasmidique est peu probable si elle est effectuée sur un banc standard.

2. Clonage d’un gène d’intérêt dans un plasmide contenant de l’AAV ITR

  1. Ouvrez la carte plasmidique contenant le GOI dans un logiciel de visualisation de l’ADN.
    REMARQUE : La cassette complète, y compris les RTI, ne doit pas dépasser 4,9 Ko en raison des limites d’emballage physique de la capside. De plus, l’amplification par PCR ne peut pas être obtenue par ITR en raison de structures secondaires. En tant que tel, l’assemblage de Gibson n’est pas recommandé pour le clonage du transgène rAAV.
    1. Cliquez sur l’onglet Séquence pour afficher la séquence complète du plasmide. Faites défiler jusqu’à la région la plus éloignée de 5' de la séquence GOI et cliquez sur le premier nucléotide tout en faisant glisser vers l’intérieur vers le corps du gène pour créer une amorce vers l’avant. Relâcher une fois qu’une température de fusion (Tm) de ~55 °C a été atteinte.
    2. Cliquez sur Amorce vers l’avant. Incluez manuellement la séquence d’un site de restriction EcoRI (5' GAATTC 3') à l’extrémité la plus de 5' de la séquence d’amorce. De plus, ajoutez six bases aléatoires supplémentaires à l’extrémité 5 pi de ce site de restriction pour permettre à l’enzyme d’interagir efficacement avec l’ADN. Cliquez sur Ajouter une amorce. Reportez-vous à la figure 2 pour un exemple représentatif.
    3. Vérifiez l’apprêt pour vous assurer qu’il ne peut pas former d’épingles à cheveux ou de dimères d’apprêt (sauf pour le site de restriction qui est palindromique). Si des épingles à cheveux se forment, modifiez l’ordre aléatoire des six bases supplémentaires. De plus, assurez-vous que l’amorce ne se lie nulle part ailleurs sur le plasmide.
    4. Répétez les étapes pour créer une amorce inverse à la région la plus éloignée de 3 pieds du GOI vers l’intérieur du corps du gène. Cliquez sur Reverse Primer et incluez un site de restriction NotI (5' GCGGCCGC 3').
      REMARQUE : Le gouvernement de l’Inde ne peut pas contenir de sites de restriction EcoRI ou NotI – si c’est le cas, des enzymes de restriction différentes devront être utilisées.
  2. Amplifier le GOI dans une réaction PCR de 50 μL. Utilisez les composants individuels requis du tableau 1.
    1. Placez la réaction dans un thermocycleur et suivez les paramètres du cycle du tableau 2 pour la programmation. Si les amorces ont un T m différent, utilisez le Tm inférieur pour le programme.
    2. Vérifier l’amplification du fragment de PCR correct en ajoutant 1 μL de colorant de charge de gel (6x) à 5 μL de réaction PCR. Exécutez une échelle d’ADN et le mélange PCR sur un gel d’agarose à 0,8 % contenant du bromure d’éthidium et visualisez avec la lumière UV.
      ATTENTION : Le bromure d’éthidium est un mutagène connu.
    3. Si une seule bande spécifique apparaît sur le gel, purifiez le produit PCR restant dans le tube de la bandelette PCR à l’aide d’un kit de nettoyage PCR à colonne conformément aux instructions du fabricant. Si plusieurs bandes apparaissent (en raison d’une amplification non spécifique), exciser la bande souhaitée et purifier l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.
  3. Digérer le produit PCR purifié et le plasmide de squelette pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 dans une réaction de 50 μL avec les composants individuels requis du tableau 3 pendant 1 h à 37 °C. Une plus grande quantité d’ADN plasmidique pAAV est nécessaire en raison de la récupération inefficace attendue après l’extraction du gel.
    REMARQUE : Les enzymes de restriction utilisées sont des versions haute fidélité (HF). Regular NotI ne peut pas être utilisé avec le tampon CutSmart. Si différentes enzymes sont utilisées, une température d’incubation et un tampon différents peuvent être nécessaires.
    1. Purifiez le produit PCR digéré à l’aide d’un kit de nettoyage PCR sur colonne conformément aux instructions du fabricant.
    2. Préparer le plasmide de squelette pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 digéré pour l’électrophorèse sur gel en ajoutant 10 μL de colorant de charge de gel (6x) à 50 μL de réaction de digestion. Chargez une échelle d’ADN, une réaction de digestion et 250 ng de plasmide non digéré (témoin négatif) sur un gel d’agarose à 0,8 % contenant du bromure d’éthidium avec des puits à dents larges. Visualisez avec la lumière UV, excisez le fragment souhaité (~4,5 kb) et purifiez l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.
  4. Lier le produit PCR digéré et le plasmide digéré du squelette pAAV dans une réaction de ligature de 20 μL avec les composants individuels requis du tableau 4. Pour calculer la quantité de produits PCR nécessaires, utilisez la formule 1. En règle générale, utilisez un rapport molaire de 3 :1 entre le produit PCR (insert) et le squelette (pAAV), avec une masse de 50 ng de squelette.
    Equation 1Formule 1
  5. Effectuez un contrôle négatif en remplaçant le produit PCR par de l’eau. Incuber les réactions de ligature à 16 °C pendant la nuit ou à température ambiante pendant 2 h.
  6. Décongeler un flacon de cellules bactériennes compétentes et déficientes en recombinaison (comme les cellules Stbl3) sur de la glace et placer 50 μL dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 3 μL de la réaction de ligature directement sur les cellules et incuber sur de la glace pendant 30 min.
    REMARQUE : Les RTI sont des structures instables et nécessitent donc des souches bactériennes déficientes en recombinaison pour limiter les événements de délétion et de recombinaison des RTI. Les cellules DH5α peuvent être utilisées par intermittence pour la propagation (une ou deux fois) mais ne sont pas recommandées pour une utilisation à long terme. L’intégrité de l’ITR doit être vérifiée régulièrement après la purification midiprep.
    1. Secouez les bactéries dans un bain-marie à 42 °C pendant 30 s, puis transférez-les immédiatement sur de la glace pendant 2 minutes. Ajouter 200 μL de tampon LB et agiter pendant 1 h à 30 °C, 180 tr/min.
    2. Étalez 125 μL du mélange sur une plaque de gélose avec l’antibiotique correspondant et incubez toute la nuit (~18 h) à 30 °C. Prélevez plusieurs clones et placez-les chacun dans un tube de culture en plastique stérile contenant 3 ml de LB contenant l’antibiotique correspondant. Incuber toute la nuit en agitant à 30 °C, 180 tr/min.
      REMARQUE : Pour prévenir les délétions ou les mutations de l’ITR, les cellules bactériennes doivent être cultivées à 30 °C pour ralentir la division cellulaire et atténuer les erreurs de réplication. De plus, les colonies plus petites doivent être choisies, car celles qui n’ont pas de RTI peuvent avoir un avantage de croissance par rapport aux autres.
    3. Pipeter 1,8 mL de chaque culture dans un tube de 2 mL et centrifuger à 6 000 x g pendant 3 min, à température ambiante. Isolez l’ADN à l’aide d’un kit miniprep. Conservez les 1,2 mL de culture restants à 4 °C. Vérifier les clones corrects par séquençage de l’ADN ou digestion enzymatique de restriction diagnostique.
      REMARQUE : Le séquençage de l’insert par Sanger est recommandé, mais la processivité par le biais des RTI n’est pas réalisable par les méthodes standard. Les RTI doivent être vérifiés au moyen d’un résumé des restrictions, comme il est décrit ci-dessous.
    4. Ajouter 50 mL de tampon LB contenant l’antibiotique correspondant dans un erlenmeyer stérile de 250 mL. Ajouter 500 μL de la culture restante dans le ballon et agiter à 30 °C, 180 tr/min jusqu’à ce qu’on atteigne un OD600 de 0,2-0,5 (~18 h). Transvaser les bactéries dans un tube conique de 50 mL et centrifuger pendant 20 min à 3 000 x g, 4 °C. Isolez l’ADN à l’aide d’un kit de préparation midi faible ou sans endotoxines.
    5. Vérifiez l’intégrité de l’ITR avec 20 μL de digestion enzymatique de restriction diagnostique à l’aide de XmaI (ou SmaI). Préparez une réaction contenant 500 ng de plasmide, 0,5 μL d’enzyme et 1x tampon ; incuber pendant 1 h à 37 °C. Exécutez la réaction sur un gel d’agarose à 0,8 %. Si les RTI sont intacts, la digestion donnera une bande à ~2,9 kb et une autre bande de la taille de la cassette. Si cette bande distincte n’est pas observée, il se peut que l’ITR ne soit pas intact et que le clonage doive être refait.
      REMARQUE : Les plasmides contenant des sites de restriction XmaI (ou SmaI) (en plus de ceux dans les RTI) auront des bandes supplémentaires sur le gel.

Figure 2
Figure 2 : Exemple représentatif de la conception d’un apprêt. Conception d’amorce directe et inverse pour un transgène mScarlet (exemple représentatif). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Quantité Composant
X μL ADN du modèle (25 ng)
1 μL Apprêt F (10 μM)
1 μL Apprêt R (10 μM)
1 μL dNTP (10 mM)
10 μL Tampon de phusion (5x)
1 μL Phusion Polymérase
X μL Eau
50 μL Final Volume

Tableau 1 : Réactifs d’amplification PCR. Les composants nécessaires pour une réaction PCR réussie.

Pas Température Heure
Dénaturation initiale 98 °C 1 min (en anglais)
30 Cycles 98 °C 10 s
Tm d’apprêt 30 s
72 °C 30 s par Ko
Prolongation finale 72 °C 10 min (en anglais)
Tenir 4 °C indéfiniment

Tableau 2 : Programmation de l’amplification par PCR. Les paramètres de cycle requis pour une réaction PCR réussie.

Quantité Composant
X μL Produit PCR (1 μg) ou plasmide pAAV (3 μg)
5 μL Tampon (10x)
1 μL EcoRI-HF
1 μL NotI-HF
X μL Eau
50 μL Final Volume

Tableau 3 : Réactifs de digestion. Les composants nécessaires pour une réaction de digestion réussie.

Quantité Composant
X μL Insert (X ng)
X μL Colonne vertébrale (50 ng)
2 μL Tampon ADN Ligase T4 (10x)
1 μL ADN ligase T4
X μL Eau
20 μL Final Volume

Tableau 4 : Réactifs de ligature. Les composants nécessaires pour une réaction de ligature réussie.

3. Production vectorielle avec transfection de triple plasmide

NOTA : Les valeurs suivantes sont optimisées pour un seul puits d’une plaque à 6 puits qui donne un volume final de préparation de brut de 2 mL. Toutes les valeurs peuvent être augmentées de 10x pour une plaque de 15 cm qui donne un volume final de 20 mL ou réduites de 4x pour une plaque de 24 puits avec un volume final de 500 μL.

  1. Préparez un bouillon de 1 μg/μL de chlorhydrate de polyéthylénimine (PEI) MAX en dissolvant 100 mg de PEI MAX dans 100 mL d’eau distillée. Ajustez le pH à 7,1 avec du NaOH. Filtrer : stériliser le mélange à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et congeler 1 mL d’aliquotes à -20 °C pour un stockage à long terme. Une fois décongelé, conservez le réactif pendant 1 mois à 4 °C.
  2. Ensemencer 3 x 10 5 HEK293 ou HEK293T cellules dans une plaque à 6 puits avec du milieu d’aigle modifié de Dulbecco préchauffé (DMEM,4,5 g/L de glucose, 110 mg/L de pyruvate de sodium) complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS). Atteindre ~75 %-90 % de confluence dans un incubateur réglé à 37 °C et 5 % de CO2 (Figure 3).
    REMARQUE : On a observé que les cellules cultivées avec de la pénicilline/streptomycine (P/S) diminuaient le rendement de production de vecteurs. L’utilisation d’une technique stérile appropriée contourne la nécessité d’utiliser P/S, et il est donc recommandé de ne pas cultiver de cellules HEK293 avec l’antibiotique20. Si le P/S est requis dans les transductions en aval, il est recommandé d’ajouter le P/S à la préparation du brut après la récolte.
  3. Dans un tube de 2 mL, préparer un mélange contenant 1,3 μg de pAAV2/2 (Rep/Cap, sérotype 2), 1,3 μg de pAAV.GOI, 2,6 μg de pAdΔF6 et du DMEM sans sérum (SF) (4,5 g/L de glucose, 110 mg/L de pyruvate de sodium) en un volume total de 100 μL (voir le tableau supplémentaire 1 pour des calculs pratiques).
  4. Préparez un témoin négatif dans un tube séparé en remplaçant pRep/Cap par n’importe quel plasmide non apparenté. Le contrôle négatif tient compte de la présence d’un plasmide pAAV.GOI non emballé dans la préparation brute qui pourrait éventuellement transfecter les cellules pendant la transduction, bien que rare.
    REMARQUE : Le plasmide maxiprep ou midiprep à faible teneur en endotoxines ou sans endotoxines est idéal pour la triple transfection et produit généralement un vecteur de titre plus élevé que l’ADN miniprep, bien que l’ADN miniprep puisse être utilisé pour des tests préliminaires rapides et sales.
  5. Ajouter 5,2 μL de PEI MAX au mélange plasmidique ; il s’agit d’un mélange plasmide :PEI avec un rapport de 1 :1. Bien mélanger en pulsant 10 à 15 fois sur un mélangeur vortex réglé sur 7. Si plusieurs préparations vectorielles sont produites, ajouter du PEI à chaque mélange plasmidique à des intervalles de temps échelonnés de 1 min (c.-à-d. préparation 1 à t = 0 min, préparation 2 à t = 1 min, etc.) pour permettre un temps suffisant pour aspirer les puits et diluer la réaction dans les étapes suivantes.
    REMARQUE : Un rapport plasmide/PEI de 1 :1 s’est avéré optimal. Cependant, les utilisateurs individuels peuvent optimiser ce ratio pour une efficacité maximale. Reportez-vous à la discussion pour savoir comment effectuer l’optimisation de l’IPE (voir également le tableau supplémentaire 2).
  6. Incuber chaque tube pendant exactement 15 minutes, puis diluer la réaction avec 1,9 mL de SF DMEM (4,5 g/L de glucose, 110 mg/L de pyruvate de sodium) pour un volume final de 2 mL. Pipeter doucement 2x pour mélanger. Un mélange excessif perturbera les complexes plasmide/PEI et entraînera une efficacité de transfection plus faible.
  7. Aspirer le milieu du puits et ajouter doucement le mélange plasmide/PEI sur les côtés du puits pour éviter le décollement cellulaire. Incuber les cellules pendant 72 h à 37 °C et 5 % de CO2. La lyse et le détachement cellulaire pendant l’incubation sont un processus normal de production de rAAV (Figure 4).

Figure 3
Figure 3 : Cellules HEK293 prêtes pour la transfection. La confluence idéale (75%-90%) des cellules HEK293 nécessaires à la transfection de trois plasmides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Cellules HEK293 après transfection. L’apparition de cellules HEK293 avant et après 1, 2 ou 3 jours après la transfection avec pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 et un rapport plasmide :PEI de 1 :1. Barres d’échelle : 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Récolte des préparations vectorielles brutes

  1. Congeler l’ensemble de la plaque de cellules transfectées pendant 30 min à -80 °C, suivi d’une décongélation pendant 30 min à 37 °C. Répétez l’opération pour un total de trois cycles de congélation/décongélation. Ne retirez pas le couvercle, l’assiette doit rester stérile à l’intérieur. Les plaques peuvent rester à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à passer aux étapes suivantes.
    REMARQUE : Un incubateur non humidifié fonctionne mieux pour la décongélation, ce qui minimise la condensation à l’extérieur des plaques qui peut entraîner une contamination accidentelle.
  2. Effectuez les deux étapes suivantes dans une hotte à flux laminaire à l’aide de techniques aseptiques. Mélangez chaque puits par pipetage pour assurer une perturbation maximale des cellules. Transférer le lysat dans un tube de 2 mL et centrifuger pendant 15 minutes à 15 000 x g, à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires.
  3. Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube de 2 mL. Cette préparation brute peut être utilisée immédiatement sans titrage ni purification. Vector peut être conservé à 4 °C pendant plusieurs mois ou à -20 °C pendant des années.
    REMARQUE : Si nécessaire, les titres peuvent être calculés par PCR quantitative (qPCR) en quantifiant le nombre de génomes vectoriels (VG) à l’intérieur des particules résistantes à la DNase. En tant que tels, les titres sont donnés en unités VG/mL. Le vecteur stocké pendant plusieurs mois à 4 °C doit être retitré avant utilisation, car le vecteur peut agréger et/ou lier les parois du tube, réduisant ainsi le titre de la préparation.

5. La transduction

  1. Plaquez le type de cellule souhaité (par exemple, Huh7) dans une plaque à 96 puits à une confluence cible de 50 % à 75 %, en fonction de la durée de la transduction. Une plus grande confluence peut entraîner une réduction de l’efficacité de la transduction de l’AAV.
  2. Ajouter un vecteur (p. ex., CMV.mScarlet) à des cellules sans connaître le titre de la préparation brute pour les applications où la dose n’est pas pertinente, comme l’essai de transduction d’un panel de capsides dans un nouveau type de cellule. Effectuer une série de dilution 1 :3 de la préparation brute dans un milieu sans sérum (SF) pour obtenir la quantité optimale de vecteur requise pour l’application. Aspirer le milieu à partir d’une plaque à 96 puits et ajouter 50 à 100 μL de préparation de brut dilué dans les puits. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2.
    REMARQUE : Le sérum peut contenir des anticorps qui peuvent neutraliser le vecteur AAV et réduire l’efficacité de la transduction. Cependant, le sérum peut être utilisé pendant la transduction pour les types de cellules sensibles.
  3. Retirer le vecteur après 48 h après la transduction (hpt) et laver les cellules une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée. Les vecteurs peuvent également être retirés et remplacés par des milieux contenant du sérum dès 2 hpt pour les types de cellules sensibles. Pour de nombreuses applications, effectuez une incubation de nuit pour transduire les cellules et remplacez les puits par des milieux frais contenant du sérum le matin. Les types de cellules robustes, tels que Huh7 et U2-OS, ne nécessitent pas de changement de support.
  4. Terminez la transduction en fixant les cellules dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 10 min. Différentes méthodes de terminaison peuvent également être utilisées en fonction de l’application (par exemple, lyse). Pour la plupart des types de cellules, l’expression maximale se produit par 48 hpt et constitue donc un critère d’évaluation expérimental commun.

6. Variations de la méthode de transduction par type de cellule

REMARQUE : Différents types de cellules nécessitent des conditions de culture différentes. Par conséquent, l’ajout de vecteur pour la transduction doit être optimisé en fonction des besoins du type de cellule. Vous trouverez ci-dessous des protocoles de transduction très spécifiques pour les types de cellules inclus dans les résultats représentatifs, illustrant certaines variantes de protocoles de transduction qu’un chercheur peut souhaiter essayer pour ses propres besoins.

  1. Organoïdes de l’intestin grêle de souris
    1. Dériver des organoïdes de l’intestin grêle (mSIO) de souris à partir d’une préparation de crypte de l’intestin grêle à partir de souris C57BL/6J. Incorporer les organoïdes dans une matrice membranaire basale à 90 % et les mettre en culture dans des plaques à 24 puits contenant soit un milieu de croissance organoïde (sans antibiotiques), soit un milieu de pré-transduction (milieu conditionné à 50 % par Wnt3a [produit en interne à l’aide de cellules L Wnt-3A dans un milieu de croissance organoïde], 10 mM de nicotinamide, 10 μM d’inhibiteur de ROCK et 2,5 μM CHIR99021) pendant un passage (5 à 7 jours) avant la transduction à 37 °C et 5 % de CO2.
    2. Avant la transduction, rincer les organoïdes avec du D-PBS, perturber les dômes de la matrice de la membrane basale par pipetage et dissocier les organoïdes en petits amas de cellules en les incubant dans un milieu de dissociation pendant 10 min à 37 °C et en les pipetant davantage.
    3. Arrêtez le processus de dissociation cellulaire en ajoutant 5 % de FBS dans DMEM/F-12 avec 15 mM HEPES, transférez les grappes de cellules dans des tubes à centrifuger et collectez les grappes de cellules par centrifugation pendant 5 min à 1000 x g, à température ambiante.
    4. Remettre en suspension les amas cellulaires dans un milieu de transduction (milieu de pré-transduction contenant 10 μg/mL de polybrène ou milieu de croissance organoïde contenant 10 μg/mL de polybrène) et les transférer dans des plaques à 48 puits, suivi de l’ajout de préparations brutes AAV conditionnant CMV.mScarlet pour la transduction.
    5. Effectuer la transduction des organoïdes en centrifugeant la plaque pendant 1 h à 600 x g et 37 °C, puis incuber à 37 °C pendant 6 h supplémentaires. Recueillir les organoïdes transduits dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL, centrifuger pendant 5 min à 1000 x g, à température ambiante, et mettre sur de la glace.
    6. Après l’élimination du surnageant, remettre en suspension les organoïdes transduits dans une matrice membranaire basale à 90 % dans un milieu de pré-transduction ou un milieu de croissance organoïde et des gouttelettes de graines de 20 μL dans un puits d’un verre de protection à chambre préchauffé.
    7. Après une incubation de 10 min dans l’incubateur, introduire la gouttelette dans 350 μL de milieu de pré-transduction ou de milieu de culture organoïde et incuber à 37 °C dans l’incubateur. Déterminer l’efficacité de la transduction 2 à 5 jours après la transduction en imageant les organoïdes transduits au microscope confocal et estimer le pourcentage de globules fluorescents rouges par organoïde.
  2. Cellules BeWo
    1. À 24 h avant la transduction, plaquer les cellules BeWo du choriocarcinome placentaire humain à 10 000 cellules par puits de plaque à 96 puits. Diluer les préparations brutes AAV conditionnées CMV.mScarlet à 1 :1 dans un milieu F12-K BeWo sans sérum jusqu’à un volume total de 50 μL par puits. Aspirer le milieu du puits et le remplacer par 50 μL d’AAV dilué par puits.
    2. Incuber les cellules à 37 °C pendant la nuit (~18 h), puis ajouter 100 μL de milieu F12-K BeWo contenant 10 % de FBS pour porter le volume total à 150 μL. Incuber les cellules pendant 6 h supplémentaires pour un total de 24 h après la transduction (hpt).
    3. Pour l’imagerie, colorez les cellules vivantes avec le colorant Hoechst pendant 30 minutes dans un milieu F12-K, puis remplacez le milieu par du DMEM sans phénol contenant 10 % de FBS, 1 supplément de glutamax et 1 supplément de pyruvate de sodium pour l’imagerie. Effectuez l’imagerie de cellules vivantes sur un microscope confocal à l’aide de jeux de filtres DAPI (pour l’imagerie de Hoechst) et mCherry (pour l’imagerie mScarlet) avec 37 °C et 5 % de CO2.
  3. Cellules Hepa1-6 et Huh7
    1. Plaquer des cellules hépatiques murines Hepa1-6 et des cellules hépatiques humaines Huh7 dans du DMEM (4,5 g/L de glucose, 110 mg/L de pyruvate de sodium, 10 % de FBS) à 5 000 cellules par puits d’une plaque de 96 puits 24 h avant la transduction.
    2. Ajouter 50 μL de préparations AAV brutes non diluées conditionnant CMV.mScarlet directement dans les cellules et incuber à 37 °C pendant 48 h. Lavez les cellules une fois dans le PBS, fixez-les avec 4 % de PFA et teignez avec le colorant Hoechst pendant 10 minutes. Effectuez des travaux d’imagerie au microscope confocal à l’aide des ensembles de filtres DAPI (pour l’imagerie de Hoechst) et mCherry (pour l’imagerie mScarlet).
  4. Cellules C2C12 et HSkMC
    1. Plaquer des myoblastes murins indifférenciés C2C12 et des myoblastes indifférenciés de cellules musculaires squelettiques primaires humaines (HSkMC) à raison de 5 000 cellules par puits d’une plaque à 96 puits, 72 h avant la transduction.
    2. Diluer les préparations brutes d’AAV conditionnées CMV.mScarlet à 1 :1 dans du DMEM (4,5 g/L de glucose, Penn/Streptic, 20 % de FBS) pour les myoblastes C2C12 ou un milieu de croissance des muscles squelettiques pour les myoblastes HSkMC. Différencier les myoblastes HSkMC en myotubes en changeant le milieu en milieu de différenciation.
    3. Incuber les myoblastes et les myotubes dans des préparations d’AAV diluées pendant 24 h à 37 °C. Colorer des cellules vivantes avec le colorant Hoechst pendant 10 min et les imager au microscope confocal à l’aide des ensembles de filtres DAPI (pour l’imagerie Hoechst) et mCherry (pour l’imagerie mScarlet).

Representative Results

Trouver la capside optimale pour la transduction des cellules d’intérêt cultivées
Divers types de cellules ont été transduits pour déterminer le tropisme de divers sérotypes de capside (Figure 5). Les sérotypes naturels AAV2 14, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV924 et les variantes de capside modifiées Anc80 25, DJ 26, LK0327 etKP1 28 ont été emballés avec un génome vecteur exprimant mScarlet sous un promoteur CMV, cloné à l’aide des méthodes fournies dans ce protocole. Des préparations vectorielles brutes non titrées ont été diluées dans les milieux de culture appropriés et les cellules ont été transduites pendant 24+ h et imagées (Figure 5B). L’efficacité de la transduction a été calculée par la proportion de cellules totales qui étaient mScarlet+, ou la proportion de cellules dans un seul plan z qui étaient mScarlet+ (pour les organoïdes de l’intestin grêle de souris ; Graphique 5C). L’efficacité de la transduction (cellules mScarlet+) n’est pas fournie pour les myotubes C2C12 et HSkMC différenciés, mais plutôt pour les myoblastes C2C12 et HSkMC indifférenciés (Figure 5A).

AAV2 et KP1 étaient les sérotypes les plus puissants parmi les lignées cellulaires testées (Figure 5A). Il a également été observé que des types de cellules similaires provenant d’espèces différentes sont transduits à des efficacités variables. Par exemple, Hepa1-6 (une lignée de cellules hépatiques dérivées de murines) présente une diminution marquée de la transduction par rapport à Huh7 (une lignée de cellules hépatiques d’origine humaine) lors de l’utilisation d’AAV2 (Figure 5B). De plus, les différentes conditions du milieu jouent un rôle important lors de la transduction. Les organoïdes de l’intestin grêle (mSIO) de souris cultivés dans un milieu de pré-transduction sont moins efficaces que ceux cultivés dans un milieu de croissance organoïde (Figure 5C). De plus, AAV2 transduit efficacement les myoblastes HSkMC indifférenciés et les myotubes HSkMC différenciés (Figure 5B), bien que l’analyse quantitative des myotubes soit difficile et ne soit donc pas fournie.

Les rendements de transduction élevés observés pour divers types de cellules dans la figure 5 montrent que les préparations de vecteurs bruts peuvent être utilisées efficacement pour transduire une variété de types de cellules sans autres étapes telles que la purification et le titrage. Cependant, une attention particulière doit être accordée lors du choix d’une capside pour maximiser l’administration du transgène. De nombreuses autres lignées cellulaires et capsides ont déjà été testées et sont publiées, mais avec des préparations de vecteurs purifiés12.

Un effet indépendant des particules vectorielles des conditions du milieu peut affecter l’efficacité de la transduction. Cependant, il est généralement admis que le tropisme (c’est-à-dire l’absorption et l’expression du vecteur spécifiques au type cellulaire) est une propriété spécifique de la capside29. Il n’a pas encore été observé qu’une comparaison entre les préparations brutes et les préparations purifiées à doses appariées affecte le tropisme cellulaire. Par conséquent, les préparations de vecteurs bruts peuvent être utilisées de la même manière que les vecteurs purifiés en culture cellulaire.

Figure 5
Figure 5 : Transduction vectorielle brute de différents types de cellules. (A) Pourcentage de mScarlet+ après l’ajout de divers vecteurs AAV contenant un transgène mScarlet. (B) Cellules exprimant mScarlet délivrées par le sérotype 2 de l’AAV. Barres d’échelle : 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 et HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Abréviations : hpt = heures après la transduction. (C) Les organoïdes de l’intestin grêle (mSIO) de souris ont été traités soit par rAAV dans des milieux de pré-transduction, soit dans des milieux de croissance d’organoïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Feuille de travail sur la transfection de trois plasmides. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Feuille de travail sur l’optimisation de l’Île-du-Prince-Édouard. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Clonage
Le protocole de clonage n’est pas limité au plasmide pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 utilisé ci-dessus et peut être facilement modifié en fonction des besoins expérimentaux d’un chercheur. De nombreux plasmides contenant de l’ITR sont facilement disponibles à l’achat en ligne. Par exemple, des plasmides contenant à la fois Cas9 et un site de clonage d’ARNsg sont disponibles, mais nécessitent peu d’étapes supplémentaires telles que le recuit des oligonucléotides et le traitement PNK30. De plus, des plasmides contenant un site de clonage multiple (MCS) avec uniquement des ITR et aucun élément de régulation interne peuvent être trouvés31. Si différents plasmides doivent être utilisés, les enzymes de restriction (ER) utilisées pour la digestion sont généralement les seuls éléments qui peuvent avoir besoin d’être modifiés dans ce protocole. Cependant, l’une des limites du rAAV est sa capacité de chargement limitée. En raison des limitations physiques de la capside, le génome du vecteur ne doit pas dépasser 4,9 kb, y compris les ITR.

Lors de l’isolement d’un plasmide à partir de bactéries, il est essentiel d’utiliser un kit midiprep ou maxiprep à faible teneur en endotoxines ou sans endotoxines pour atténuer les dommages causés aux cellules lors de la transfection ou de la transduction de trois plasmides. Les plasmides des kits de mini-préparation contiennent souvent des impuretés plus élevées, des concentrations réduites et moins d’ADN superenroulé, ce qui peut affecter la production en aval de rAAV et n’est donc pas recommandé.

Il est essentiel de comprendre la structure et les propriétés des RTI pendant le clonage. Premièrement, il est extrêmement difficile d’utiliser la PCR dans le cadre de l’ITR. Les modèles de clonage qui nécessitent une amplification par PCR par ITR doivent être évités et limiter en outre l’utilisation de la technique de clonage d’assemblage Gibson. En tant que tel, le clonage enzymatique de restriction est la méthode préférée pour le clonage dans des plasmides contenant de l’ITR. De plus, certaines amorces pour le séquençage de Sanger peuvent ne pas être compatibles si la région séquencée contient l’ITR. Au lieu de cela, il est recommandé d’utiliser des amorces qui s’éloignent des ITR et pénètrent dans le corps du génome du vecteur pour obtenir des résultats de séquençage plus précis. Deuxièmement, les ITR sont sujets à des délétions et des réarrangements et des mutations lorsqu’ils sont transformés en bactéries pour l’amplification plasmidique32,33. Pour atténuer ces événements, il est recommandé d’utiliser des souches bactériennes compétentes déficientes en recombinaison, telles que Stbl3, et de les incuber à 30 °C pour ralentir les divisions cellulaires. Enfin, il a été observé que des colonies plus petites peuvent correspondre à des clones sans réarrangements ni délétions de plus petite taille, car celles qui n’ont pas d’ITR peuvent conférer un avantage de croissance et être plus grandes. Par conséquent, il est recommandé de choisir des colonies petites.

Production vectorielle
La production réussie du vecteur rAAV peut être affectée par plusieurs éléments. Un facteur critique est la santé des cellules HEK293 ou 293T utilisées pour la transfection. En général, un faible nombre de passages est idéal, car les cellules fortement traversées peuvent présenter des variances génotypiques et phénotypiques qui peuvent réduire les titres de rAAV. De plus, la densité des cellules ensemencées doit être de 75 % à 90 % de confluence pour une production efficace. Les cellules clairsemées génèrent de faibles rendements vectoriels car il y a moins de cellules disponibles pour produire des vecteurs, tandis que les cellules envahies par la végétation ne seront pas transfectées efficacement.

Les variations entre les lots de réactifs, les stocks cellulaires et la variabilité générale d’un laboratoire à l’autre contribuent aux différences dans l’efficacité de la transfection et le titre de production. Un facteur optimisable qui peut conduire à des améliorations du titre est le rapport plasmide/PEI dans les réactions de transfection. Il est essentiel d’utiliser du PEI MAX frais (<1 mois). Il est recommandé d’utiliser un rapport plasmide :PEI de 1 :1 comme point de départ, et si l’efficacité de la transfection ou de la transduction semble médiocre, tester plusieurs rapports différents. L’optimisation du titre est plus facile si l’on utilise un transgène avec une lecture visuelle, tel que le trangene rapporteur CMV.Luc.IRES.EGFP utilisé ici comme matériau de départ pour le clonage. Pour effectuer l’optimisation, suivez l’étape 3 du protocole en utilisant une plaque à 12 puits et en réduisant par deux les masses de plasmides et les volumes de réactifs (la masse finale du plasmide est de 2,6 μg). Ajustez le volume de l’IPE en conséquence pour qu’il corresponde à des rapports allant de 1 :0,75 à 1 :3, avec des incréments croissants de 0,25 (Figure 6). Diluer chaque réaction avec 950 μL de média SF après 15 min. Pour plus de commodité, il est possible de préparer un mélange maître contenant les plasmides triples et de les pipeter individuellement dans des tubes de 1,5 ml avant d’ajouter l’Île-du-Prince-Édouard (voir le fichier supplémentaire 2). Récoltez le vecteur, transduisez les cellules d’intérêt et imagez. Le puits ayant l’efficacité de transduction la plus élevée (proportion de cellules GFP+) correspond au titre le plus élevé et au rapport PEI :ADN le plus optimal.

Figure 6
Figure 6 : Flux de travail d’optimisation de l’Île-du-Prince-Édouard. Schéma des étapes nécessaires à l’optimisation de l’Île-du-Prince-Édouard. Plusieurs rapports plasmide/PEI sont testés pour déterminer le rapport optimal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Considérations relatives à la récolte et au titre
La technique de congélation/décongélation utilisée pour récolter le vecteur rAAV lyse efficacement les cellules HEK293 d’une manière compatible avec l’utilisation directe du lysat clarifié pour transduire les cellules cultivées. Certains sérotypes de rAAV, tels que AAV1, AAV8 et AAV9, sont libérés par les cellules lors de la production de vecteurs et peuvent être récoltés à partir du milieu cellulaire cultivé sans cycles de congélation/décongélation34. La méthode décrite ici donne généralement des titres de l’ordre de 1 x 1010 VG/mL lors de l’utilisation de capsides AAV2, et de 1 x10 11 VG/mL pour AAV8. Bien que des titres plus élevés puissent être obtenus par lyse à base de détergent ou d’autres produits chimiques, ceux-ci sont nocifs pour les cellules en utilisation en aval et nécessitent que les rAAV soient purifiés davantage à partir du lysat. Un titre plus faible est un compromis qu’un chercheur doit prendre en compte pour déterminer si les préparations brutes sont appropriées à ses besoins de recherche, cependant, les titres légèrement inférieurs produits par les méthodes décrites ici peuvent très bien transduir de nombreux types de cellules (voir les résultats représentatifs). En plus de l’efficacité de la transfection et de la santé cellulaire, les titres de vecteur varient en fonction de la capside utilisée lors de la production de rAAV et de la taille et de la séquence du transgène dans le VG35.

Lors de la récolte de préparations de vecteurs bruts, l’ADN plasmidique utilisé lors de la transfection de trois plasmides peut être présent et, bien que rare, entraîner une transfection en aval pendant la transduction. De plus, les VG non emballés peuvent se lier à l’extérieur des capsides et invoquer une réponse immunitaire innée à l’ADN simple brin nu et étranger36,37. Par conséquent, les types de cellules sensibles peuvent nécessiter que les préparations de vecteurs soient digérées et purifiées par la DNase pour éliminer les VG et les plasmides non emballés.

Si l’on souhaite calculer le titre d’une préparation brute, la qPCR peut être réalisée pour quantifier le nombre de VG conditionnés à l’intérieur des particules résistantes à la DNase (DRP). En bref, une petite quantité de préparation brute est digérée par la DNase pour éliminer l’ADN plasmidique, les acides nucléiques contaminants ou le VG partiellement emballé. L’échantillon est ensuite soumis à la qPCR et la VG protégée à l’intérieur des PRD est quantifiée, ce qui donne un titre avec des unités de génome vecteur par mL de préparation brute38. Il n’est pas recommandé d’effectuer un titrage vectoriel à l’aide de tests ELISA qui quantifient les titres de capside. Par rapport au virus AAV de type sauvage, le rAAV souffre d’une proportion de capsides vides et partiellement emballées39. Le test ELISA va quantifier toutes les capsides quel que soit leur contenu génomique et va surestimer les unités transductibles présentes dans une préparation, qui nécessite un VG conditionné.

Considérations relatives à la transduction
De nombreux facteurs influencent les transductions de rAAV et des considérations appropriées doivent être prises en compte pour toute nouvelle expérience. Selon le promoteur à l’origine de l’expression du transgène, l’expression peut se produire dès 4 h après la transduction (hpt), et le pic d’expression est généralement atteint à 48 hpt. Il est important de garder à l’esprit le temps écoulé entre l’ensemencement initial des cellules et le point final expérimental. Il s’agit d’estimer la confluence initiale des cellules et de s’assurer qu’elles ne prolifèrent pas à la fin de l’expérience. Si les cellules deviennent trop confluentes, le comportement cellulaire peut être modifié en raison d’une réponse au stress et peut fausser les résultats expérimentaux. Certains types de cellules, comme U2-OS, peuvent assez bien tolérer la prolifération / l’inhibition du contact. De plus, ils peuvent résister à de longues périodes (48 h+) dans un milieu conditionné sans sérum, produit de ce protocole de production. Cependant, les types de cellules sensibles peuvent nécessiter l’ajout ou la dilution de sérum de la préparation brute avec un milieu de croissance spécial pour maintenir la santé pendant la transduction. Une efficacité de transduction légèrement réduite par l’utilisation de milieux contenant du sérum est un compromis potentiel pour la santé cellulaire et devrait être prise en compte par le chercheur.

En règle générale, pour les cellules à division rapide, une confluence de départ d’environ 50 % est optimale pour les applications qui se termineront à 48 ch. Cependant, la confluence peut être ajustée en conséquence en fonction des besoins de l’expérience. Il n’est pas recommandé de transduire des lignées cellulaires immortalisées de type monocouche au-delà de 75 % de confluence en raison de la diminution de l’efficacité de la transduction. La plupart des types de cellules cultivées sont transduits avec succès et sains après une nuit d’incubation avec des préparations brutes de rAAV, suivies d’un changement vers un milieu frais contenant du sérum le matin.

Le sérotype de capside est un facteur important à prendre en compte lors de la production de rAAV pour la transduction d’une cellule cible, car la capside est le principal déterminant du tropisme cellulaire et de l’expression subséquente du transgène13. AAV2 est un sérotype largement utilisé en raison de sa capacité à transduire efficacement de nombreux types de cellules cultivées12. Cette propriété de l’AAV2 peut être attribuée au fait que les protéoglycanes sulfate d’héparine (HSPG) servent de principal facteur d’attachement à l’AAV2 et aux niveaux élevés de HSPG sur les cellules en culture de l’adaptation à la croissance dans une boîte40. D’autres capsides, telles que AAV9, sont moins efficaces pour transduire de grands types de cellules et peuvent s’expliquer par leurs facteurs d’attachement de dépendance qui ne sont pas exprimés dans ce contexte41. Par conséquent, nous recommandons AAV2 comme capside de premier choix dans les cellules en culture si une cellule cible souhaitée n’a pas déjà été testée avec le rAAV dans la littérature.

Veuillez noter que l’une des principales limites des préparations vectorielles brutes est qu’elles ne sont pas appropriées pour la transduction de modèles animaux. Les études in vivo nécessitent que les préparations soient purifiées et soumises à une évaluation de la qualité.

Considérations relatives à l’expression des transgènes et à leur intégration potentielle
Les rAAV n’entraînent pas de manière fiable une expression permanente du transgène. Au fil du temps, les VG peuvent être réduits au silence et l’expression transgénique peut être arrêtée après plusieurs passages42. De plus, la majorité des VG restent épisomiques et les rAAV ne contiennent pas les protéines virales Rep qui médieraient une intégration fréquente dans le génome de l’hôte comme dans une infection lysogénique virale de type sauvage ou favoriseraient la réplication des VGs43. En conséquence, les épisomes dans les cellules transduites finiront par être dilués entre les cellules filles par divisions.

L’intégration au niveau basal est possible pour tout le matériel d’ADN transgénique livré. Cependant, les VG contenant de l’ITR sont susceptibles d’être intégrés à une fréquence plus élevée44. Par conséquent, l’expression permanente d’un transgène peut être observée dans un petit sous-ensemble de cellules. Les utilisateurs doivent envisager cette possibilité, en particulier lorsqu’ils utilisent le rAAV pour délivrer des enzymes de coupe de l’ADN, telles que Cas9, car les cassures double brin peuvent entraîner une fréquence d’intégration et d’expression permanente encore plus élevée45. Bien que cela fasse de rAAV un bon candidat pour fournir des modèles de réparation dirigés par homologie pour le marquage endogène ou l’ajout de gènes, la possibilité d’insertion de Cas9 doit être considérée19,46.

Disclosures

A.C.M. est consultant pour Janssen Pharmaceuticals et siège au SAB de NewBiologix. Tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Nous remercions Robert Tjian et Xavier Darzacq pour leur soutien et l’utilisation du matériel de laboratoire. Nous remercions Mark Kay pour son don des plasmides rep/cap KP1 et LK03, et Luk Vandenberghe pour le plasmide rep/cap AAV4. Le financement a été fourni par le Howard Hughes Medical Institute (34430, R. T.) et le California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. N.W. remercie le Berkeley Stem Cell Center par le biais d’une bourse postdoctorale Siebel et par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) par le biais d’une bourse Walter Benjamin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Snapgene DNA viewing sofrware Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 AddGene 105533
pAAV2/2 (Rep/Cap) AddGene 104963
pAdΔF6 AddGene 112867
LB Agar Carbenicillin Sigma-Aldrich L0418
Boekel Scientific Economy Digital Incubator Boekel Scientific 133000
LB medium, powder MP Biomedicals 113002042
Carbencillin (Disodium) GoldBio C-103-5
New Brunswick I26 Shaker Eppendorf M1324-0000
50 mL Centrifuge Tubes Corning 430828
Centrifuge 5810 R Eppendorf 22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit Qiagen 12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS USA Scientific 1402-3900
Mastercycler nexus Eppendorf 6333000022
dNTP Thermo Fisher Scientific 18427013
5x Phusion Buffer NEB B0518S Provided with purchase of Phusion Polymerase
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
Gel Loading Dye, Orange (6X) NEB B7022S
DNA Clean & Concentrator-100 Zymo D4029
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit Zymo D4001
NotI-HF NEB R3189S
EcoRI-HF NEB R3101S
CutSmart Buffer (10x) NEB B6004S Provided with purchase of restriction enzyme
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500100
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E1510
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with purchase of T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) Eppendorf 22363204
Precision Microprocessor Water Bath Thermo Scientific 51221046
Sterile Plastic Culture Tubes Fisher Scientific 149566B
2.0 mL Microcentrifuge Tube Thomas Scientific 1149Y01
ZR Plasmid Miniprep - Classic Zymo D4015
Xma1 NEB R0180S
Sma1 NEB R0141S
HEK 293T cells ATCC CRL-3216
Falcon 6-well Corning 353046
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate Thermo-Fisher 11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator Marshall Scientific MCO-18AIC
PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) Polysciences 24765-100
Mixer Vortex Genie 2 Electron Microscopy Sciences 102091-234
Sanyo Ultra Low Freezer Sanyo 14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 with transparent window VWR 390-0384
Eppendorf Microcentrifuges Eppendorf 05-400-005
Falcon 96-well Corning 353072
C57BL/6J mice JAX strain #000664
organoid growth medium STEMCELL Technologies 6005
L Wnt-3A cells ATCC CRL-2647
nicotinamide Sigma N0636-100G
ROCK inhibitor STEMCELL Technologies 72302
CHIR99021 STEMCELL Technologies 72052
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Fisher 356231
24-well plate Fisher 08-772-1
D-PBS Thermo Fisher Scientific 14-190-250
TrypLE Express Fisher 12604013
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES STEMCELL Technologies 36254
polybrene Millipore Sigma TR-1003-G
48-well plates Fisher 08-772-3D
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Fisher 12-565-470
BeWo cells ATCC CCL-98
F-12K Medium ATCC 30-2004
Hepa1-6 ATCC CRL-1830
Huh7 UC Berkeley BSD Cell Culture Facility HUH-7
C2C12 ATCC CRL-1772
HSkMC ATCC PCS-950-010
Skeletal Muscle Cell Growth Medium Sigma C-23060
Skeletal Muscle Differentiation Medium Sigma C-23061
Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope Fisher Scientific 12-563-340
Perkin Elmer Opera Phenix Perkin Elmer HH14001000
PhenoPlate 96-well Perkin Elmer 6055302
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Thermo-Fisher 31053028
GlutaMAX Supplement Thermo-Fisher 35050079
Sodium Pyruvate Thermo-Fisher 11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap) Addgene 104964
pAAV2/8 (Rep/Cap) Addgene 112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) Addgene 130878
pAAV2/9n (Rep/Cap) Addgene 112865
pAnc80L65AAP Addgene 92307
KP1 (rep/cap) gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
LK03 (rep/cap) gifted by Professor Mark Kay (Stanford University)
pAAV4 (rep/cap) gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNA Addgene 61591
pAAV.MCS Addgene 46954
gBlock (synthetic DNA fragement) IDT

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References

  1. Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456 (2016).
  2. Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
  3. Lundstrom, K. Viral Vectors in Gene Therapy. Diseases. 6 (2), 42 (2018).
  4. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
  5. Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175 (2015).
  6. Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
  7. Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
  8. Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
  9. Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
  10. Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
  11. Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2021).
  12. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
  13. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  14. Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles. Science. 149 (3685), 754-756 (1965).
  15. Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662 (2020).
  16. Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
  17. Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871 (2021).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
  20. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).
  21. Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
  22. Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
  23. Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
  24. Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  27. Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
  28. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610 (2019).
  29. Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85 (2021).
  30. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  31. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
  32. Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
  33. Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
  34. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  35. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
  36. Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
  37. Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
  38. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
  39. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  40. Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
  41. Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
  42. McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
  43. Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
  44. Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
  45. Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439 (2019).
  46. Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 200
Expression de transgènes dans des cellules en culture à l’aide de vecteurs viraux adéno-associés recombinants non purifiés
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Benyamini, B., Esbin, M. N.,More

Benyamini, B., Esbin, M. N., Whitney, O., Walther, N., Maurer, A. C. Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors. J. Vis. Exp. (200), e65572, doi:10.3791/65572 (2023).

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